Name: analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

우리는 Sebastián Valenzuela 박사와 Micaela Ricca 박사가 동물 시설에서 귀중한 수의학 지원을 해준 것에 감사드립니다. 이 연구는 "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (to Fundación Ciencia & Vida), Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012의 지원을 받았다. 이 작품은 또한 "Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)"및 MJFF-10332.01 (R.P.) 및 MJFF-17303 (F.C.)의 FONDECYT-1210013 (R.P.) 및 MJFF-17303 (F.C.)을 파킨슨 연구 재단의 보조금으로 지원했습니다.

저자들은 연구가 재정적 또는 비 재정적 경쟁 이익이없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.

여기에서 분석 된 신경 변성의 마우스 모델은 αSyn 병리학 및 미세 아교 활성화에 관련된 메커니즘, 신경 염증의 조절에 말초 면역 체계의 관여 및 신경 변성의 메커니즘을 포함하여 파킨슨 병의 병리 생리학과 관련된 많은 중요한 측면을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. αSyn 병리학에 관여하는 메카니즘 중에는SN2의 도파민성 뉴런에서 αSyn의 과도한 부하가 존재하는 미토콘드리아, 리소말, 또는 프로테아좀 기능장애와 관련된 세포내 기전이 있다. AAV 매개된 형질도입에 의해 유도된 hαSyn 발현 이외에도, 내인성 마우스 αSyn이 또한 총 αSyn 발현의 부하에 기여한다는 것을 고려하는 것이 중요하다. αSyn을 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 hαSyn32의 과발현에 기초한 이들 마우스 모델에 유사한 시누클레인 병리학, 신경병리학 및 운동 장애를 개발한다. 미세아교세포 활성화와 관련하여, 본 마우스 모델은 사이토카인, 신경전달물질, 성상세포, 뉴런, 혈액-뇌 장벽 및 T 세포와 같은 상이한 분자 및 세포 플레이어가 전염증성 또는 항염증 기능적 표현형의 획득을 어떻게 조절할 수 있는지를 연구하는데 사용될 수 있다 8,10,11 . 이 모델은 또한 T 세포뿐만 아니라 대식세포, 단핵구 및 호중구를 포함한 말초 면역계의 역할을 니그랄 뉴런의 신경 염증 및 신경 변성 과정에 연구하는 데 중요한 도구입니다 11,33,34. 마지막으로, 이러한 마우스 모델은 또한 산화 스트레스, 에너지 결핍, 및 손상된 소기관(2)과 같은 내부 세포 과정에 의해 유도되는 것들, 또는 외부 플레이어에 의해 발휘되는 것들, 예컨대 미세아교세포, 성상세포, 및 세포독성 T 세포에 의해 생성된 신경독성 인자(8)를 포함하는 생체내에서 신경변성의 세포 및 분자 메카니즘을 연구하는데 유용한 시스템을 나타내고, 28,29,35.
이 마우스 모델의 한계는 뇌외 위치에서 αSyn의 병리학 적 응집이 파킨슨 병 발병의 초기 단계를 구성 할 수있는 방법에 대한 연구입니다36. 이와 관련하여, nigral 뉴런의 신경 변성 및 운동 장애 전에, αSyn 병리학은 장 점막 및 후각 상피(36 )에서 시작되고, 아마도 αSyn 특이적 T 세포 반응 뿐만 아니라12 일 것이라는 증거가 증가하고 있습니다. 그 후, αSyn 응집체는 미주 신경을 통해 뇌간으로 이동하여 도파민성 뉴런(12)의 신경염증 및 신경변성을 촉발시킨다. AAV-hαSyn 모델이 파킨슨 병의 대부분의 측면을 되풀이하지만,이 모델에서 대뇌 외 위치에서 αSyn의 병리학 적 응집에 대한 명백한 개입은 없습니다. 파킨슨 병의 이러한 측면을 연구하기에 적합한 hαSyn 병리학을 포함하는 대안 모델은 Thy1 프로모터, Thy1-SNCA 모델37의 제어하에 hαSyn을 과발현하는 트랜스제닉 마우스일 수 있으며, 여기서 질병 발달은 장내 미생물에 의존하고 명백한 위장 장애38을 수반한다.
파킨슨 병의 병리 생리학과 관련된 다양한 과정의 연구에 도움이되지만, 본 마우스 모델은 상응하는 공간 좌표에서 바이러스 벡터의 올바른 전달, 뉴런에서의 hαSyn의 선택적 발현 (AAV 혈청형 및 벡터 구성물에 의존함)을 포함하여 미세하게 검사되어야하는 중요한 단계를 포함합니다. 파킨슨병 표현형을 분석하기 전에 적절한 AAV 투여량 및 타이밍을 포함한다. SN에서 바이러스 벡터의 적절한 전달에 대한 분석은 바늘이 완전히 직선이 아닐 때 충분하지 않을 수 있기 때문에 SN에서 바이러스 벡터의 적절한 전달에 대한 분석이 필요하며, 때로는 인간의 눈에 인식 할 수 없습니다. 더욱이, AAV 벡터의 확산은 AAV 혈청형39에 의존한다. 이러한 이유로, SN의 영역을 포함하는 뇌 절편에서 GFP의 관찰에 이어 주입된 AAV-GFP 벡터의 정확한 전달 및 확산을 점검하는 주기적인 품질 관리를 수행할 필요가 있다.
뉴런에서의 hαSyn의 선택적 발현과 관련하여, 원칙적으로, hαSyn의 발현은 뉴런에 대해 선택적인 프로모터에 의해 조절되도록 조작될 수 있거나, 훨씬 더 정확하게는 도파민성 뉴런에 대해 선택적이며, 예를 들어 도파민성 뉴런(40)에서 유전자의 선택적 발현을 유도하기 위해 AAV 벡터에서 TH 프로모터를 사용하는 것과 같은 도파민성 뉴런에 대해 선택적일 수 있다. . 그러나이 전략은 추구되는 것이 관심있는 유전자의 과발현 일 때 작동하지 않습니다. 이러한 이유로, 본 모델에서는, 강력한 프로모터(하류 유전자의 높은 발현을 유도하는 프로모터) 및 AAV 혈청형을 뉴런 트로피즘과 함께 사용하는 것이 필수적이다. 이 연구에서, CBA 프로모터는 hαSyn의 과발현을 유도하기 위한 강력한 프로모터로서 사용되었고, AAV5 혈청형은 바이러스 벡터에 사용되었다. 이 혈청형은 마우스 및 래트 뉴런(41,42)을 형질도입하기 위해 이전에 사용되어 왔다. 여기서, 결과는, 마우스의 SN에서 AAV5-GFP의 전달 12주 후, 녹색 형광이 SN 및 선조체 둘 다의 동측성 측에 선택적으로 존재한다는 것을 입증하였고(도 1), 이는 nigrostriatal 경로의 뉴런의 효율적인 형질도입을 나타낸다.
파킨슨 병의이 마우스 모델의 또 다른 중요한 측면은 수술 후 특정 과정을 분석하는 데 필요한 시점입니다. 이와 관련하여이 연구는 병리학과 관련된 다양한 과정에 대한 운동 학적 연구를 보여줍니다. 주요 시점이 마우스당 주어진 바이러스 게놈의 용량, 사용된 AAV의 혈청형, 또는 사용된 AAV의 배치에 따라 변화하기 때문에, TH+ 뉴런 및 운동 장애의 유의한 손실을 유도하는데 필요한 AAV-αSyn의 양에 대한 용량-반응 분석이 먼저 수행되었다. 이전의 연구들은 마우스당 6 x 108-3 x 10 바이러스 게놈 16,17,30,31 범위의 용량으로 마우스에서 AAV-αSyn 주사를 12주 동안 투여한 후 심각한 운동 장애와 니그로스트리아 경로의 TH+ 뉴런의 손실을 보여주었다. 따라서 nigrostriatal 경로에서 hαSyn 발현을 유도하는 데 사용되는 AAV-hαSyn의 용량, TH + 뉴런의 손실 및 마우스의 운동 손상은 마우스 당 1 x 108-1 x 10바이러스 게놈 범위였습니다. 또한, TH+ 뉴런의 소실 및 운동 장애가 SN의 뉴런의 AAV 감염이 아닌 SN에서의 hαSyn의 과발현에 의해 유도되는 것을 조절하기 위해, 마우스의 SN에서 일방적으로 전달된 리포터 유전자(AAV-eGFP)를 암호화하는 AAV가 포함된 대조군이 포함되었고 신경변성 및 운동 장애가 결정되었다. 그 결과, 입체택시 수술 후 12주 후, 마우스당 1 x 10 바이러스 게놈이 AAV5-hαSyn의 적절한 투여량이었으며,이 바이러스 부하를 받은 마우스는 nigrostriatal pathway에서 유의한 hαSyn을 나타냈으며(도 2 및 도 3), TH+ 뉴런의 손실(도 4), 및 운동 장애(도 5). 대조적으로, AAV5-hαSyn (마우스 당 1 x 108 바이러스 게놈 및 마우스 당 1 x 109 바이러스 게놈)의 낮은 용량은 이러한 모든 매개 변수에서 중요한 변화에 도달 할만큼 충분히 강하지 않았습니다 (그림 2-4). 참고로, 마우스 당 1 x 10 바이러스 게놈에서 AAV-GFP의 투여는 니그랄 도파민성 뉴런의 TH+ 뉴런의 낮은 (~20%), 그러나 상당한 정도의 손실을 유도하였다 (도 4A, B). 이 결과는 이 모델41을 사용한 이전의 관찰과 일치하며, 아마도 SN에 AAV 벡터의 투여에 의해 유도된 낮은 수준의 신경염증의 결과일 것이다. 그럼에도 불구하고, TH+ 뉴런의 손실 정도는 AAV-GFP의 동일한 투여량을 투여받은 마우스와 비교하여 AAV5-hαSyn을 투여받은 마우스에서 유의하게 더 높았다(도 4C). 참고로, hαSyn 발현의 동역학은 형질도입의 효율뿐만 아니라 AAV 확산(39)의 정도에 의존한다. AAV 확산은 AAV 혈청형에 의존하기 때문에, 이 동물 모델의 정확한 핵심 시점은 AAV5와 상이한 다른 AAV 혈청형을 사용할 때 달라질 수 있다.
그 후, 이 마우스 모델에서 주요 시점을 결정하기 위해 마우스당 1 x10 바이러스 게놈을 사용하여 동역학 분석을 수행하였다. 현재의 증거는 파킨슨 병 43,44의 조기 진단을 허용하는 운동 장애 이전에 나타나는 몇 가지 초기 증상을 보여 주었기 때문에이 실험은 hαSyn 발현이 이미 분명하지만 운동 장애가없는 시점을 찾고자했습니다. 결과는 SN에서 hαSyn 발현의 개시가 AAV-hαSyn의 입체택시 전달 후 5주째에 있었다는 것을 보여준다(도 6). 이 시점은 신경염증 및 신경퇴행성 과정을 중단시키기 위해 맞춤화된 치료법을 투여하기 시작하는 흥미로운 시간적 시점을 구성한다. 여기서 결정된 다른 주요 시점은 신경염증 과정과 관련된 두 가지 중요한 사건에 대한 피크 시간, 즉 미세아교세포가 최대 활성화 정도에 도달하는 시간과 SN으로의 최대 T 세포 침윤 시간이었다. 결과는 최대 미세아교세포 활성화의 두 파동에 도달하는 추세를 가진 곡선을 보였으며, 첫 번째는 수술 후 10주에, 두 번째는 수술 후 15주에 도달했습니다(그림 7). T 세포 침윤의 동역학적 분석은 입체택시 수술 후 11주째에 SN 내로의 Treg 침윤의 피크 시간을 나타내었다(도 8). 놀랍게도, 분석된 기간 동안 SN에 침윤하는 이펙터 T 세포(CD4+ Foxp3-)는 검출되지 않았다(수술 후 8-13주). 전체적으로, 이러한 결과는 이 전임상 모델을 사용하여 신경염증 과정을 중단하고 SN으로의 T-세포 침윤을 감쇠시키는 데 초점을 맞춘 치료법을 투여하기 시작하는 적절한 기간을 시사하며, 이는 수술 후 5주째(hαSyn 과발현의 발병)와 수술 후 10주째(신경염증 및 T-세포 침윤의 첫 번째 파동)(그림 9) 사이입니다.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig09.jpg"> 그림 9: 이 동물 모델에 대해 발견된 주요 시점 요약. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

알츠하이머 병 후, 파킨슨 병은 전 세계적으로 두 번째로 널리 퍼진 신경 퇴행성 질환입니다. 파킨슨 병에 영향을받는 주요 뉴런은 도파민을 생성하고 자발적인 움직임을 조절하는 nigrostriatal 경로의 뉴런입니다. 결과적으로,이 장애와 관련된 가장 특징적인 증상은 운동 장애입니다. 이 병리학은 또한 시냅스 전 말단과 관련된 세포질 단백질 인 α-synuclein (αSyn)1로 주로 구성된 뇌에 단백질 응집체의 침착을 포함합니다. 증거는 αSyn의 병원성 내포물의 생성이 미스폴딩 또는 이 단백질2의 일부 번역 후 변형에 의해 촉발된다는 것을 보여주었다.
특히, αSyn 병리학과 인간 파킨슨 병 및 동물 모델 3,4에서 nigrostriatal 경로의 도파민성 뉴런의 손실 사이에 밀접한 관계가 확립되었습니다. αSyn 응집체가 어떻게 생성되는지, 그리고 이들이 어떻게 뉴런 사멸을 유도하는지 이해하는 것은 이 분야에서 중요한 도전과제입니다. 점점 더 많은 연구 그룹이 산화 스트레스를 증가시킴으로써 미토콘드리아 기능 장애가 αSyn 응집체2의 생성에 대한 주요 원인 중 하나임을 보여주었습니다. 실제로, 파킨슨병 위험과 관련된 몇몇 유전자는 미토콘드리아 기능, 형태학 및 역학에 관여하는 단백질을 코딩한다 5,6. 또한, 리소좀 기능장애는 기능장애성 미토콘드리아의 축적을 초래하고 αSyn을 미스폴딩하여 αSyn 응집체7의 생성을 촉진하는 또 다른 주요 사건을 구성한다.
새로운 증거에 따르면, 일단 αSyn 응집체가 뇌에 침착되면, 이러한 병원성 단백질은 미세아교세포의 톨-유사 수용체(TLR)를 자극하여 미세아교세포 활성화 및 흑질(SN)8,9의 초기 염증 환경을 촉발시킨다. 더욱이, 증거는 αSyn 응집체가 포획되어 항원 제시 세포에 의해 T 세포에 제시되어 αSyn10,11에 특이적인 적응 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다. 이러한 αSyn 특이적 T 세포는 후속적으로 뇌에 침투하여 활성화된 미세아교세포에 의해 재자극되어 신경세포 사멸을 유발하는 신경독성 인자의 분비를 촉진한다(9,10). 흥미롭게도, αSyn 응집체가 장내 신경계에서 먼저 생성된 다음, 미주 신경을 통해 뇌 줄기(12)로 운반된다는 몇 가지 증거들이 제시되었다.
파킨슨병의 몇몇 동물 모델은 신경독성 물질(즉, 6-하이드록시도파민, 파라콰트, 로테논, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘)의 투여에 의해 유도된 것들과 유전적 상태(즉, 돌연변이 α-시누클레인, 돌연변이 류신-풍부 반복 키나아제 2)13의 투여에 의해 유도된 것들을 포함하여 수년 동안 사용되어 왔다. . 파킨슨 병의 일부 측면을 복제하는 신경 독소 유도 신경 퇴행과 관련된 모델에도 불구하고, 그들 중 누구도 질병의 모든 필수 측면을 재검토하거나 진행적이지 않습니다13. 한편, 류신이 풍부한 반복 키나아제 2의 돌연변이 버전의 발현, α-시누클레인의 돌연변이 버전, 또는 인간 야생형 α-시누클레인의 과발현을 포함하는 유전자 마우스 모델이 운동 장애를 초래하고, 어떤 경우에는 시누클레노병증의 발달을 초래하지만, 이들은 파킨슨병의 필수적인 측면인 니그랄 도파민성 뉴런의 두드러진 신경변성을 재현하지 못한다(13), 14. 신경 퇴행의 세 번째 종류의 동물 모델은 파킨슨 병의 필수적인 측면의 대부분을 충족 시켰으며, 인간 α 시누클레인 (AAV-hαSyn)을 코딩하는 아데노 관련 바이러스 벡터 (AAVs)의 입체 택시 전달 14,15. 중요하게도, AAVs는 포유류의 성인 뇌에서 높은 효능과 장기적으로 뉴런의 형질도입을 허용한다. 더욱이, SN에서 AAV-hαSyn의 입체택시 전달은 αSyn 병리학, 미세아교세포 활성화, 신경변성 및 운동 장애 16,17,18,19,20을 포함하는 질병의 많은 필수적인 측면을 재현하는 것으로 나타났다. 이 연구는 바이러스 벡터의 용량과 바이러스 벡터 전달 후 시간이 nigrostriatal 경로에서 hαSyn 발현, 신경 변성 및 신경 염증의 정도뿐만 아니라 SN에서 hαSyn의 일방적 인 입체 택시 전달의 마우스 모델에서의 운동 장애 정도에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 분석을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS AND ANIMAL FOOD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3-GFP C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No:&#160;023800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Rodent Diet</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>Rodent Diet 5001</td>
			<td>Standard Rodent diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIRAL VECTORS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-&#945;Syn</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 10E13 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-eGFP</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANESTHETICS AND ANALGESICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>218082</td>
			<td>1% for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>CHE30</td>
			<td>70 mg/Kg&#160; for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>VE2L9117</td>
			<td>For before transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>DPH134</td>
			<td>30 mg/Kg every 24 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Centrovet</td>
			<td>EHL40</td>
			<td>9 mg/kg for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam test</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>S2800 Coolpix</td>
			<td>For recording the beam test performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Used for IHC analysis (section 4.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI8</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Standard Stereotaxic, mouse</td>
			<td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td>
			<td>51500</td>
			<td>stereotaxic frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>C-flex L/S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-RFL-T</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture</td>
			<td>Sylkam&#174;, B Braun</td>
			<td>C0760171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 100 U</td>
			<td>BD</td>
			<td>324918</td>
			<td>For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>HA-7641-01</td>
			<td>For viral vector innoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUFFERS AND REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviden, Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>189728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotrotection buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20% glycerine and 2% DMSO in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount -G T</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>5000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.125 M, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase inactivating buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.03% H2O2 in methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>111065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-Iba-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR16588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism</td>
			<td>6.0</td>
			<td>Fos stats analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Leica microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProgRes Capture Pro</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Olympus microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLC media player</td>
			<td>VideoLAN Organization</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For analysis of behavioural tests</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein

파킨슨 병은 nigrostriatal 경로의 도파민 성 뉴런의 죽음과 결과적으로 자발적인 운동의 통제의 점진적 손실을 포함하는 신경 퇴행성 장애입니다. 이 신경 퇴행성 과정은 주로 α-synuclein으로 구성되는 뇌에 단백질 응집체의 침착에 의해 유발됩니다. 여러 연구에 따르면 파킨슨 병과 관련된 신경 변성을 일으키기 위해서는 신경 염증이 필요하다는 사실이 밝혀졌습니다. 특히, 신경염증 과정은 미세아교세포 활성화뿐만 아니라 말초 T 세포의 흑질(SN) 내로의 침윤을 수반한다. 이 연구는 미세아교세포 활성화, SN으로의 T-세포 침윤, 니그랄 도파민성 뉴런의 신경변성 및 운동 장애를 되풀이하는 파킨슨병의 마우스 모델을 분석한다. 파킨슨병의 이러한 마우스 모델은 인간 야생형 α시누클레인(AAV-hαSyn)을 코딩하는 아데노-관련 바이러스 벡터의 입체택시 전달에 의해 SN 내로 유도된다. SN 내로의 바이러스 벡터의 정확한 전달은 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 대조군 벡터를 사용하여 확인하였다. 그 후, SN에 투여된 AAV-hαSyn의 투여량이 hαSyn 발현의 정도, 니그랄 도파민성 뉴런의 손실, 및 운동 장애에 어떻게 영향을 미치는지 평가하였다. 더욱이, hαSyn 발현, 미세아교세포 활성화 및 T-세포 침윤의 역학은 질병 발달의 시간 과정에 걸쳐 결정되었다. 따라서, 본 연구는 파킨슨병의 전임상 모델에서 시누클레인 병리학 및 신경염증을 표적화하는데 유용할 수 있는 중요한 시점을 제공한다.

nigrostriatal 경로의 도파민성 뉴런에서 AAV 벡터의 정확한 전달을 검증하는 것 시누클레인 병리에 의해 촉진되는 신경염증, 신경변성 및 운동 장애의 과정을 연구하기 위해, SN16,17,30,31에서 hαSyn을 코딩하는 AAV의 일방적인 입체택시 전달에 의해 유도되는 파킨슨병의 마우스 모델을 사용하였다(보충 도 1의 실험 설계 참조). ). nigrostriatal 경로의 도파민성 뉴런에서 AAV 벡터의 정확한 전달을 검증하기 위해, GFP (AAV-GFP)를 코딩하는 AAV를 SN에 주입하고, 12주 후, GFP 형광 및 티로신 하이드록실라제 (TH) 면역반응성을 면역형광에 의해 SN 및 선조체에서 분석하였다. GFP 관련 형광은 동측 측에서만 독점적으로 관찰되었고, SN 및 선조체 둘 다에서 TH 면역반응성과 유의한 공국재화가 있었으며, 이는 니그로스트리아 경로의 도파민성 뉴런에서 AAV 벡터의 정확한 전달을 나타낸다(도 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig01.jpg"> 도 1: nigrostriatal 경로에서 AAV-GFP의 전달의 분석. 마우스는 AAV-GFP (1 x 1010 vg/mouse)를 받았고 12 주 후에 희생되었고, TH는 (A) SN (스케일 바는 118 μm) 및 (B) 선조체 (스케일 바는 100 μm이다)에서 면역염색되었다. TH- 및 GFP-관련 형광을 에피형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 DAPI로 염색하였다. TH (적색), GFP (녹색) 및 DAPI (파란색)의 병합 또는 단일 염색의 대표적인 이미지가 도시되어 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
AAV-hαSyn에 의해 유도된 파킨슨병의 마우스 모델에서 신경변성 및 운동 장애를 유도하기 위해 투여된 바이러스 벡터의 투여량을 설정한다. nigral dopaminergic 뉴런의 신경 변성을 촉진하는 hαSyn의 유의한 과발현을 유도하는 데 필요한 AAV-hαSyn의 용량을 시험하기 위해, AAV-hαSyn의 상이한 투여량 (1 x 10 9 vg/마우스 또는 1 x10 10 vg/mouse)을 주입하고, 12주 후, hαSyn 면역반응성 및 TH 면역반응성의 정도를 nigrostriatal 경로에서 평가하였다. SN에서 테스트된 모든 용량에서 hαSyn 면역반응성이 뚜렷했지만(그림 2), 1 x 1010 vg/마우스를 투여받은 마우스만이 선조체에서 명백한 hαSyn 면역반응성을 나타냈다(도 3). 더욱이, AAV-hαSyn의 1 x 1010 vg/마우스를 투여받은 마우스는 SN에서 도파민성 뉴런의 상당한 손실을 나타냈다(도 4A,B). AAV-GFP의 1 x10 10 vg/마우스를 투여받은 마우스는 낮은 정도(~20%)의 신경 손실을 나타냈지만(도 4A,B), 동일한 용량의 AAV-hαSyn을 투여받은 마우스는 니그랄 도파민성 뉴런의 신경변성 정도가 상당히 높았다(도 4C). 따라서, AAV-hαSyn의 1 x10 10 vg/마우스를 사용하여 추가 실험을 수행하였다. 또한, 운동 장애의 정도는 앞서도 25에 기재된 바와 같이 빔 검정(도 5A)을 사용하여 AAV-hαSyn의 상이한 투여량을 수용하는 마우스에서 결정되었다. 빔 테스트에서 AAV-hαSyn의 1 x 1010 vg/mouse에서 모터 성능의 현저한 감소가 독점적으로 검출되었는데, 이는 오른쪽 및 왼쪽 패드에 의해 만들어진 오류 수를 비교할 때(그림 5B) AAV-hαSyn을 수신한 마우스와 대조 벡터 AAV-GFP를 받은 마우스와 비교했을 때(그림 5C). 따라서, AAV-hαSyn의 1 x10 10 vg/마우스를 사용하여 추가 실험을 수행하였다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig02.jpg"> 도 2: 상이한 용량의 AAV-hαSyn으로 처리된 마우스의 SN에서의 인간 α-시누클레인 발현의 분석. 마우스는 (A) 1 x 10 10 vg/마우스, (B) 1 x 109 vg/마우스 또는 (C) 1 x 108 vg/마우스에서 AAV-hαSyn을 받았고 12주 후에 희생되었고, hαSyn 발현은 후피형광 현미경을 사용하여 SN에서 면역형광으로 분석되었다. 핵을 DAPI로 염색하였다. hαSyn (적색) 또는 DAPI (파란색)의 병합 또는 단일 염색의 대표적인 이미지가 도시되어 있다. 스케일 바는 118μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig03.jpg"> 도 3: AAV-hαSyn의 상이한 투여량으로 처리된 마우스의 선조체에서의 인간 α-시누클레인 발현의 분석. 마우스는 (A) 1 x 10 10 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse, 또는 (C) 1 x 108 vg/mouse)에서 AAV-hαSyn을 받았고, 12주 후에 희생되었고, hαSyn 발현은 후피형광 현미경을 사용하여 선조체에서 면역형광으로 분석되었다. 핵을 DAPI로 염색하였다. hαSyn (적색) 또는 DAPI (파란색)의 병합 또는 단일 염색의 대표적인 이미지가 도시되어 있다. 스케일 바는 100 μm이다. 병합된 이미지의 오른쪽 위 모서리에 있는 삽입은 더 높은 배율에서 관심 영역을 보여 줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig04.jpg"> 도 4: AAV-hαSyn 또는 대조군 벡터의 상이한 투여량으로 처리된 마우스에서 SN의 도파민성 뉴런의 손실. 마우스는 AAV-hαSyn (1 x 10 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse, 또는 1 x 108 vg/mouse) 또는 AAV-GFP (1 x 10 10vg/mouse)를 받았고12주 후에 희생되었고, TH는 면역조직화학에 의해 SNpc에서 분석되었다. (A) 대표 이미지. 스케일 바, 100 μm. (B,C) 뉴런의 밀도는 TH+ 뉴런/mm2의 수로서 정량화되었다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. n=그룹당 3-8마리의 마우스. (B) 동측성과 대측면의 비교는 두 꼬리 쌍을 이룬 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행되었다. (c) AAV-hαSyn 또는 AAV-GFP의 1 x10 vg/마우스를 수용한 마우스로부터의 동측성 측면의 비교가 수행되었다. (B,C) 흰색 막대는 AAV-hαSyn을 투여받은 마우스의 동측 측에서 TH+ 뉴런의 정량화를 나타내는 반면, 녹색 막대는 AAV-GFP를 받는 마우스의 동측 측에서 TH+ 뉴런의 정량화를 나타낸다. 회색 막대는 해당 그룹의 대측에서 TH + 뉴런의 정량화를 나타냅니다. 비교는 두 꼬리 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-테스트에 의해 수행되었다. *p < 0.05; **p < 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig05.jpg"> 도 5: AAV-hαSyn의 상이한 투여량으로 처리된 마우스에서의 운동 성능의 분석. 마우스는 AAV-hαSyn 또는 AAV-GFP의 다른 용량 (1 x 10 10 vg / 마우스, 1 x 109 vg / 마우스 또는 1 x 108 vg / 마우스)을 받았으며 12 주 후 빔 테스트로 모터 성능을 평가했습니다. (A) 빔 위를 걷는 마우스의 이미지. (b) 왼쪽 팔다리 (대측성) 대 오른쪽 팔다리 (ipsilateral)에 의해 수행 된 오류의 수는 AAV-hαSyn을받는 마우스 그룹에서 정량화되었다. (c) AAV-hαSyn 또는 AAV-GFP의 동일한 투여량을 투여받은 상이한 실험군 간에 총 오차 수를 비교하였다. 데이터는 그룹당 평균 ± SEM. n=3-5마리의 마우스를 나타낸다. 비교는 (B) 쌍을 이룬 두 꼬리 스튜던트 t-테스트 또는 (C) 짝을 이루지 않은 두 꼬리 스튜던트 t-테스트에 의해 수행되었다. *p < 0.05; **p < 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
AAV-αSyn에 의해 유도된 파킨슨병 모델의 동역학 설정 상당한 수준의 신경변성 및 운동 장애를 유도하기 위해 사용된 적절한 AAV-hαSyn 용량을 결정한 후, hαSyn 과발현의 발병을 정의하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해, 마우스를 AAV-hαSyn 또는 가짜 수술의 1 x 1010 vg/마우스로 처리하였다. hαSyn 발현의 정도는 입체택시 수술 후 2-5주 동안 일주일에 한 번 SN에서 분석되었다( 보충도 2의 실험 설계 참조). 결과는 hαSyn 발현이 수술 후 2 주 이내에 낮은 수준에서 검출 되었음에도 불구하고 hαSyn 클러스터가 입체 택시 수술 후 5 주에 나타났다는 것을 보여줍니다 (그림 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig06.jpg"> 도 6: AAV-hαSyn을 처리한 마우스의 SN에서 인간 α시누클레인 발현의 시간 경과를 분석한다. 마우스는 AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/mouse) 또는 가짜 입체택시 수술을 받았고, SN에서 hαSyn의 발현을 (A) 2주, (B) 3주, (C) 4주 또는 (D) 5주 후 후피형광 현미경을 이용한 면역형광으로 분석하였다. 핵을 DAPI로 염색하였다. hαSyn (적색) 또는 DAPI (파란색)의 병합 또는 단일 염색의 대표적인 이미지가 도시되어 있다. 스케일 바, 100 μm. 병합된 이미지의 오른쪽 위 모서리에 있는 삽입은 더 높은 배율에서 관심 영역을 보여 줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그 후, AAV-hαSyn의 입체택시 전달 후 중추신경계(CNS)에서의 신경염증 및 T-세포 침윤을 분석하기에 적합한 시점을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. AAV-hαSyn으로 마우스를 처리한 후 미세아교세포 활성화의 피크를 확인하기 위해, 선조체에서 높은 수준의 Iba1을 발현하는 세포의 정도를 입체택시 수술 후 2-15주 동안 일주일에 한 번 평가하였다. 결과는 AAV-hαSyn 처리 후 15주 후 마우스의 대측성 측면과 비교하여 동측방의 미세아교세포 활성화의 현저한 증가를 보여준다(도 7). SNpc 내로 침윤된 Treg (CD4+ Foxp3+) 세포의 수는 또한 면역형광 관찰에 이어 공초점 현미경 관찰에 의해 AAV-hαSyn의 입체택시 전달 후 상이한 시점에서 평가되었다. 결과는 SNpc 내로의 Treg 침윤의 피크가 수술 후 11 주에 있었던 반면, Treg가 뇌의이 영역에 침투하는 정도는 수술 후 8 주 또는 13 주에 더 낮았다는 것을 보여줍니다 (그림 8). 선조체에 침윤하는 CD4+ T 세포는 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 전체적으로, 이러한 결과는 AAV-hαSyn의 1 x 10 10 vg / 마우스를 사용하여 신경 염증을 분석하는 데 가장 적합한 시점은 입체 택시 수술 후 15 주이며, CNS로의 T 세포 침윤을 분석하기위한 적절한 시점은 AAV-hαSyn 치료 후11 주째 인 것으로 보입니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig07.jpg"> 도 7: AAV-hαSyn을 접종한 마우스에서 미세아교세포 활성화의 시간 경과를 분석함. 마우스는 AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse)을 받았고, 미세아교세포 활성화는 수술 후 다른 시점에서 선조체에서 Iba1의 면역조직화학적 분석에 의해 평가되었다. (a) AAV-hαSyn으로 접종한 후 5주, 10주 또는 15주 후에 희생된 마우스로부터의 Iba1의 면역조직화학적 분석의 대표적인 개요 이미지가 도시되어 있다. 스케일 바, 110 μm. (B) 활성화된 미세아교세포의 밀도는 면적당 높은 수준의 Iba1 및 아메보이드 형태를 발현하는 세포의 수로서 정량화되었다. 데이터는 그룹당 평균 ± SEM. n=3마리의 마우스를 나타낸다. 두 꼬리 쌍을 이룬 스튜던트 t-검정을 사용하여 각 그룹에서 동측성 Iba1과 대측성 Iba1 사이의 통계적 차이를 확인했습니다. *p< 0.05입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig08.jpg"> 도 8: AAV-hαSyn을 접종한 마우스의 SN 내로의 CD4+ T 세포 침윤의 시간 경과의 분석. Foxp3gfp 리포터 마우스는 AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/마우스)을 받았다. Foxp3를 발현하는 CD4+ T-세포의 존재 및 TH+ 뉴런의 존재를 면역형광에 의해 SN에서 상이한 시점 (수술 후 8주, 11주, 및 13주째)에서 분석하였다. (a) 단일 면역염색 또는 병합을 위한 대표적인 이미지가 도시되어 있다. 스케일 바, 100 μm. (B) SN 내의 면적당 CD4+ Foxp3+ T 세포의 수를 정량화하였다. 데이터는 그룹당 3마리의 마우스로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다. *p<0.05, 동측성 대 대측성 CD4+ Foxp3+ T 세포 2꼬리 스튜던트 t-검정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1 : 시누클레인 병리학, 신경 변성 및 운동 장애에 대한 AAV 벡터의 다양한 용량의 효과를 평가하기위한 실험 설계. 야생형 수컷 C57BL/6 마우스를 마취시키고, CBA 프로모터의 제어 하에 인간 α-시누클레인(AAV-hαSyn) 또는 eGFP(AAV-GFP)를 코딩하는 AAV의 상이한 용량(1 x 10 10 vg/마우스, 1 x 109 vg/마우스 또는 1 x 108 vg/마우스)의 입체택시 접종을 받았다. 12주 후, SN 및 선조체(Str)에서의 GFP 및 hαSyn의 발현을 면역형광(IF)으로 평가하였고, 티로신 하이드록실라제 양성(TH+) 세포를 SN에서 면역조직화학(IHC)에 의해 정량하고, 빔 검정에 의해 운동 성능을 평가하였다. 각 실험군의 마우스 수는 괄호 안에 표시되어 있다. *는 분석 전에 마우스 한 마리가 사망한 그룹을 나타냅니다. 각 분석은 괄호 안에 해당 결과가 표시된 용지 본문의 그림 수를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: T-세포 침윤, 신경염증 및 hαSyn 발현의 동역학을 결정하기 위한 실험 설계. Foxp3gfp 리포터 마우스를 마취시키고, CBA 프로모터의 제어 하에 인간 α-시누클레인 (AAV-hαSyn)을 코딩하는 AAV (1 x 10 vg/마우스)의 입체택시 접종을 우측 흑질(SN) 또는 가짜 수술(PBS)로 받았다. 마우스를 상이한 시점에서 희생시키고, SN 및 선조체에서의 hαSyn의 발현을 면역형광 (IF), GFP (Foxp3), CD4, 및 티로신 하이드록실라제 양성 (TH+) 세포에 의해 평가하였고, SN에서의 IF에 의해 정량하고, 선조체 (Str)에서의 Iba1 발현을 면역조직화학(IHC)에 의해 분석하였다. 각 실험군의 마우스 수가 표시되어 있다. 각 분석에 포함된 시점의 범위가 표시됩니다. 각 분석은 괄호 안에 해당 결과가 표시된 용지 본문의 그림 수를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein

이 연구는 파킨슨 병의 전임상 모델에서 신경 염증, 신경 변성 및 운동 장애를 유도하는 데 필요한 벡터 용량과 노출 시간을 분석합니다. 인간 α시누클레인을 코딩하는 이들 벡터는 파킨슨병과 관련된 시누클레인 병리를 재분석하기 위해 흑질로 전달된다.

인간 α-시누클레인을 코딩하는 아데노 관련 바이러스 벡터에 의해 유도된 파킨슨병 마우스 모델 분석

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

이 절차의 전반적인 목표는 동물 모델에서 파킨슨 병의 필수 측면의 대부분을 재현하는 것입니다. 아데노-관련 바이러스 벡터의 입체택시 전달은, 흑질에서 인간 시누클레인을 코딩한다. 파킨슨 병은 도파민성 뉴런의 죽음, nigrostriatal 경로, 그리고 결과적으로 자발적인 운동의 통제력 상실의 진행을 포함하는 신경 퇴행성 장애입니다.이 신경 퇴행성 과정은 주로 시누클레인에 의해 구성되는 뇌에 단백질 응집체의 침착에 의해 수반됩니다. 새로운 증거에 따르면, 시누클레인 응집체는 미세 아교세포의 톨 유사 수용체를 자극하여 흑질의 신경 염증을 유발할 수 있습니다. 더욱이, 증거는 시누클레인 응집체가 항원 제시 세포에 의해 T 세포에 포획되고 제시될 수 있고, 시누클레인에 특이적인 적응 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다.흑질에서 인간 시누클레인을 코딩하는 아데노-관련 바이러스 벡터의 입체택시 전달은, 시누클레인 병리, 미세아교세포 활성화, T 세포 활성화, 신경변성 및 운동 장애를 포함하는 질환의 많은 필수적인 측면을 재현하는 것으로 나타났다. 이 연구는 바이러스 벡터와 바이러스 벡터 전달 후 시간이 어떻게 인간 시누클레인 발현, 신경 변성 및 nigrostriatal 경로에서의 신경 염증에 미치는 정도뿐만 아니라 흑질에서 인간 시누클레인의 일방적 입체 택시 전달의 마우스 모델에서의 운동 장애 정도에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 분석을 제시합니다. 무균 환경을 유지하려면 신발 커버, 수술 마스크, 위생 장벽, 장갑 및 수술 캡을 포함하여 전체 수술 중에 적절한 수술복을 착용하십시오.무균 환경을 유지하기 위해 마우스와 모든 수술 재료에 에탄올을 뿌리십시오. 진통제를 유도하려면 12 시간마다 카프로펜을 피하 주사하고 수술 1 시간 전에 시작하여 수술 후 사흘까지 계속하십시오. 마우스를 마취하려면 동물을 유도 챔버에 넣으십시오.이소플루란 흐름을 0.5 %의 속도로 연 다음 마우스가 오른쪽 반사를 잃을 때까지 약 5 분 동안 천천히 5 %까지 증가시킵니다. 유도 챔버에서 동물을 제거한다. 즉시 동물을 적절한 크기의 코 콘이있는 비 호흡 회로로 옮깁니다.수술 전 시간 동안 이소플루란으로 마우스 마취를 1 % 유지하십시오. 마우스가 꼬리와 발을 꼬집어 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 꼬리와 발을 꼬집을 때 마우스가 반응하지 않으면 마우스가 완전히 마취되었음을 의미합니다.가위를 사용하여 마우스 머리를 면도하십시오. 클로르헥시딘 2 %의 면봉을 사용하여 마우스 피부를 닦고 모든 머리카락을 제거하십시오. 마우스 헤드를 스테레오택시 프레임에 고정합니다.면봉을 사용하여 양쪽 마우스 눈에 각막 보호제를 놓습니다. 다른 설치류의 스트레스 유도를 방지하려면 수술실에 다른 마우스가 있으면 피하십시오. 클로르헥시딘 2 %의 세 라운드로 마우스 머리를 닦은 다음 에탄올 70 % 외과 용 재료를 사용하여 두개골을 노출하고 내측선에 대해 좌표 전후 2.8mm, 평측 1.4mm에서 드릴로 얇은 구멍을 뚫습니다.구멍에 10 마이크로 리터 주사기의 바늘을 넣고, dura에 대하여 7.2 mm 등복부에 도달 할 때까지 바늘을 천천히 뇌 안쪽으로 옮깁니다. 바늘을 2 분 동안 최종 위치에 두어 조직이 약간 침전 될 수 있도록 한 다음 30 초마다 0.2 마이크로 리터의 속도로 오른쪽 흑질에 한 마이크로 리터의 바이러스 벡터를 주입하십시오. 바이러스 벡터의 전달 후 다섯 분 동안 바늘을 같은 위치에 둔 다음 천천히 철회하십시오.멸균 실크 봉합사를 사용하여 상처를 닫습니다. 마우스를 가정용 케이지에 넣고 전기 따뜻한 매트리스 위에 올려 놓아 미리 따뜻하게하십시오. 입체 택시 수술 후 12 주 후, 이전에 설명 된 빔 테스트의 단순화 된 버전을 사용하여 모터 성능을 평가하십시오.이를 위해 길이 25cm, 너비 3cm의 수평 빔을 사용하십시오. 빔 표면은 한 센티미터의 사각형이있는 금속 격자로 덮여 있어야하며 빔 위로 한 센티미터 상승해야합니다. 그리드 표면 빔을 횡단하면서 홈 케이지가 있는 빔의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝으로 마우스의 비디오를 만듭니다.모터 성능을 결정하기 전에 이틀 동안 마우스를 훈련시킵니다. 첫날에는 그리드없이 빔을 다섯 번 통과하도록 마우스를 훈련시킵니다. 둘째 날에는 그리드가있는 상태에서 빔을 다섯 번 걷도록 마우스를 훈련시킵니다.셋째 날에 모터 성능을 평가하십시오. 이렇게하려면 슬로우 모션 모드에서 비디오를 보면서 왼쪽 발 또는 오른쪽 발에 의해 수행 된 오류 수를 정량화하십시오. 마우스를 마취하려면 케타민과 자일라진의 혼합물을 복강 내로 주입하십시오.마우스가 완전히 마취되면 수술 재료로 흉부를 열고 심장을 노출시킵니다. 그런 다음 평평한 팁 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하십시오. 바늘을 파이프에 결합시켜 연동 펌프를 사용하여 분당 9.5 밀리리터의 속도로 50 밀리리터의 인산염 완충 식염수를 관류합니다.가위와 핀셋을 사용하여 뇌를 제거한 다음 인산염 완충 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 다섯 밀리리터에 담그면 고정됩니다. 그 후, 고정 된 뇌를 15 밀리리터의 30 % sucrose에 48 시간 동안 넣으십시오. 그런 다음 뇌를 네 밀리리터의 냉동 보호 용액에 넣고 뇌를 80도에서 저장하거나 다음 단계에서 즉시 사용하십시오.줄무늬 조각을 얻으려면 뇌를 40 마이크로 미터 두께의 섹션으로 자르고 1.34mm에서 시작하여 0.26mm에서 마무리하십시오. 전후 순서에 따라 두 밀리리터의 냉동 튜브로 각 조각을 수확하십시오. 선조체에서 면역 조직 화학 및 면역 형광 분석을 수행하려면 균일 한 간격으로 취해진 다섯 개의 코로나 삼중항 절편을 선택하여 핵의 전체 rostrocaudal 정도를 덮습니다.nigrostriatal 경로의 도파민성 뉴런에서 바이러스 벡터의 정확한 전달을 검증하기 위해, GFP를 코딩하는 벡터를 흑질에 주입하고, 흑질에 주입하고, 12주 후, GFP 형광 및 티로신 하이드록실라제 면역반응성을 면역형광에 의해 흑질과 선조체에서 분석하였다. GFP 관련 형광은, 동측성 부위에만 독점적으로 위치하였고, 티로신 하이드록실라제 면역반응성과의 유의한 공동국소화가 흑질과 선조체 둘 다에서 관찰되었으며, 이는 nigrostriatal 경로의 도파민성 뉴런에서 바이러스 벡터의 정확한 전달을 나타낸다. 필요한 시누클레인을 코딩하는 벡터의 투여량을 시험하기 위해, 니그랄 도파민성 뉴런의 신경변성을 촉진하는 인간 시누클레인의 유의한 과발현을 유도하기 위해, 벡터의 상이한 투여량을 주입하였다.그리고 12주 후, 인간 시누클레인 면역반응성, 및 티로신 하이드록실라제 면역반응성의 정도를 니그로스트리아 경로에서 시험하였다. 인간 시누클레인 면역반응성은 명백하였고, 모든 투여량은 흑질에서 시험되었다. 그러나, 마우스 당 10 내지 10개의 바이러스 게놈을 수용한 마우스만이 선조체에서 명백한 인간 시누클레인 면역반응성을 제시하였다.마우스 당 10개의 바이러스 게놈을 수용한 마우스는 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터의 마우스로, 흑질에서 도파민성 뉴런의 상당한 손실을 나타내었다. GFP를 코딩하는 벡터의 동일한 용량을 받은 마우스는 낮은 정도의 뉴런 손실을 나타냈지만, 이들 마우스는 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터를 투여받은 마우스와 비교하여 상당히 낮은 신경변성 정도를 보였다. 빔 테스트를 사용하여, 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터의 마우스 당 10 내지 10 개의 바이러스 게놈을 수신하거나, 오른쪽 및 왼쪽 발에 의해 만들어진 오류 수를 비교할 때, 또는 총 오류 수를 비교할 때, 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터를 수신하는 마우스의 총 오류 수를 비교할 때, 그 마우스에서 독점적으로 운동 성능의 현저한 감소가 검출되었다. 대조군 벡터를 받은 마우스와 함께.인간 시누클레인 발현의 발병을 정의하기 위해, 마우스는 마우스 당 10 내지 10개의 바이러스 게놈, 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터, 또는 가짜 수술로 치료되었고, 인간 시누클레인 발현의 정도를 입체택시 수술 후 일주일에 한 번, 두 주 내지 다섯 주 동안 흑질에서 분석하였다. 결과는 인간 시누클레인 발현이 입체 택시 수술 후 다섯 번째 주에 분명해지기 시작했다는 것을 보여준다. 미세아교세포 활성화의 피크를 결정하기 위해, 높은 수준의 Iba1을 발현하는 세포의 정도를, 수술 후 2-15주 동안 마우스의 선조체에서 정량화하였다.상기 결과는 바이러스 접종 후 15주 후인 마우스의 대측성 측면과 비교하여 동측성 측의 미세아교세포 활성화의 현저한 증가를 보여준다. 실질적인 니그라 내로 침윤된 조절 T 세포의 수를 상이한 시점에서 분석하였고, 면역형광에 의한 입체택시 수술 후, 공초점 현미경 관찰에 이어진다. 흑질로의 조절 T 세포 침윤의 피크는 수술 후 11주째에 관찰되었다.여기에서 분석된 신경변성의 마우스 모델은, 파킨슨병의 병태생리학에 관여하는 주요 양태의 다수를 연구하는데 유용한 모델을 나타낸다. 시누클레인 병리, 미세아교세포 활성화, 말초 면역계의 관여, 신경염증, 및 신경변성의 기작에 관여하는 관여 기작 신경변성, 신경염증, T-세포 침윤 및 운동 장애를 유도하는 아데노-관련 바이러스 벡터, 인간 시누클레인을 코딩하는 아형 다섯형의 적절한 투여량은 마우스 당 10 내지 10개의 바이러스 게놈이다. 이 연구는 입체 택시 수술 후 다섯 주가 인간 시누클레인 발현이 이미 분명하지만이 동물 모델에서 운동 장애가없는 핵심 시점을 구성한다는 것을 보여줍니다.이에 의해, 이 시점은, 흥미로운 시간적 시점을 나타내고, 신경염증 및 신경변성의 진행을 중단시키기 위해 맞춤화된 실험적 치료법의 투여를 시작한다. 이 동물 모델에서 신경 염증을 분석하기에 가장 적합한 시점은 입체 조영 수술 후 15 주째입니다. 중추신경계로의 T-세포 침윤을 분석하기에 적절한 시점이 되는 동안.바이러스 벡터 접종 후 11 주째에있는 것으로 보입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

연구

신경과학

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

알츠하이머 질병 마우스 모델에서 Neuritic Plaques의 감지

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

방법은 자발적인 특성화 및 놀라게 유도 로코을의 로테 논에 의한 파킨슨 병 모델에서합니다<em&gt; 초파리</em

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Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

파킨슨병의 유전적 쥐 모델에서 보행 분석을 위한 RatWalker 시스템 적용

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

파킨슨 병의 6- 히드 록시 도파민 쥐 모델

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...