Name: analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Себастьяна Валенсуэлу и д-ра Микаэлу Рикку за их ценную ветеринарную помощь в нашем учреждении для животных. Эта работа была поддержана "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (для Fundación Ciencia & Vida) и Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Эта работа также финансировалась грантами FONDECYT-1210013 (для R.P.) и FONDECYT-1150766 (для F.C.) от «Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)» и MJFF-10332.01 (для R.P.) и MJFF-17303 (для F.C.) от Фонда Майкла Джей Фокса для исследований Паркинсона.

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо финансовых или нефинансовых конкурирующих интересов.

После болезни Альцгеймера болезнь Паркинсона является вторым наиболее распространенным нейродегенеративным заболеванием во всем мире. Первичными нейронами, пораженными при болезни Паркинсона, являются нейроны нигростриатального пути, которые производят дофамин и контролируют произвольное движение. Как следствие, наиболее характерным симптомом, связанным с этим расстройством, является двигательное нарушение. Эта патология также включает в себя отложение белковых агрегатов в головном мозге, которые состоят в основном из α-синуклеина (αSyn)1, цитозольного белка, связанного с пресинаптическими терминалями. Данные показали, что генерация патогенных включений αSyn вызвана неправильным сворачиванием или некоторыми посттрансляционными модификациями этого белка2.
Примечательно, что была установлена тесная связь между патологией αSyn и потерей дофаминергических нейронов нигростриатального пути при болезни Паркинсона человека и животных моделях 3,4. Понимание того, как генерируются агрегаты αSyn и как они вызывают гибель нейронов, представляет собой значительную проблему в этой области. Растущая группа исследований показала, что, увеличивая окислительный стресс, митохондриальная дисфункция является одной из ведущих причин генерации агрегатов αSyn2. Действительно, несколько генов, связанных с риском болезни Паркинсона, кодируют белки, участвующие в митохондриальной функции, морфологии и динамике 5,6. Кроме того, лизосомальная дисфункция, которая приводит к накоплению дисфункциональных митохондрий и неправильно свернутых αSyn, представляет собой еще одно крупное событие, способствующее генерации агрегатов αSyn7.
Новые данные показали, что, как только агрегаты αSyn депонируются в мозге, эти патогенные белки стимулируют толл-подобные рецепторы (TLR) на микроглии, тем самым вызывая активацию микроглии и начальную воспалительную среду в черной субстанции (SN)8,9. Кроме того, данные указывают на то, что агрегаты αSyn захватываются и представляются антигенпрезентирующими клетками т-клеткам, вызывая адаптивный иммунный ответ, специфичный для αSyn10,11. Эти αСин-специфические Т-клетки впоследствии проникают в мозг и рестимулируются активированной микроглией, тем самым способствуя секреции нейротоксических факторов, которые вызывают гибель нейронов 9,10. Интересно, что несколько линий доказательств предполагают, что агрегаты αSyn генерируются сначала в кишечной нервной системе, а затем транспортируются через блуждающий нерв к стволу мозга12.
В течение многих лет использовалось несколько животных моделей болезни Паркинсона, в том числе те, которые индуцировались введением нейротоксических веществ (т.е. 6-гидроксидофамин, паракват, ротенон, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) и те, которые связаны с генетическими условиями (т.е. мутантная α-синуклеин, мутантная лейцин-богатая повторная киназа 2)13 . Несмотря на модели, включающие нейротоксин-индуцированную нейродегенерацию, воспроизводящую некоторые аспекты болезни Паркинсона, ни одна из них не повторяет все существенные аспекты заболевания или не прогрессирует13. С другой стороны, хотя генетические мышиные модели, включающие экспрессию мутантных версий богатой лейцином повторной киназы 2, мутантные версии α-синуклеина или сверхэкспрессию человеческих α-синуклеина дикого типа, приводят к двигательным нарушениям, а в некоторых случаях также к развитию синуклеинопатии, они не воспроизводят заметную нейродегенерацию нигральных дофаминергических нейронов, что является существенным аспектом болезни Паркинсона13, 14. Третий вид животной модели нейродегенерации сумел удовлетворить большинство существенных аспектов болезни Паркинсона, стереотаксическую доставку аденоассоциированных вирусных векторов (AAV), кодирующих человеческий α-синуклеин (AAV-hαSyn)14,15. Важно отметить, что AAV позволяют трансдукцию нейронов с высокой эффективностью и в долгосрочной перспективе в мозг взрослых млекопитающих. Кроме того, было показано, что стереотаксическая доставка AAV-hαSyn в SN воспроизводит многие из основных аспектов заболевания, включая патологию αSyn, активацию микроглии, нейродегенерацию и двигательные нарушения 16,17,18,19,20. В этом исследовании представлен анализ того, как доза вирусного вектора и время после доставки вирусного вектора влияют на степень экспрессии hαSyn, нейродегенерации и нейровоспаления в нигростриатальном пути, а также на степень двигательных нарушений в мышиной модели односторонней стереотаксической доставки hαSyn в SN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS AND ANIMAL FOOD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3-GFP C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No:&#160;023800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Rodent Diet</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>Rodent Diet 5001</td>
			<td>Standard Rodent diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIRAL VECTORS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-&#945;Syn</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 10E13 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-eGFP</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANESTHETICS AND ANALGESICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>218082</td>
			<td>1% for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>CHE30</td>
			<td>70 mg/Kg&#160; for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>VE2L9117</td>
			<td>For before transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>DPH134</td>
			<td>30 mg/Kg every 24 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Centrovet</td>
			<td>EHL40</td>
			<td>9 mg/kg for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam test</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>S2800 Coolpix</td>
			<td>For recording the beam test performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Used for IHC analysis (section 4.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI8</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Standard Stereotaxic, mouse</td>
			<td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td>
			<td>51500</td>
			<td>stereotaxic frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>C-flex L/S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-RFL-T</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture</td>
			<td>Sylkam&#174;, B Braun</td>
			<td>C0760171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 100 U</td>
			<td>BD</td>
			<td>324918</td>
			<td>For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>HA-7641-01</td>
			<td>For viral vector innoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUFFERS AND REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviden, Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>189728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotrotection buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20% glycerine and 2% DMSO in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount -G T</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>5000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.125 M, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase inactivating buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.03% H2O2 in methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>111065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-Iba-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR16588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism</td>
			<td>6.0</td>
			<td>Fos stats analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Leica microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProgRes Capture Pro</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Olympus microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLC media player</td>
			<td>VideoLAN Organization</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For analysis of behavioural tests</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein

Болезнь Паркинсона – это нейродегенеративное расстройство, которое предполагает гибель дофаминергических нейронов нигростриатального пути и, как следствие, прогрессирующую потерю контроля над произвольными движениями. Этот нейродегенеративный процесс запускается отложением белковых агрегатов в головном мозге, которые в основном состоят из α-синуклеина. Несколько исследований показали, что нейровоспаление требуется для развития нейродегенерации, связанной с болезнью Паркинсона. Примечательно, что нейровоспалительный процесс включает в себя активацию микроглии, а также инфильтрацию периферических Т-клеток в черную субстанцию (SN). В этой работе анализируется мышиная модель болезни Паркинсона, которая рекапитулирует активацию микроглии, инфильтрацию Т-клеток в SN, нейродегенерацию нигральных дофаминергических нейронов и двигательные нарушения. Эта мышиная модель болезни Паркинсона индуцируется стереотаксической доставкой аденоассоциированных вирусных векторов, кодирующих α-синуклеин дикого типа человека (AAV-hαSyn) в SN. Правильная доставка вирусных векторов в SN была подтверждена с помощью контрольных векторов, кодирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP). После этого оценивалось, как доза AAV-hαSyn, вводимая в SN, влияла на степень экспрессии hαSyn, потерю нигральных дофаминергических нейронов и двигательные нарушения. Кроме того, динамика экспрессии hαSyn, активации микроглии и инфильтрации Т-клеток определялась на протяжении всего времени развития заболевания. Таким образом, это исследование предоставляет критические временные точки, которые могут быть полезны для нацеливания на синуклеиновую патологию и нейровоспаление в этой доклинической модели болезни Паркинсона.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein

В этой работе анализируется векторная доза и время воздействия, необходимые для индуцирования нейровоспаления, нейродегенерации и двигательных нарушений в этой доклинической модели болезни Паркинсона. Эти векторы, кодирующие α-синуклеин человека, доставляются в черную субстанцию для повторения синуклеиновой патологии, связанной с болезнью Паркинсона.

Анализ мышиной модели болезни Паркинсона, индуцированной аденоассоциированными вирусными векторами, кодирующими α-синуклеин человека

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Внутричерепное Инъекция адено-ассоциированные вирусные векторы

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Обнаружение Neuritic бляшки при болезни Модель мыши Альцгеймера

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Методы для характеристики Спонтанное и Впечатлите вызванной Locomotion в Ротенон вызванной болезнью Паркинсона модели<em&gt; Drosophila</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Интрацеребровентрикулярное Вирусный Инъекция по неонатологии мозга мыши для устойчив и распространен нейронов трансдукции

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Производства, очистки и контроля качества для аденоассоциированный вирус основе векторов

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Конвекция Расширенная доставка оптогенетической адено-ассоциированной вирусного вектора в кору ресуса макаки под руководством онлайн МРТ изображений

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

В Vivo Прямое перепрограммирование резидентных глиальных клеток в интернейроны путем внутримозговой инъекции вирусных векторов

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Кохлеарная поверхность Подготовка в взрослой мыши

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Применение системы RatWalker для анализа походки в генетической крысиной модели болезни Паркинсона

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

6-гидроксидофаминовая крысиная модель болезни Паркинсона

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...