Name: analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Sebastián Valenzuela y a la Dra. Micaela Ricca por su valiosa asistencia veterinaria en nuestra instalación animal. Este trabajo fue apoyado por "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (a Fundación Ciencia & Vida), y el Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Este trabajo también fue financiado por las subvenciones FONDECYT-1210013 (a R.P.) y FONDECYT-1150766 (a F.C.) de la Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)" y MJFF-10332.01 (a R.P.) y MJFF-17303 (a F.C.) de la Fundación Michael J Fox para la Investigación del Parkinson.

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de intereses financieros o no financieros en competencia.

El modelo de neurodegeneración en ratones analizado aquí podría ayudar a estudiar muchos aspectos críticos involucrados en la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson, incluidos los mecanismos involucrados en la patología αSyn y la activación microglial, la participación del sistema inmune periférico en la regulación de la neuroinflamación y los mecanismos de neurodegeneración. Entre los mecanismos implicados en la patología αSyn se encuentran aquellos mecanismos subcelulares asociados a disfunción mitocondrial, lisosomal o proteasómica en presencia de una carga excesiva de αSyn en las neuronas dopaminérgicas del SN2. Es importante considerar que, además de la expresión de hαSyn inducida por la transducción mediada por AAV, el ratón endógeno αSyn también contribuye a la carga de la expresión total de αSyn. Los ratones transgénicos que sobreexpresan αSyn en ratones desarrollan una patología de sinucleína, neuropatología y deterioro motor similares a los modelos de ratón basados en la sobreexpresión de hαSyn32. En cuanto a la activación microglial, el presente modelo de ratón podría utilizarse para estudiar cómo diferentes actores moleculares y celulares como citoquinas, neurotransmisores, astrocitos, neuronas, la barrera hematoencefálica y las células T podrían regular la adquisición de fenotipos funcionales proinflamatorios o antiinflamatorios 8,10,11 . Este modelo también constituye una herramienta importante para estudiar el papel del sistema inmune periférico, incluyendo no solo a las células T sino también a los macrófagos, monocitos y neutrófilos, en los procesos de neuroinflamación y neurodegeneración de las neuronas nigrales 11,33,34. Finalmente, este modelo de ratón también representa un valioso sistema para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la neurodegeneración in vivo, incluidos los inducidos por procesos celulares internos, como el estrés oxidativo, los déficits de energía y los orgánulos dañados 2, o los ejercidos por actores externos, como los factores neurotóxicos producidos por células microgliales, astrocitos y células T citotóxicas8, 28,29,35.
Una limitación de este modelo de ratón es el estudio de cómo la agregación patológica de αSyn en localizaciones extracerebrales podría constituir las etapas iniciales en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson36. En este sentido, cada vez hay más pruebas que indican que, antes de la neurodegeneración de las neuronas nigrales y el deterioro motor, la patología αSyn comienza en la mucosa intestinal y el epitelio olfativo36 y, probablemente, también en la respuesta de las células T específicas de αSyn12. Después, los agregados αSyn migrarían a través del nervio vago al tronco encefálico, desencadenando la neuroinflamación y neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas12. Aunque el modelo AAV-hαSyn recapitula la mayoría de los aspectos de la enfermedad de Parkinson, no hay una participación evidente de la agregación patológica de αSyn en ubicaciones extracerebrales en este modelo. Un modelo alternativo que involucra la patología hαSyn apropiado para estudiar estos aspectos de la enfermedad de Parkinson podría ser ratones transgénicos que sobreexpresan hαSyn bajo el control del promotor Thy1, el modelo Thy1-SNCA 37, en el que el desarrollo de la enfermedad depende de la microbiota intestinal e implica un deterioro gastrointestinal evidente38.
Aunque es útil para el estudio de los diversos procesos asociados con la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson, el presente modelo de ratón implica pasos críticos que deben verificarse minuciosamente, incluida la entrega correcta de los vectores virales en las coordenadas espaciales correspondientes, la expresión selectiva de hαSyn en las neuronas (que depende del serotipo AAV y la construcción vectorial), y la dosis adecuada de AAV y el momento antes de analizar el fenotipo parkinsoniano. El análisis de la entrega adecuada de los vectores virales en el SN es necesario, ya que el uso de las coordenadas espaciales correctas del SN podría no ser suficiente cuando la aguja no es completamente recta, lo que a veces es imperceptible para el ojo humano. Además, la difusión de los vectores AAV depende del serotipoAAV 39. Por estas razones, es necesario realizar controles de calidad periódicos verificando la correcta entrega y difusión de los vectores AAV-GFP inyectados después de la observación de GFP en cortes cerebrales que contienen el área del SN.
En cuanto a la expresión selectiva de hαSyn en neuronas, en principio, la expresión de hαSyn podría ser modificada para ser controlada por un promotor selectivo para neuronas o, aún más preciso, selectivo para neuronas dopaminérgicas, como el uso del promotor TH en vectores AAV para inducir la expresión selectiva de genes en neuronas dopaminérgicas40 . Sin embargo, esta estrategia no funciona cuando lo que se busca es la sobreexpresión del gen de interés. Por esta razón, en el presente modelo, es esencial utilizar un promotor fuerte (un promotor que induce una alta expresión del gen aguas abajo) y serotipos AAV con tropismo neuronal. En este estudio, el promotor CBA se utilizó como un promotor fuerte para inducir la sobreexpresión de hαSyn, y el serotipo AAV5 se utilizó para el vector viral. Este serotipo se ha utilizado antes para transducir neuronas de ratón y rata41,42. Aquí, los resultados demostraron que, 12 semanas después de la administración de AAV5-GFP en el SN de ratones, la fluorescencia verde estaba selectivamente presente en el lado ipsilateral tanto del SN como del cuerpo estriado (Figura 1), lo que indica la transducción eficiente de las neuronas de la vía nigrostriatal.
Otro aspecto crítico de este modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson es el punto de tiempo requerido para analizar un proceso particular después de la cirugía. En este sentido, este trabajo muestra un estudio cinético de diferentes procesos implicados en la patología. Dado que los puntos de tiempo clave cambian con la dosis de genomas virales administrada por ratón, el serotipo de AAV utilizado, o incluso con el lote de AAV utilizado, se realizó primero un análisis dosis-respuesta de la cantidad de AAV-αSyn requerida para inducir una pérdida significativa de neuronas TH + y deterioro motor. Estudios previos han demostrado un deterioro motor significativo y una pérdida de neuronas TH+ de la vía nigrostriatal después de 12 semanas de inyecciones de AAV-αSyn en ratones a dosis que van desde 6 x 108–3 x 1010 genomas virales por ratón 16,17,30,31. En consecuencia, la dosis de AAV-hαSyn utilizada para inducir la expresión de hαSyn en la vía nigrostriatal, la pérdida de neuronas TH + y el deterioro motor en ratones varió de 1 x 108-1 x 1010 genomas virales por ratón. Por otra parte, para controlar que la pérdida de neuronas TH+ y el deterioro motor fueran inducidos por la sobreexpresión de hαSyn en el SN y no por la infección AAV de neuronas del SN, se incluyeron grupos control en los que se entregó unilateralmente la codificación AAV para un gen reportero (AAV-eGFP) en el SN de ratones y se determinó la neurodegeneración y el deterioro motor. Los resultados mostraron que, 12 semanas después de la cirugía estereotáxica, 1 x10 10 genomas virales por ratón fue una dosis adecuada de AAV5-hαSyn, ya que los ratones que recibieron esta carga viral mostraron hαSyn significativo en la vía nigrostriatal (Figura 2 y Figura 3), pérdida de neuronas TH + (Figura 4) y deterioro motor (Figura 5). Por el contrario, las dosis más bajas de AAV5-hαSyn (1 x 108 genomas virales por ratón y 1 x 109 genomas virales por ratón) no fueron lo suficientemente fuertes como para alcanzar cambios significativos en todos estos parámetros juntos (Figuras 2-4). Cabe destacar que la administración de AAV-GFP a 1 x 1010 genomas virales por ratón indujo un grado bajo (~20%), pero significativo de pérdida de neuronas TH+ de neuronas dopaminérgicas nigral (Figura 4A, B). Este resultado concuerda con observaciones anteriores utilizando este modelo41 y es probablemente la consecuencia de un bajo nivel de neuroinflamación inducida por la administración de vectores AAV en el SN. Sin embargo, el grado de pérdida de neuronas TH+ fue significativamente mayor en ratones que recibieron AAV5-hαSyn en comparación con aquellos que recibieron la misma dosis de AAV-GFP (Figura 4C). Cabe destacar que la cinética de la expresión de hαSyn no solo depende de la eficiencia de la transducción, sino también de la extensión de la difusión de AAV39. Dado que la difusión de AAV depende del serotipo AAV, los puntos de tiempo clave precisos en este modelo animal pueden variar cuando se utiliza otro serotipo AAV diferente de AAV5.
Posteriormente, se realizó un análisis cinético utilizando 1 x 1010 genomas virales por ratón para determinar los puntos de tiempo clave en este modelo de ratón. Dado que la evidencia actual ha mostrado algunos síntomas tempranos que aparecen antes del deterioro motor, lo que permitiría el diagnóstico precoz de la enfermedad de Parkinson 43,44, estos experimentos buscaron encontrar el punto de tiempo en el que la expresión de hαSyn ya era evidente pero en ausencia de deterioro motor. Los resultados muestran que el inicio de la expresión de hαSyn en el SN fue a las 5 semanas después de la administración estereotáxica de AAV-hαSyn (Figura 6). Este punto temporal constituye un punto temporal interesante para comenzar a administrar terapias adaptadas para detener los procesos neuroinflamatorios y neurodegenerativos. Otros puntos de tiempo clave determinados aquí fueron los momentos pico para dos eventos críticos asociados con el proceso de neuroinflamación: el momento en que la microglía alcanza el grado máximo de activación y el tiempo de infiltración máxima de células T en el SN. Los resultados mostraron una curva con tendencia que alcanza dos ondas de activación microglial máxima, la primera a las 10 semanas después de la cirugía y la segunda a las 15 semanas después de la cirugía (Figura 7). El análisis cinético de la infiltración de células T mostró el momento pico de infiltración de Treg en el SN a las 11 semanas después de la cirugía estereotáxica (Figura 8). Sorprendentemente, no se detectaron células T efectoras (CD4+ Foxp3-) infiltrándose en el SN durante el período de tiempo analizado (semanas 8-13 después de la cirugía). En conjunto, estos resultados sugieren un marco de tiempo adecuado para comenzar a administrar terapias orientadas a detener el proceso de neuroinflamación y atenuar la infiltración de células T en el SN utilizando este modelo preclínico, que oscila entre la semana 5 después de la cirugía (el inicio de la sobreexpresión de hαSyn) y la semana 10 después de la cirugía (la primera ola de neuroinflamación e infiltración de células T) (Figura 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig09.jpg"> Figura 9: Resumen de los puntos de tiempo clave encontrados para este modelo animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Después de la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson es la segunda enfermedad neurodegenerativa más prevalente en todo el mundo. Las neuronas primarias afectadas en la enfermedad de Parkinson son las de la vía nigrostriatal, que producen dopamina y controlan el movimiento voluntario. Como consecuencia, el síntoma más característico asociado a este trastorno es la discapacidad motora. Esta patología también implica la deposición de agregados de proteínas en el cerebro, que están compuestos principalmente de α-sinucleína (αSyn)1, una proteína citosólica asociada a terminales presinápticos. La evidencia ha demostrado que la generación de inclusiones patogénicas de αSyn se desencadena por un plegamiento incorrecto o por algunas modificaciones post-traduccionales de esta proteína2.
En particular, se ha establecido una estrecha relación entre la patología αSyn y la pérdida de neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal en la enfermedad de Parkinson humana y modelos animales 3,4. Comprender cómo se generan los agregados αSyn y cómo inducen la muerte neuronal representa un desafío significativo en el campo. Un grupo creciente de estudios ha demostrado que, al aumentar el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial es una de las principales causas de la generación de agregados αSyn2. De hecho, varios genes asociados con el riesgo de enfermedad de Parkinson codifican proteínas involucradas en la función, morfología y dinámica mitocondrial 5,6. Además, la disfunción lisosomal, que resulta en la acumulación de mitocondrias disfuncionales y αSyn mal plegadas, constituye otro evento importante que promueve la generación de agregados αSyn7.
La evidencia emergente ha indicado que, una vez que los agregados de αSyn se depositan en el cerebro, estas proteínas patógenas estimulan receptores tipo toll (TLR) en la microglía, desencadenando así la activación microglial y un ambiente inflamatorio inicial en la sustancia negra (SN)8,9. Además, la evidencia indica que los agregados de αSyn son capturados y presentados por las células presentadoras de antígenos a las células T, induciendo una respuesta inmune adaptativa específica a αSyn10,11. Estas células T específicas de αSyn se infiltran posteriormente en el cerebro y son reestimuladas por microglía activada, promoviendo así la secreción de factores neurotóxicos que evocan la muerte neuronal 9,10. Curiosamente, varias líneas de evidencia han sugerido que los agregados αSyn se generan primero en el sistema nervioso entérico y luego se transportan a través del nervio vago hasta el tronco encefálico12.
Varios modelos animales de la enfermedad de Parkinson se han utilizado durante muchos años, incluidos los inducidos por la administración de sustancias neurotóxicas (es decir, 6-hidroxidopamina, paraquat, rotenona, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) y aquellos que involucran condiciones genéticas (es decir, mutante α-sinucleína, quinasa de repetición 2 rica en leucina mutante)13 . A pesar de que los modelos que involucran neurodegeneración inducida por neurotoxinas replican algunos aspectos de la enfermedad de Parkinson, ninguno de ellos recapitula todos los aspectos esenciales de la enfermedad o no es progresivo13. Por otro lado, aunque los modelos genéticos de ratón que implican la expresión de versiones mutantes de la quinasa 2 repetida rica en leucina, las versiones mutantes de α-sinucleína o la sobreexpresión de α-sinucleína humana de tipo salvaje dan lugar a un deterioro motor y, en algunos casos, también al desarrollo de sinucleinopatía, no reproducen la neurodegeneración prominente de las neuronas dopaminérgicas nigrales, que es un aspecto esencial de la enfermedad de Parkinson13, 14. Un tercer tipo de modelo animal de neurodegeneración ha logrado satisfacer la mayoría de los aspectos esenciales de la enfermedad de Parkinson, la entrega estereotáxica de vectores virales adenoasociados (AAV) que codifican la α-sinucleína humana (AAV-hαSyn)14,15. Es importante destacar que los AAV permiten la transducción de neuronas con alta eficacia y a largo plazo en el cerebro adulto de los mamíferos. Además, se ha demostrado que la administración estereotáxica de AAV-hαSyn en el SN reproduce muchos de los aspectos esenciales de la enfermedad, incluida la patología αSyn, la activación microglial, la neurodegeneración y el deterioro motor 16,17,18,19,20. Este estudio presenta un análisis de cómo la dosis del vector viral y el tiempo después de la entrega del vector viral afectan la extensión de la expresión de hαSyn, la neurodegeneración y la neuroinflamación en la vía nigrostriatal, así como el grado de deterioro motor en el modelo de ratón de la administración estereotáxica unilateral de hαSyn en el SN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS AND ANIMAL FOOD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3-GFP C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No:&#160;023800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Rodent Diet</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>Rodent Diet 5001</td>
			<td>Standard Rodent diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIRAL VECTORS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-&#945;Syn</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 10E13 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-eGFP</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANESTHETICS AND ANALGESICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>218082</td>
			<td>1% for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>CHE30</td>
			<td>70 mg/Kg&#160; for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>VE2L9117</td>
			<td>For before transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>DPH134</td>
			<td>30 mg/Kg every 24 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Centrovet</td>
			<td>EHL40</td>
			<td>9 mg/kg for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam test</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>S2800 Coolpix</td>
			<td>For recording the beam test performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Used for IHC analysis (section 4.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI8</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Standard Stereotaxic, mouse</td>
			<td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td>
			<td>51500</td>
			<td>stereotaxic frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>C-flex L/S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-RFL-T</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture</td>
			<td>Sylkam&#174;, B Braun</td>
			<td>C0760171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 100 U</td>
			<td>BD</td>
			<td>324918</td>
			<td>For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>HA-7641-01</td>
			<td>For viral vector innoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUFFERS AND REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviden, Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>189728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotrotection buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20% glycerine and 2% DMSO in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount -G T</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>5000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.125 M, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase inactivating buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.03% H2O2 in methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>111065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-Iba-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR16588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism</td>
			<td>6.0</td>
			<td>Fos stats analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Leica microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProgRes Capture Pro</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Olympus microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLC media player</td>
			<td>VideoLAN Organization</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For analysis of behavioural tests</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que implica la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal y, en consecuencia, la pérdida progresiva del control de los movimientos voluntarios. Este proceso neurodegenerativo se desencadena por la deposición de agregados de proteínas en el cerebro, que están constituidos principalmente por α-sinucleína. Varios estudios han indicado que la neuroinflamación es necesaria para desarrollar la neurodegeneración asociada con la enfermedad de Parkinson. En particular, el proceso neuroinflamatorio implica la activación microglial, así como la infiltración de células T periféricas en la sustancia negra (SN). Este trabajo analiza un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson que recapitula la activación microglial, la infiltración de células T en el SN, la neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas nigral y el deterioro motor. Este modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson es inducido por la administración estereotáxica de vectores virales adenoasociados que codifican la α-sinucleína de tipo salvaje humano (AAV-hαSyn) en el SN. La correcta entrega de vectores virales en el SN se confirmó utilizando vectores de control que codifican la proteína fluorescente verde (GFP). Posteriormente, se evaluó cómo la dosis de AAV-hαSyn administrada en el SN afectó el grado de expresión de hαSyn, la pérdida de neuronas dopaminérgicas nigral y el deterioro motor. Además, la dinámica de la expresión de hαSyn, la activación microglial y la infiltración de células T se determinaron a lo largo del curso del desarrollo de la enfermedad. Por lo tanto, este estudio proporciona puntos de tiempo críticos que pueden ser útiles para atacar la patología de la sinucleína y la neuroinflamación en este modelo preclínico de la enfermedad de Parkinson.

Validar la correcta entrega de vectores AAV en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal Para estudiar los procesos de neuroinflamación, neurodegeneración y deterioro motor promovido por la patología de la sinucleína, se utilizó un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson inducida por la administración estereotáxica unilateral de AAV que codifica hαSyn en el SN 16,17,30,31 (ver el diseño experimental en figura suplementaria 1 ). Para validar la correcta entrega de vectores AAV en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal, se inyectó AAV que codifica GFP (AAV-GFP) en el SN, y 12 semanas después, se analizó la fluorescencia GFP y la inmunorreactividad tirosina hidroxilasa (TH) en el SN y el cuerpo estriado por inmunofluorescencia. La fluorescencia asociada a GFP se observó exclusivamente en el lado ipsilateral, y hubo una colocalización significativa con inmunorreactividad TH tanto en el SN como en el estriado, lo que indica la correcta entrega de vectores AAV en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig01.jpg"> Figura 1: Análisis de la administración de AAV-GFP en la vía nigrostriatal. Los ratones recibieron AAV-GFP (1 x 1010 vg / ratón) y 12 semanas después fueron sacrificados, y TH se inmunoteñó en (A) el SN (las barras de escala son 118 μm) y (B) el cuerpo estriado (las barras de escala son 100 μm). La fluorescencia asociada a TH y GFP se analizó mediante microscopía de epifluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se muestran imágenes representativas de tinción combinada o simple de TH (rojo), GFP (verde) y DAPI (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Establecimiento de la dosis del vector viral administrado para inducir neurodegeneración y deterioro motor en el modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson inducida por AAV-hαSyn Para probar la dosis de AAV-hαSyn requerida para inducir una sobreexpresión significativa de hαSyn que promueve la neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas nigral, se inyectaron diferentes dosis (1 x 108 genomas virales [vg]/ratón, 1 x 109 vg/ratón, o 1 x 1010 vg /ratón) de AAV-hαSyn, y 12 semanas después, se evaluó la inmunorreactividad hαSyn y el grado de inmunorreactividad TH en la vía nigrostriatal. Aunque la inmunorreactividad hαSyn fue evidente con todas las dosis probadas en el SN (Figura 2), solo los ratones que recibieron 1 x 1010 vg/ratón presentaron inmunorreactividad hαSyn evidente en el cuerpo estriado (Figura 3). Además, los ratones que recibieron 1 x10 10 vg / ratón de AAV-hαSyn mostraron una pérdida significativa de neuronas dopaminérgicas en el SN (Figura 4A, B). Aunque los ratones que recibieron 1 x10 10 vg/ratón de AAV-GFP mostraron un bajo grado (~20%) de pérdida neuronal (Figura 4A, B), los ratones que recibieron la misma dosis de AAV-hαSyn presentaron un grado significativamente mayor de neurodegeneración de neuronas dopaminérgicas nigral (Figura 4C). En consecuencia, se realizaron más experimentos utilizando 1 x 1010 vg / ratón de AAV-hαSyn. Además, se determinó el grado de deterioro motor en ratones que recibieron diferentes dosis de AAV-hαSyn mediante el uso de la prueba de haz (Figura 5A), como se describió antes25. Se detectó una reducción significativa en el rendimiento del motor exclusivamente con 1 x10 10 vg/ratón de AAV-hαSyn en la prueba de haz tanto al comparar el número de errores cometidos por las almohadillas derecha e izquierda (Figura 5B) como al comparar el número total de errores de ratones que recibieron AAV-hαSyn en comparación con ratones que recibieron el vector de control AAV-GFP (Figura 5C). En consecuencia, se realizaron más experimentos utilizando 1 x 1010 vg / ratón de AAV-hαSyn.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig02.jpg"> Figura 2: Análisis de la expresión de α-sinucleína humana en el SN de ratones tratados con diferentes dosis de AAV-hαSyn. Los ratones recibieron AAV-hαSyn en (A) 1 x 1010 vg/ratón, (B) 1 x 109 vg/ratón, o (C) 1 x 108 vg/ratón y 12 semanas después fueron sacrificados, y la expresión de hαSyn se analizó por inmunofluorescencia en el SN mediante microscopía de epifluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se muestran imágenes representativas de tinción combinada o simple de hαSyn (rojo) o DAPI (azul). Las barras de escala son de 118 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig03.jpg"> Figura 3: Análisis de la expresión de α-sinucleína humana en el cuerpo estriado de ratones tratados con diferentes dosis de AAV-hαSyn. Los ratones recibieron AAV-hαSyn en (A) 1 x 1010 vg /ratón, (B) 1 x 109 vg/ratón, o (C) 1 x 108 vg/ratón) y 12 semanas después fueron sacrificados, y la expresión de hαSyn se analizó por inmunofluorescencia en el cuerpo estriado mediante microscopía de epifluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se muestran imágenes representativas de tinción combinada o simple de hαSyn (rojo) o DAPI (azul). Las barras de escala son de 100 μm. El inserto en la esquina superior derecha de las imágenes combinadas muestra un área de interés en un aumento más alto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig04.jpg"> Figura 4: Pérdida de neuronas dopaminérgicas del SN en ratones tratados con diferentes dosis de AAV-hαSyn o vector control. Los ratones recibieron AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/ratón, 1 x 109 vg/ratón, o 1 x 108 vg/ratón) o AAV-GFP (1 x 1010 vg/ratón) y 12 semanas después fueron sacrificados, y la TH fue analizada en el SNpc por inmunohistoquímica. (A) Imágenes representativas. Barras de escala, 100 μm. (B,C) La densidad de neuronas se cuantificó como el número de neuronas TH+/mm2. Los datos representan la media ± SEM. n = 3-8 ratones por grupo. (B) Se realizó una comparación de los lados ipsilateral con los contralaterales utilizando la prueba t de Student emparejada de dos colas. (C) Se realizó una comparación de los lados ipsilaterales de ratones que recibieron1 x 10 10 vg/ratón de AAV-hαSyn o AAV-GFP. (B,C) Mientras que las barras blancas indican la cuantificación de las neuronas TH+ en el lado ipsilateral de los ratones que reciben AAV-hαSyn, las barras verdes indican la cuantificación de las neuronas TH+ en el lado ipsilateral de los ratones que reciben AAV-GFP. Las barras grises indican la cuantificación de las neuronas TH+ en el lado contralateral del grupo correspondiente. Las comparaciones se realizaron mediante una prueba t de Student de dos colas sin aparear. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig05.jpg"> Figura 5: Análisis del rendimiento motor en ratones tratados con diferentes dosis de AAV-hαSyn. Los ratones recibieron diferentes dosis (1 x 1010 vg / ratón, 1 x 109 vg / ratón, o 1 x 108 vg / ratón) de AAV-hαSyn o AAV-GFP, y 12 semanas después, el rendimiento del motor se evaluó mediante la prueba de haz. (A) Imagen de un ratón caminando sobre la viga. (B) El número de errores cometidos por miembros izquierdos (contralaterales) versus miembros derechos (ipsilaterales) se cuantificó en los grupos de ratones que recibieron AAV-hαSyn. (C) Se comparó el número total de errores entre diferentes grupos experimentales que recibieron la misma dosis de AAV-hαSyn o AAV-GFP. Los datos representan la media ± SEM. n = 3-5 ratones por grupo. Las comparaciones fueron realizadas por (B) una prueba t de Student de dos colas emparejada o por (C) una prueba t de Student de dos colas no emparejada. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Establecimiento de la cinética del modelo de enfermedad de Parkinson inducido por AAV-αSyn Después de determinar la dosis adecuada de AAV-hαSyn utilizada para inducir un nivel significativo de neurodegeneración y deterioro motor, se realizaron experimentos para definir el inicio de la sobreexpresión de hαSyn. Para este propósito, los ratones fueron tratados con 1 x 1010 vg / ratón de AAV-hαSyn o cirugía simulada. El grado de expresión de hαSyn se analizó en el SN una vez por semana durante las semanas 2-5 después de la cirugía estereotáxica (ver el diseño experimental en la Figura Suplementaria 2). Los resultados muestran que, a pesar de que la expresión de hαSyn se detectó en niveles bajos tan pronto como 2 semanas después de la cirugía, los grupos de hαSyn aparecieron en la semana 5 después de la cirugía estereotáxica (Figura 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig06.jpg"> Figura 6: Análisis del curso temporal de la expresión de α-sinucleína humana en el SN de ratones tratados con AAV-hαSyn. Los ratones recibieron AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/ratón) o simplemente la cirugía estereotáxica simulada, y la expresión de hαSyn en el SN se analizó (A) 2 semanas, (B) 3 semanas, (C) 4 semanas, o (D) 5 semanas después mediante inmunofluorescencia mediante microscopía de epifluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se muestran imágenes representativas de tinción combinada o simple de hαSyn (rojo) o DAPI (azul). Barras de escala, 100 μm. El inserto en la esquina superior derecha de las imágenes combinadas muestra un área de interés en un aumento más alto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Posteriormente, se realizaron experimentos para determinar los puntos de tiempo adecuados para analizar la neuroinflamación y la infiltración de células T en el sistema nervioso central (SNC) después de la administración estereotáxica de AAV-hαSyn. Para determinar el pico de activación microglial después del tratamiento de ratones con AAV-hαSyn, se evaluó la extensión de las células que expresan altos niveles de Iba1 en el cuerpo estriado una vez por semana durante las semanas 2-15 después de la cirugía estereotáxica. Los resultados muestran un aumento significativo en la activación microglial del lado ipsilateral en comparación con el lado contralateral de ratones 15 semanas después del tratamiento con AAV-hαSyn (Figura 7). El número de células Treg (CD4+ Foxp3+) infiltradas en el SNpc también se evaluó en diferentes puntos temporales después de la administración estereotáxica de AAV-hαSyn por inmunofluorescencia seguida de la observación de microscopía confocal. Los resultados muestran que el pico de infiltración de Treg en el SNpc fue a las 11 semanas después de la cirugía, mientras que la extensión de Treg infiltrándose en esta área del cerebro fue menor en la semana 8 o la semana 13 después de la cirugía (Figura 8). No se detectaron linfocitos T CD4+ infiltrados en el cuerpo estriado (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados indican que, utilizando 1 x 1010 vg/ratón de AAV-hαSyn, el punto de tiempo más adecuado para analizar la neuroinflamación es la semana 15 después de la cirugía estereotáxica, mientras que un punto de tiempo adecuado para analizar la infiltración de células T en el SNC parece ser la semana 11 después del tratamiento con AAV-hαSyn.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig07.jpg"> Figura 7: Análisis del curso temporal de la activación microglial en ratones inoculados con AAV-hαSyn. Los ratones recibieron AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/ratón), y la activación microglial se evaluó mediante análisis inmunohistoquímico de Iba1 en el cuerpo estriado en diferentes puntos temporales después de la cirugía. (A) Se muestran imágenes generales representativas del análisis inmunohistoquímico de Iba1 de ratones sacrificados 5 semanas, 10 semanas o 15 semanas después de la inoculación con AAV-hαSyn. Barras de escala, 110 μm. (B) La densidad de la microglía activada se cuantificó como el número de células que expresan altos niveles de Iba1 y forma ameboide por área. Los datos representan la media ± SEM. n = 3 ratones por grupo. Se utilizó una prueba t de Student pareada de dos colas para determinar las diferencias estadísticas entre iba1 ipsilateral y contralateral en cada grupo. *p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig08.jpg"> Figura 8: Análisis del curso temporal de la infiltración de linfocitos T CD4+ en el SN de ratones inoculados con AAV-hαSyn. Los ratones reporteros Foxp3gfp recibieron AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/ ratón). La presencia de células T CD4+ que expresan Foxp3 y la presencia de neuronas TH+ se analizaron en diferentes puntos temporales (semana 8, semana 11 y semana 13 después de la cirugía) en el SN por inmunofluorescencia. (A) Se muestran imágenes representativas para la inmunotinción única o la fusión. Barras de escala, 100 μm. (B) Se cuantificó el número de células T CD4+ Foxp3+ por área en el SN. Los datos representan el SEM medio ± de 3 ratones por grupo. *p<0.05, células T de Foxp3+ CD4+ ipsilaterales versus contralaterales mediante la prueba t de Student de dos colas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Diseño experimental para evaluar el efecto de diferentes dosis de vectores AAV sobre la patología de la sinucleína, la neurodegeneración y el deterioro motor. Los ratones machos C57BL/6 de tipo salvaje fueron anestesiados y recibieron inoculación estereotáxica de diferentes dosis (1 x 10 10 vg/ratón, 1 x 109 vg/ratón, o 1 x 108 vg/ratón) de AAV codificando α-sinucleína humana (AAV-hαSyn) o eGFP (AAV-GFP) bajo el control del promotor CBA en la sustancia negra derecha (SN). Después de 12 semanas, la expresión de GFP y hαSyn en el SN y el cuerpo estriado (Str) se evaluaron por inmunofluorescencia (IF), las células de tirosina hidroxilasa positiva (TH +) se cuantificaron mediante inmunohistoquímica (IHC) en el SN, y el rendimiento motor se evaluó mediante la prueba de haz. El número de ratones en cada grupo experimental se indica entre paréntesis. * indica los grupos en los que un ratón murió antes de los análisis. Cada análisis indica entre paréntesis el número de la figura del cuerpo del papel donde se muestran los resultados correspondientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Diseño experimental para determinar la cinética de la infiltración de células T, la neuroinflamación y la expresión de hαSyn. Los ratones reporteros Foxp3gfp fueron anestesiados y recibieron inoculación estereotáxica de AAV (1 x 10 10 vg / ratón) que codifica α-sinucleína humana (AAV-hαSyn) bajo el control del promotor CBA en la sustancia negra derecha (SN) o cirugía simulada (PBS). Los ratones fueron sacrificados en diferentes puntos temporales, y la expresión de hαSyn en el SN y el cuerpo estriado se evaluó mediante inmunofluorescencia (IF), GFP (Foxp3), CD4 y las células de tirosina hidroxilasa positiva (TH+) se cuantificaron por IF en el SN, y la expresión de Iba1 se analizó mediante inmunohistoquímica (IHC) en el cuerpo estriado (Str). Se indica el número de ratones en cada grupo experimental. Se indica el rango de puntos de tiempo incluidos en cada análisis. Cada análisis indica entre paréntesis el número de la figura del cuerpo del papel donde se muestran los resultados correspondientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein

Este trabajo analiza la dosis del vector y el tiempo de exposición necesarios para inducir neuroinflamación, neurodegeneración y deterioro motor en este modelo preclínico de la enfermedad de Parkinson. Estos vectores que codifican la α-sinucleína humana se administran en la sustancia negra para recapitular la patología de la sinucleína asociada con la enfermedad de Parkinson.

Análisis del modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson inducido por vectores virales adenoasociados que codifican la α-sinucleína humana

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

El objetivo general de este procedimiento es reproducir la mayoría de los aspectos esenciales de la enfermedad de Parkinson en un modelo animal. La entrega estereotáxica de vectores virales adenoasociados, codificando la sinucleína humana en la sustancia negra. La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que implica la muerte de la neurona dopaminérgica, en la vía nigrostriatal, y en consecuencia, la progresión de la pérdida de control del movimiento voluntario.Este proceso neurodegenerativo se acompaña, por la deposición de agregados de proteínas en el cerebro, que están constituidas principalmente por sinucleína. La evidencia emergente ha indicado que los agregados de sinucleína pueden estimular receptores similares a toll en la microglía, lo que desencadena la inflamación neural en la sustancia negra. Además, la evidencia indica que los agregados de sinucleína pueden ser capturados y presentados, por las células presentadoras de antígenos a las células T, induciendo una respuesta inmune adaptativa específica a la sinucleína.La administración estereotáxica de vectores virales adenoasociados que codifican la sinucleína humana en la sustancia negra, ha demostrado reproducir muchos aspectos esenciales de la enfermedad, incluida la patología de la sinucleína, la activación microglial, la activación de células T, la neurodegeneración y el deterioro motor. Este estudio presenta un análisis de cómo un vector viral y el tiempo después de la entrega del vector viral, afecta la extensión en la expresión de sinucleína humana, neurodegeneración y neuroinflamación en la vía nigrostriatal, así como el grado de deterioro motor en un modelo de ratón de administración estereotáxica unilateral de sinucleína humana en la sustancia negra. Para mantener un ambiente aséptico, use ropa quirúrgica adecuada durante toda la cirugía, incluyendo cubiertas de zapatos, máscara de cirugía, barrera sanitaria, guantes y gorra de cirugía.Rocíe etanol sobre el ratón y todo el material quirúrgico, para mantener el ambiente aséptico. Para inducir una analgesia, inyecte carprofeno por vía subcutánea cada 12 horas, comenzando una hora antes de la cirugía y continuando hasta tres días después de la cirugía. Para anestesiar al ratón, coloque al animal en una cámara de inducción.Abra el flujo de isoflurano a una velocidad del 0,5% y luego aumente lentamente hasta un 5% durante aproximadamente cinco minutos hasta que el ratón haya perdido su reflejo de enderezamiento. Retire al animal de la cámara de inducción. Transfiera inmediatamente al animal a un circuito sin rerespiración con un cono nasal del tamaño adecuado.Mantener la anestesia del ratón, con isoflurano al 1% durante todo el tiempo de la cirugía. Confirme que el ratón está completamente anestesiado pellizcando sus colas y patas. Cuando el ratón no reacciona al pellizcar la cola y las patas, significa que el ratón está completamente anestesiado.Afeitar la cabeza del ratón con tijeras. Limpiar la piel del ratón con un hisopo de algodón con clorhexidina al 2% y eliminar todo el vello. Fije el cabezal del ratón en el marco estereotáxico.Coloque un protector corneal en ambos ojos de ratón, usando un hisopo de algodón. Para prevenir la inducción de estrés en otros roedores, evite la presencia de cualquier otro ratón en la sala de cirugía. Limpie la cabeza del ratón con tres rondas de clorhexidina al 2% seguido de etanol al 70% Exponga el cráneo utilizando material quirúrgico, y haga un orificio delgado con un taladro en coordenadas anteroposteriores de 2,8 mm, y mediolaterales de 1,4 mm, con respecto a la línea medial.Coloque la aguja de una jeringa de 10 microlitros en el orificio, y mueva la aguja dentro del cerebro lentamente, hasta llegar a 7,2 mm dorsoventral, con respecto a la duramadre. Deje la aguja en la posición final durante dos minutos, para permitir que el tejido se asiente un poco, y luego inyecte un microlitro de vectores virales en la sustancia negra derecha, a una velocidad de 0,2 microlitros cada 30 segundos. Deje la aguja en la misma posición durante cinco minutos después de la administración de vectores virales y luego retírela lentamente.Cierre la herida con una sutura de seda estéril. Coloque el ratón en la jaula de la casa, precalentado colocándolo sobre un colchón eléctrico caliente. 12 semanas después de la cirugía estereotáxica, evalúe el rendimiento motor, utilizando una versión simplificada de la prueba de haz, descrita anteriormente.Para este propósito, use una viga horizontal de 25 cm de largo y 3 cm de ancho. La superficie de la viga debe estar cubierta por una rejilla metálica con cuadrados de un centímetro y elevada un centímetro por encima de la viga. Haga un video del ratón, mientras atraviesa el haz de superficie de la rejilla, desde un extremo hasta el extremo opuesto del haz, donde se encuentra la jaula doméstica.Entrene el ratón durante dos días, antes de la determinación del rendimiento del motor. El primer día, entrena al ratón para que camine a través de la viga cinco veces, sin la rejilla. En el segundo día, entrene al ratón para que camine a través de la viga, en presencia de la rejilla cinco veces.Al tercer día, evalúe el rendimiento del motor. Para ello, cuantifica el número de errores cometidos, por las patas izquierdas o por las patas derechas por separado, viendo los vídeos en modo cámara lenta. Para anestesiar al ratón, inyecte una mezcla de ketamina y xilazina por vía intraperitoneal.Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, abra el tórax con material quirúrgico y exponga el corazón. Luego inserte una aguja de punta plana en el ventrículo izquierdo del corazón. Al acoplar la aguja a una tubería, perfunda 50 mililitros de solución salina tampón de fosfato, a una velocidad de 9,5 mililitros por minuto, utilizando una bomba peristáltica.Retire el cerebro con tijeras y pinzas, y luego fíjelo por inmersión, en cinco mililitros de paraformaldehído al 4%, en solución salina tampón de fosfato. Después, coloque el cerebro fijo, en 15 mililitros de sacarosa al 30% durante 48 horas. Luego coloque el cerebro en cuatro mililitros de solución de crioprotección y guarde el cerebro a 80 grados, o úselo inmediatamente en el siguiente paso.Para obtener rodajas estriatales, corte el cerebro en secciones de 40 micrómetros de espesor, comenzando en 1.34 mm y terminando en 0.26 mm. Cosecha cada rebanada en un criotubo de dos mililitros, siguiendo el orden anteroposterior. Para realizar análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes en el cuerpo estriado, elija cinco secciones estriatales coronales tomadas a intervalos uniformes, que cubran toda la extensión rostrocaudal del núcleo.Para validar la correcta entrega de vectores virales en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal, se inyectaron vectores que codifican GFP, en la sustancia negra, y 12 semanas después, se analizaron la fluorescencia GFP y la inmunorreactividad tirosina hidroxilasa en la sustancia negra y estriado por inmunofluorescencia. La fluorescencia asociada a GFP, se localizó exclusivamente en el sitio ipsilateral, y se observó una colocalización significativa con inmunorreactividad tirosina hidroxilasa tanto en la sustancia negra como en el cuerpo estriado, lo que indica la correcta entrega de vectores virales en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal. Para probar la dosis de vectores, que codifica la sinucleína requerida, para inducir una sobreexpresión significativa de sinucleína humana que promueve la neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas nigral, se inyectaron diferentes dosis de los vectores.Y 12 semanas después, la inmunorreactividad de la sinucleína humana y el grado de inmunorreactividad de la tirosina hidroxilasa se probaron en la vía nigrostriatal. La inmunorreactividad de la sinucleína humana fue evidente, con todas las dosis probadas en la sustancia negra. Sin embargo, solo los ratones que recibieron de 10 a los 10 genomas virales por ratón, presentaron inmunorreactividad evidente de la sinucleína humana, en el cuerpo estriado.Los ratones que recibieron de 10 a los 10 genomas virales por ratón de vectores que codifican la sinucleína humana, mostraron una pérdida significativa de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Aunque los ratones que recibieron la misma dosis de vectores que codifican GFP, mostraron un bajo grado de pérdida neuronal, estos ratones presentaron un grado significativamente menor de neurodegeneración, en comparación con los ratones que recibieron vectores, codificando sinucleína humana. Utilizando la prueba de haz, se detectó una reducción significativa en el rendimiento motor exclusivamente en aquellos ratones, que recibieron de 10 a 10 genomas virales por ratón de vectores que codifican sinucleína humana, al comparar el número de errores cometidos por las patas derecha e izquierda, o al comparar el número total de errores, de ratones que reciben vectores que codifican sinucleína humana, con esos ratones recibiendo el vector de control.Para definir el inicio de la expresión de sinucleína humana, los ratones fueron tratados con 10 a los 10 genomas virales por ratón, de vectores que codifican sinucleína humana, o cirugía simulada, y se analizó el alcance de la expresión de sinucleína humana en la sustancia negra, una vez a la semana, durante las semanas dos a cinco después de la cirugía estereotáxica. Los resultados muestran que la expresión de sinucleína humana comenzó a ser evidente en la semana cinco después de la cirugía estereotáxica. Para determinar el pico de activación microglial, se cuantificó la extensión de las células que expresan altos niveles de Iba1, en el cuerpo estriado de ratones, durante las semanas 2-15 después de la cirugía.Los resultados muestran un aumento significativo en la activación microglial del lado ipsilateral, en comparación con el lado contralateral de los ratones, 15 semanas después de la inoculación viral. El número de células T reguladoras infiltradas en la nigra sustancial se analizó en diferentes puntos temporales, después de la cirugía estereotáxica por inmunofluorescencia, seguida de la observación de microscopía confocal. El pico de infiltración de células T reguladoras en la sustancia negra se observó en la semana 11 después de la cirugía.El modelo de ratón de neurodegeneración analizado aquí, representa un modelo útil para estudiar números de aspectos clave de implicación en la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson. Mecanismos de participación implicados en la patología de la sinucleína, la activación microglial, la implicación del sistema inmune periférico, en la neuroinflamación, y los mecanismos de neurodegeneración Una dosis adecuada de vector viral adenoasociado, subtipo cinco que codifica la sinucleína humana para inducir neurodegeneración, neuroinflamación, infiltración de células T y deterioro motor, es de 10 a los 10 genomas virales por ratón. Este estudio muestra, que cinco semanas después de la cirugía estereotáxica, constituye un punto de tiempo clave, en el que la expresión de sinucleína humana ya era evidente, pero en ausencia de deterioro motor en este modelo animal.Por lo tanto, este punto de tiempo, representa un punto temporal interesante, para iniciar la administración de terapias experimentales adaptadas para detener el progreso de la neuroinflamación y la neurodegeneración. El punto de tiempo más adecuado para analizar la neuroinflamación en este modelo animal, es en la semana 15 después de una cirugía estereotáxica. Mientras que un punto de tiempo adecuado para analizar la infiltración de células T en el sistema nervioso central.parece estar en la semana 11 después de la inoculación del vector viral.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Investigación

Neurociencias

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

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Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

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Métodos para caracterizar espontánea y de sobresalto-inducida Locomotion en un modelo de enfermedad de Parkinson inducida por rotenona-de<em&gt; Drosophila</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

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Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

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Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

En Vivo Reprogramación Directa de Células Gliales Residentes en Interneuronas por Inyección Intracerebral de Vectores Virales

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Aplicación del sistema RatWalker para el análisis de la marcha en un modelo genético de ratas de la enfermedad de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

El modelo de rata 6-hidroxidopamina de la enfermedad de Parkinson

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...