Name: analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

Vi tackar Dr. Sebastián Valenzuela och Dr. Micaela Ricca för deras värdefulla veterinärhjälp i vår djuranläggning. Detta arbete stöddes av "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (till Fundación Ciencia & Vida) och Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Detta arbete finansierades också av bidrag FONDECYT-1210013 (till R.P.) och FONDECYT-1150766 (till F.C.) från "Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)" och MJFF-10332.01 (till R.P.) och MJFF-17303 (till F.C.) från Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research.

Alla studier utfördes under den 8: e upplagan av guiden för vård och användning av laboratoriedjur. Experimentella protokoll godkändes av IACUC vid Fundación Ciencia & Vida (Science for Life Foundation), inklusive de som involverar anestesi, smärta, nöd och eutanasi (tillståndsnummer P-035/2022).
1. Stereotaxisk kirurgi
<ol><li>Förberedelse för operationen (ca 1 h)<ol>
<li>För att upprätthålla en aseptisk miljö, använd lämpliga kirurgiska kläder under hela operationen, inklusive skoskydd, en kirurgisk mask, en sanitetsbarriär, handskar och en kirurgisk keps.</li>
		<li>Spraya 70% etanol på musen och allt kirurgiskt material för att upprätthålla en aseptisk miljö.</li>
		<li>För att inducera smärtlindring, injicera musen med carprofen 5 mg/kg subkutant (s.c.) var 12:e timme 21 med start 1 timme före operationen och fortsättning till 3 dagar efter operationen.</li>
		<li>För att bedöva musen, placera djuret i en induktionskammare. Öppna isofluranflödet med en hastighet av 0,5% och öka det sedan långsamt upp till 5% under cirka 5 minuter tills musen har tappat sin rätningsreflex22.</li>
		<li>Ta bort djuret från induktionskammaren. Överför omedelbart djuret till en icke-rebreathing krets med en lämplig storlek näsa kon. Behåll musanestesi med isofluran 1% under hela operationstiden.</li>
		<li>Bekräfta att musen är helt bedövad genom att klämma i svansen och tassarna. När musen inte reagerar på att klämma i svansen och tassarna betyder det att musen är helt bedövad.</li>
		<li>Raka musens huvud med sax. Rengör musens hud med en bomullspinne med klorhexidin 2% och ta bort allt hår.</li>
		<li>Fixa musens huvud i stereotaxisk ram.</li>
		<li>Placera ett hornhinneskyddsmedel i båda musögonen med en bomullspinne. För att förhindra stressinduktion hos andra gnagare, undvik närvaron av någon annan mus i operationsrummet23.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Operationen (ca 30 min)<ol>
<li>Rengör musens huvud med tre omgångar 2% klorhexidin följt av 70% etanol. Exponera skallen med kirurgiskt material och gör ett tunt hål med en borr vid följande koordinater: anteroposterior -2,8 mm och mediolateral 1,4 mm med avseende på den mediala linjen.</li>
		<li>Sätt nålen på en 10 μL spruta i hålet och flytta nålen långsamt inuti hjärnan tills den kommer fram till −7,2 mm dorsoventral i förhållande till dura24.</li>
		<li>Lämna nålen i det slutliga läget i 2 minuter så att vävnaden kan sätta sig lite och injicera sedan 1 μL AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP) eller vehikel (PBS vid pH 7,4; skenkirurgi) i rätt substantia nigra med en hastighet av 0,2 μL/30 s.</li>
		<li>Lämna nålen i samma position i 5 minuter efter leverans av virala vektorer och dra sedan ut den långsamt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter operationen (ca 5 min)<ol>
<li>Stäng såret med en steril silkeflätad icke-absorberbar sutur.</li>
		<li>Sätt musen i hemburen förvärmd genom att placera den över en eluppvärmd madrass (25 °C). OBS: Musen måste hållas ensam i hemburen tills den kan gå utan svårigheter och såret har läkt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bestämning av motorns prestanda med hjälp av stråltestet
<ol><li>Träning (ca 15 min per mus)<ol>
<li>Tolv veckor efter stereotaxisk operation, bedöma motorns prestanda med hjälp av en förenklad version av stråltestet som beskrivs före25. Använd för detta ändamål en horisontell balk på 25 cm i längd och 3 cm i bredd. Strålytan måste täckas med ett metalliskt galler med rutor på 1 cm och förhöjd 1 cm över strålen.</li>
		<li>Ta en video av musen som korsar gallerytans stråle från ena änden till motsatt ände av strålen, där hemburet är beläget. Träna musen i 2 dagar innan du bestämmer motorprestanda.</li>
		<li>På den första dagen, träna musen att gå genom strålen fem gånger utan gallret.</li>
		<li>På andra dagen, träna musen att gå genom strålen i närvaro av gallret fem gånger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Testet (ca 5 min per mus)<ol>
<li>På den tredje dagen, utvärdera motorprestanda. För att göra detta, kvantifiera antalet fel som utförs av vänster tassar eller av höger tassar separat genom att titta på videorna i slowmotion-läge. OBS: Ett fel definieras som när en tass inte kliver korrekt på gallret och därför blir synlig på sidan av gallret eller mellan gallret och strålytan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Bearbetning av vävnader
<ol><li>Transkardiell perfusion (cirka 15 min per mus)<ol>
<li>För att bedöva musen, injicera en blandning av ketamin (80 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) intraperitonealt (i.p.) med en 1 ml spruta och 27 G nål26.</li>
		<li>När musen är helt sövd (bekräftad som i steg 1.1.6.), öppna bröstkorgen med kirurgiskt material och exponera hjärtat.</li>
		<li>Sätt sedan in en 21 G nål (gör spetsen platt med en borr) i hjärtats vänstra kammare.</li>
		<li>Genom att koppla nålen till ett rör, perfuse 50 ml PBS (pH 7.4) med en hastighet av 9.5 ml / min med en peristaltisk pump.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixa och kryoskydda hjärnan (ca 10 min per hjärna)<ol>
<li>Ta bort hjärnan med sax och pincett och fixera den sedan genom nedsänkning i 5 ml 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,4) vid 4 °C i 24 timmar.</li>
		<li>Sätt sedan den fasta hjärnan i 15 ml 30% sackaros vid 4 °C i 48 timmar.</li>
		<li>Sätt sedan hjärnan i 4 ml kryoprotektionslösning (20% glycerin och 2% DMSO i PBS) och spara hjärnan vid −80 °C eller använd den omedelbart i nästa steg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Få hjärnskivor (cirka 20 min per hjärna). OBS: Se till att hjärnan placeras i en kryostat i rätt position för att göra koronaskärningar.<ol>
<li>För att få SN-skivor, skär hjärnan i 40 μm tjocka sektioner som börjar vid −2,92 mm och slutar vid −3,64 mm24.</li>
		<li>Skörda varje skiva i en brunn (innehållande 1 ml kryoskyddslösning) på en 24-brunnsplatta enligt en anteroposterior ordning enligt beskrivningen före 25,27,28.</li>
		<li>För att utföra immunohistokemiska (avsnitt 4.) och immunofluorescensanalyser (avsnitt 5.) i SN, välj sex koronala SN-sektioner tagna med enhetliga intervall (120 μm) som täcker hela rostrocaudal utsträckning av kärnan (totalt 720 μm), som beskrivits före 25,27,28.</li>
		<li>För att få striatala skivor, skär hjärnan i 40 μm tjocka sektioner som börjar vid +1,34 mm och slutar vid −0,26 mm24.</li>
		<li>Skörda varje skiva i en 2 ml kryorör (innehållande 1 ml kryoskyddslösning) enligt en anteroposterior ordning.</li>
		<li>För att utföra immunohistokemiska (avsnitt 4.) och immunofluorescensanalyser (avsnitt 5.) i striatum, välj fem koronala striatala sektioner tagna med enhetliga intervall (320 μm) som täcker hela rostrocaudal utsträckning av kärnan (totalt 1600 μm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunohistokemisk analys för att kvantifiera dopaminerga neuroner och mikroglios (cirka 2 dagar)
<ol><li>För immunohistokemisk analys av striatala eller nigralskivor, placera uppsättningen av fem (striatum) eller sex (SN) skivor från samma hjärna i en brunn på en 24-brunnsplatta.</li>
	<li>Tvätta sektionerna 3x med 1 ml PBS och inkubera sedan med 0,5 ml 0,03%H2O2i metanol vid rumstemperatur och med omrörning i 30 min för att inaktivera endogen peroxidasaktivitet.</li>
	<li>Tvätta sektionerna 3x med 1 ml PBS och inkubera med 0,5 ml blockerande lösning (4% getserum, 0,05% Triton X-100 och 4% BSA i PBS) vid rumstemperatur och med omrörning i 40 minuter.</li>
	<li>Inkubera därefter med 0,5 ml blockerande lösning som innehåller den primära antikroppen (kanin-anti-tyrosinhydroxylas [TH] pAb utspädd 1:1000 [se tabell 1]; eller kanin-anti-Iba1-antikropp utspädd 1:1000) vid rumstemperatur och med omrörning över natten.</li>
	<li>Tvätta sektionerna 3x med 1 ml PBS och inkubera med 0,5 ml blockerande lösning innehållande biotinylerad get-antikanin pAb (1:500, se tabell 1) vid rumstemperatur och med omrörning i 2 timmar.</li>
	<li>Tvätta sedan sektionerna 3x med 1 ml PBS och inkubera med 0,5 ml peroxidaskonjugerat avidin (1:5000, se tabell 1) i blockerande lösning vid rumstemperatur och med omrörning i 90 minuter.</li>
	<li>Tvätta sektionerna 3x med 1 ml PBS och inkubera med 0,5 ml substratlösning (0,05% diaminobenzidin i 0,03%H2O2/Trizma-HCl-buffert vid pH 7,6). Använd handskar och en labbrock för detta steg, eftersom diaminobenzidin är ett potentiellt cancerframkallande ämne.</li>
	<li>När den specifika färgningen är uppenbar (vanligtvis 30 sek för TH och 5 min för Iba1), ta ut substratlösningen och tvätta sektionerna 3x med 1 ml PBS vid rumstemperatur och med omrörning. Utför alltid immunfärgning av skivor av alla hjärnor som ingår i samma experiment samtidigt. OBS: Den specifika färgningen av TH är uppenbar när TH-immunfärgning uppträder i SN-området, vilket visar en karakteristisk form i hjärnan. Det specifika märket för Iba1 bestäms när Iba1-immunfärgning visas på kontrollhjärnskivor med typiska mikrogliala former, som bekräftas vid mikroskopobservation. På detta sätt bestäms den exakta tiden för substratutställning för IHC-analys för varje enskilt experiment.</li>
	<li>Montera hjärnsektionerna på glasskivor med en lösning av 0,2% gelatin i 0,05 M Tris (pH 7,6). Placera varje uppsättning av fem (striatum) eller sex (SN) skivor erhållna från samma hjärna i rostrocaudal ordning på samma glasskiva.</li>
	<li>Kvantifiera antalet TH + - neuroner i SN.<ol>
<li>För att kvantifiera TH + -neuroner i SN, skaffa foton av de sex skivorna vid 20x förstoring med hjälp av ett ljusfältmikroskop, som beskrivits före 25,27,28. Använd följande färgjustering: färgtemperatur 3200 K, cyanröd 40%, magentagrön 39%, gulblå 54%, gamma 0,5, kontrast 37, ljusstyrka 13, mättnad 5.</li>
		<li>Använd Image J-programvaran och välj omkretsen av SN pars compacta på den analyserade halvklotet. Undvik valet av TH + - neuroner från det ventrala tegmentala området (VTA).</li>
		<li>Be sedan programvaran att beräkna det valda området (vanligtvis 0,04-0,07 mm2 / halvklot, beroende på rostrocaudal position). Använd sedan flerpunktsverktyget och tagga varje enskild TH + - neuron med en punkt.</li>
		<li>Använd punktverktyget och be programvaran att räkna det totala antalet prickar. Med antalet totala prickar (TH + neuroner) och arealen för SNpc, beräkna densiteten hos TH + neuroner / mm2.</li>
		<li>Upprepa samma beräkning i båda halvklotet på de sex SN-skivorna och beräkna sedan medelvärdet av TH + neuroner / mm2 på ipsilaterala och kontralaterala sidor.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantifiera antalet aktiverade mikroglia i striatum<ol>
<li>För att kvantifiera aktiverad mikroglia i striatum, skaffa två foton i varje halvklot för alla fem striatala skivor vid 20x förstoring med hjälp av ett ljusfältmikroskop och samma inställningar som anges i steg 4.10.1. Med hjälp av Image J-programvaran, i varje enskilt foto (som visar ett område på 660 μm x 877 μm), tagga med en punkt varje enskild cell som uttrycker hög Iba1-intensitet och ameboidform med hjälp av multipunktverktyget. Använd punktverktyget och be programvaran att räkna det totala antalet prickar.</li>
		<li>Med antalet totala prickar och fotots yta beräknar du densiteten hos aktiverad mikroglia (Iba1höga celler /mm2) som utförts före29.</li>
	</ol></li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Målantigen</td>
			<td>Kopplad till</td>
			<td>Klonalitet</td>
			<td>Värd specie</td>
			<td>Specie reaktivitet*</td>
			<td>Utspädning**</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tyrosin hydroxylas</td>
			<td>Ej tillämpligt</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>Mus, råtta, människa</td>
			<td>1/200 - 1/1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iba1</td>
			<td>Ej tillämpligt</td>
			<td>Monoklonal</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>Mus, råtta, människa</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>alfa-synuklein</td>
			<td>Ej tillämpligt</td>
			<td>Monoklonal</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>Mänsklig</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>Ej tillämpligt</td>
			<td>Monoklonal</td>
			<td>Råtta</td>
			<td>Mus</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H+L)</td>
			<td>Biotinilerad</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Get</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H+L)</td>
			<td>AlexaFluor 546</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Get</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H+L)</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Get</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H+L)</td>
			<td>AlexaFluor 546</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Get</td>
			<td>Råtta</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Antikroppsutspädningar. Ej tillämpligt. *, Det specificeras endast om det finns reaktiviteter med mus, råtta och människa, oavsett reaktivitet med andra arter. **, En utspädnings- eller utspädningsintervall anges.
5. Immunofluorescensanalys för att utvärdera T-cellinfiltration i nigrostriatalvägen (cirka 2 dagar)
<ol><li>För immunofluorescensanalys av hαSyn eller TH / GFP på striatala eller nigralskivor, sätt ihop uppsättningen med fem (striatum) eller sex (SN) skivor från samma hjärna i en brunn på en 24-brunnsplatta.<ol>
<li>Tvätta sektionerna 3x med 1 ml PBS och inkubera sedan med 0,5 ml blockerande lösning (0,3% Triton X-100, 0,05% tween20 och 5% BSA i PBS) vid rumstemperatur och med omrörning i 40 minuter.</li>
		<li>Inkubera därefter med 0,5 ml blockerande lösning innehållande den primära antikroppen (kanin-anti-TH pAb utspädd 1:500; eller kaninanti-hαSyn-antikropp utspädd 1:150, se tabell 1) vid rumstemperatur och med omrörning över natten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tvätta sektionerna 3x med 1 ml PBS och inkubera med 0,5 ml blockerande lösning innehållande AlexaFluor546-kopplad sekundär antikaninantikropp (1:500, se tabell 1) och 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; 1:1000) vid rumstemperatur och med omrörning i 2 timmar. Tvätta sedan sektionerna 3x med 1 ml PBS.</li>
	<li>Montera hjärnsektionerna på glasskivor enligt beskrivningen ovan (steg 4.9). Bilder förvärvades med ett inverterat fluorescensmikroskop kopplat till en strömförsörjningsenhet.</li>
	<li>För immunofluorescensanalys av TH / CD4 / GFP (Foxp3) på nigralskivor, placera uppsättningen med sex (SN) skivor från samma hjärna i en brunn på en 24-brunnsplatta. Tvätta sektionerna 3x med 1 ml PBS och inkubera sedan med 0,5 ml blockerande lösning (0,5% Triton X-100, 0,5% fiskskinngelatin i PBS) vid rumstemperatur och med omrörning i 2 timmar.</li>
	<li>Inkubera med 0,5 ml blockerande lösning innehållande de primära antikropparna kanin anti-TH pAb (1:200, se tabell 1) och råtta anti-CD4 (1:250) vid 4 °C och med omrörning över natten.</li>
	<li>Tvätta sektionerna 3x med 1 ml PBS och inkubera med 0,5 ml blockerande lösning innehållande antikanin kopplad till AlexaFluor 647 (1:500, se tabell 1) och antiråtta kopplad till AlexaFluor 546 (1:500) vid rumstemperatur och med omrörning i 2 timmar. Tvätta sedan sektionerna 3x med 1 ml PBS.</li>
	<li>Lägg varje uppsättning med sex (SN) skivor som erhållits från samma hjärna i rostrocaudal ordning på samma glasskiva och montera dem med Fluoromount G. Skaffa bilder med ett Leica DMi8-mikroskop. Använd de konfokala mikroskopinställningarna som anges i tabell 2 för att få bilder från immunofluorescensanalys.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Chanel Namn</td>
			<td>Kub</td>
			<td>Utsläpp Wavelenght</td>
			<td>Namn på uppslagstabell</td>
			<td>Exponeringstid</td>
			<td>Vinst</td>
			<td>Upplösning XY</td>
			<td>Upplösning Z</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanal 1</td>
			<td>Y5</td>
			<td>700 nm</td>
			<td>Grå</td>
			<td>1 011,727 ms</td>
			<td>hög brunnskapacitet</td>
			<td>2.237 um</td>
			<td>24.444 um</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanal 2</td>
			<td>GFP</td>
			<td>525 nm</td>
			<td>Grön</td>
			<td>326.851 ms</td>
			<td>hög brunnskapacitet</td>
			<td>2.237 um</td>
			<td>24.444 um</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanal 3</td>
			<td>TXR</td>
			<td>630 nm</td>
			<td>Röd</td>
			<td>406.344 ms</td>
			<td>hög brunnskapacitet</td>
			<td>2.237 um</td>
			<td>24.444 um</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanal 4</td>
			<td>Dapi</td>
			<td>460 nm</td>
			<td>Blå</td>
			<td>91.501 ms</td>
			<td>hög brunnskapacitet</td>
			<td>2.237 um</td>
			<td>24.444 um</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Konfokala mikroskopinställningar som används för förvärv av bilder från immunofluorescensanalys.
6. Statistisk analys
<ol><li>För att jämföra data som erhållits från ipsilaterala och kontralaterala sidor, använd ett parat tvåsidigt Students t-test.</li>
	<li>För att jämföra data som erhållits från möss som får AAV-hαSyn och från möss som får AAV-GFP eller skenkirurgi, använd ett oparat tvåsidigt Students t-test. Tänk på signifikanta skillnader när P-värden < 0,05.</li>
</ol>

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av finansiella eller icke-finansiella konkurrerande intressen.

Musmodellen för neurodegeneration som analyseras här kan hjälpa till att studera många kritiska aspekter som är involverade i patofysiologin vid Parkinsons sjukdom, inklusive mekanismerna som är involverade i αSyn-patologi och mikroglial aktivering, involveringen av det perifera immunsystemet i regleringen av neuroinflammation och mekanismerna för neurodegeneration. Bland de mekanismer som är involverade i αSyn-patologi är de subcellulära mekanismerna associerade med mitokondriell, lysosomal eller proteasomal dysfunktion i närvaro av en överdriven belastning av αSyn i de dopaminerga neuronerna iSN2. Det är viktigt att tänka på att förutom hαSyn-uttrycket inducerat av AAV-medierad transduktion bidrar den endogena musen αSyn också till belastningen av totalt aSyn-uttryck. Transgena möss som överuttrycker mus αSyn utvecklar liknande synukleinpatologi, neuropatologi och motorisk försämring som dessa musmodeller baserat på överuttrycket av hαSyn32. När det gäller mikroglial aktivering kan den nuvarande musmodellen användas för att studera hur olika molekylära och cellulära spelare såsom cytokiner, neurotransmittorer, astrocyter, neuroner, blod-hjärnbarriären och T-celler kan reglera förvärvet av proinflammatoriska eller antiinflammatoriska funktionella fenotyper 8,10,11 . Denna modell utgör också ett viktigt verktyg för att studera det perifera immunsystemets roll, inklusive inte bara T-celler utan även makrofager, monocyter och neutrofiler, på processerna för neuroinflammation och neurodegenerering av nigralneuroner 11,33,34. Slutligen representerar denna musmodell också ett värdefullt system för att studera de cellulära och molekylära mekanismerna för neurodegeneration in vivo, inklusive de som induceras av interna cellulära processer, såsom oxidativ stress, energiunderskott och skadade organeller 2, eller de som utövas av externa aktörer, såsom neurotoxiska faktorer som produceras av mikrogliaceller, astrocyter och cytotoxiska T-celler8, 28,29,35.
En begränsning av denna musmodell är studien av hur den patologiska aggregeringen av αSyn på extra-cerebrala platser kan utgöra de inledande stadierna i utvecklingen av Parkinsons sjukdom36. I detta avseende finns det växande bevis som tyder på att αSyn-patologin börjar i tarmslemhinnan och luktepitelet36 och förmodligen det αSyn-specifika T-cellsvaret12 före neurodegenerationen av nigralneuroner och motorisk försämring. Efteråt skulle αSyn-aggregat migrera genom vagusnerven till hjärnstammen, vilket utlöser neuroinflammation och neurodegeneration av dopaminerga neuroner12. Även om AAV-hαSyn-modellen rekapitulerar de flesta aspekter av Parkinsons sjukdom, finns det ingen uppenbar inblandning av den patologiska aggregeringen av αSyn på extra-cerebrala platser i denna modell. En alternativ modell som involverar hαSyn-patologi som är lämplig för att studera dessa aspekter av Parkinsons sjukdom kan vara transgena möss som överuttrycker hαSyn under kontroll av Thy1-promotorn, Thy1-SNCA-modellen 37, där sjukdomsutvecklingen är beroende av tarmmikrobiotan och innebär en uppenbar gastrointestinal försämring38.
Även om det är till hjälp för studien av de olika processerna som är associerade med patofysiologin vid Parkinsons sjukdom, innebär den nuvarande musmodellen kritiska steg som bör kontrolleras noggrant, inklusive korrekt leverans av virusvektorerna i motsvarande rumsliga koordinater, det selektiva uttrycket av hαSyn i neuroner (vilket beror på AAV-serotypen och vektorkonstruktionen), och rätt AAV-dos och timing innan du analyserar den parkinsoniska fenotypen. Analysen av korrekt leverans av virusvektorerna i SN är nödvändig, eftersom användningen av de korrekta rumsliga koordinaterna för SN kanske inte räcker när nålen inte är helt rak, vilket ibland är omärkligt för det mänskliga ögat. Dessutom beror diffusionen av AAV-vektorerna på AAV-serotyp39. Av dessa skäl är det nödvändigt att utföra regelbundna kvalitetskontroller för att kontrollera korrekt leverans och diffusion av de injicerade AAV-GFP-vektorerna efter observation av GFP i hjärnskivor som innehåller SN-området.
När det gäller det selektiva uttrycket av hαSyn i neuroner kan uttrycket av hαSyn i princip konstrueras för att styras av en promotor selektiv för neuroner eller, ännu mer exakt, selektiv för dopaminerga neuroner, såsom användningen av TH-promotorn i AAV-vektorer för att inducera det selektiva uttrycket av gener i dopaminerga neuroner40 . Denna strategi fungerar dock inte när det som eftersträvas är överuttryck av genen av intresse. Av denna anledning är det i den nuvarande modellen viktigt att använda en stark promotor (en promotor som inducerar högt uttryck av nedströmsgenen) och AAV-serotyper med neuronal tropism. I denna studie användes CBA-promotorn som en stark promotor för att inducera överuttryck av hαSyn, och AAV5-serotypen användes för virusvektorn. Denna serotyp har använts tidigare för att transducera mus- och råttneuroner41,42. Här visade resultaten att 12 veckor efter leveransen av AAV5-GFP i SN hos möss var den gröna fluorescensen selektivt närvarande på ipsilateralsidan av både SN och striatum (Figur 1), vilket indikerar effektiv transduktion av neuroner i den nigrostriatala vägen.
En annan kritisk aspekt av denna musmodell av Parkinsons sjukdom är den tidpunkt som krävs för att analysera en viss process efter operationen. I detta avseende visar detta arbete en kinetisk studie av olika processer som är involverade i patologin. Eftersom viktiga tidpunkter förändras med dosen av virala genom som ges per mus, den serotyp av AAV som används, eller till och med med den sats AAV som används, utfördes först en dos-responsanalys av mängden AAV-αSyn som krävs för att inducera en signifikant förlust av TH + -neuroner och motorisk försämring. Tidigare studier har visat signifikant motorisk försämring och en förlust av TH+ neuroner i nigrostriatalvägen efter 12 veckors AAV-αSyn-injektioner hos möss i doser från 6 x 108–3 x 1010 virala genom per mus 16,17,30,31. Följaktligen varierade dosen av AAV-hαSyn som användes för att inducera hαSyn-uttrycket i den nigrostriatala vägen, förlusten av TH + -neuroner och motorisk försämring hos möss från 1 x 108–1 x 1010 virala genom per mus. För att kontrollera att förlusten av TH + -neuroner och motorisk försämring inducerades av överuttrycket av hαSyn i SN och inte av AAV-infektion av neuroner i SN, inkluderades kontrollgrupper där AAV-kodning för en reportergen (AAV-eGFP) levererades ensidigt i SN hos möss och neurodegeneration och motorisk försämring bestämdes. Resultaten visade att 1 x10 10 virusgenom per mus 12 veckor efter stereotaxisk kirurgi var en korrekt dos av AAV5-hαSyn, eftersom möss som fick denna virusbelastning visade signifikant hαSyn i den nigrostriatala vägen (figur 2 och figur 3), förlust av TH + -neuroner (figur 4) och motorisk försämring (figur 5). Däremot var lägre doser av AAV5-hαSyn (1 x 108 virala genom per mus och 1 x 109 virala genom per mus) inte tillräckligt starka för att nå signifikanta förändringar i alla dessa parametrar tillsammans (figur 2–4). Observera att administreringen av AAV-GFP vid 1 x 1010 virala genom per mus inducerade en låg (~ 20%), men signifikant grad av förlust av TH + -neuroner av nigral dopaminerga neuroner (Figur 4A, B). Detta resultat överensstämmer med tidigare observationer med denna modell41 och är förmodligen konsekvensen av en låg nivå av neuroinflammation inducerad av administrering av AAV-vektorer i SN. Ändå var omfattningen av förlusten av TH+ neuroner signifikant högre hos möss som fick AAV5-hαSyn jämfört med dem som fick samma dos av AAV-GFP (figur 4C). Observera att kinetiken för hαSyn-uttryck inte bara beror på transduktionens effektivitet utan också på omfattningen av AAV-diffusion39. Eftersom AAV-diffusion beror på AAV-serotypen kan de exakta nyckeltidpunkterna i denna djurmodell variera när man använder en annan AAV-serotyp som skiljer sig från AAV5.
Därefter genomfördes en kinetisk analys med 1 x 1010 virala genom per mus för att bestämma viktiga tidpunkter i denna musmodell. Eftersom nuvarande bevis har visat några tidiga symtom som uppträder före motorisk försämring, vilket skulle möjliggöra tidig diagnos av Parkinsons sjukdom43,44, försökte dessa experiment hitta den tidpunkt då hαSyn-uttrycket redan var uppenbart men i avsaknad av motorisk försämring. Resultaten visar att uppkomsten av hαSyn-uttryck i SN var 5 veckor efter stereotaxisk leverans av AAV-hαSyn (figur 6). Denna tidpunkt utgör en intressant tidspunkt för att börja administrera terapier skräddarsydda för att stoppa de neuroinflammatoriska och neurodegenerativa processerna. Andra viktiga tidpunkter som bestämdes här var topptiderna för två kritiska händelser associerade med neuroinflammationsprocessen: den tid då mikroglia når maximal aktiveringsgrad och tiden för maximal T-cellinfiltration i SN. Resultaten visade en kurva med en trend som nådde två vågor av maximal mikroglial aktivering, den första vid 10 veckor efter operationen och den andra vid 15 veckor efter operationen (figur 7). Den kinetiska analysen av T-cellsinfiltration visade topptiden för Treg-infiltration i SN vid 11 veckor efter stereotaxisk operation (figur 8). Överraskande nog upptäcktes inga effektor T-celler (CD4 + Foxp3-) som infiltrerade SN under den analyserade tidsramen (vecka 8–13 efter operationen). Sammantaget föreslår dessa resultat en lämplig tidsram för att börja administrera terapier inriktade på att stoppa processen med neuroinflammation och dämpa T-cellinfiltration i SN med hjälp av denna prekliniska modell, som sträcker sig mellan vecka 5 efter operationen (uppkomsten av hαSyn-överuttryck) och vecka 10 efter operationen (den första vågen av neuroinflammation och T-cellinfiltration) (Figur 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig09.jpg"> Figur 9: Sammanfattning av de viktigaste tidpunkterna som hittades för denna djurmodell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig09large.jpg" target="_blank"></a>

Efter Alzheimers sjukdom är Parkinsons sjukdom den näst vanligaste neurodegenerativa sjukdomen i världen. De primära nervcellerna som påverkas vid Parkinsons sjukdom är de av den nigrostriatala vägen, som producerar dopamin och kontrollerar frivillig rörelse. Som en konsekvens är det mest karakteristiska symptomet i samband med denna sjukdom motorisk försämring. Denna patologi innefattar också avsättning av proteinaggregat i hjärnan, som huvudsakligen består av α-synuklein (aSyn)1, ett cytosoliskt protein associerat med presynaptiska terminaler. Bevis har visat att genereringen av patogena inklusioner av αSyn utlöses av felveckning eller av vissa post-translationella modifieringar av detta protein2.
I synnerhet har ett nära samband etablerats mellan αSyn-patologi och förlusten av dopaminerga neuroner i den nigrostriatala vägen i human Parkinsons sjukdom och djurmodeller 3,4. Att förstå hur αSyn-aggregat genereras och hur de inducerar neuronal död utgör en betydande utmaning inom området. En växande grupp studier har visat att mitokondriell dysfunktion är en av de främsta orsakerna till genereringen av αSyn-aggregat2 genom att öka oxidativ stress. Faktum är att flera gener associerade med Parkinsons sjukdom riskerar proteiner som är involverade i mitokondriell funktion, morfologi och dynamik 5,6. Dessutom utgör lysosomal dysfunktion, som resulterar i ackumulering av dysfunktionella mitokondrier och felveckad αSyn, en annan viktig händelse som främjar genereringen av αSyn-aggregat7.
Nya bevis har indikerat att när αSyn-aggregat deponeras i hjärnan stimulerar dessa patogena proteiner tollliknande receptorer (TLR) på mikroglia, vilket utlöser mikroglial aktivering och en initial inflammatorisk miljö i substantia nigra (SN)8,9. Dessutom indikerar bevisen att αSyn-aggregat fångas upp och presenteras av antigenpresenterande celler till T-celler, vilket inducerar ett adaptivt immunsvar specifikt för αSyn10,11. Dessa αSyn-specifika T-celler infiltrerar därefter hjärnan och restimuleras av aktiverad mikroglia, vilket främjar utsöndringen av neurotoxiska faktorer som framkallar neuronal död 9,10. Intressant nog har flera bevislinjer föreslagit att αSyn-aggregat genereras först i det enteriska nervsystemet och sedan transporteras genom vagusnerven till hjärnstammen12.
Flera djurmodeller av Parkinsons sjukdom har använts i många år, inklusive de som induceras genom administrering av neurotoxiska ämnen (dvs. 6-hydroxidopin, parakvat, rotenon, 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin) och de som involverar genetiska tillstånd (dvs. mutant α-synuklein, mutant leucinrikt upprepat kinas 2)13 . Trots modeller som involverar neurotoxininducerad neurodegeneration som replikerar vissa aspekter av Parkinsons sjukdom, rekapitulerar ingen av dem alla väsentliga aspekter av sjukdomen eller är inte progressiva13. Å andra sidan, även om genetiska musmodeller som involverar uttryck av mutanta versioner av leucinrika upprepa kinas 2, mutanta versioner av α-synuklein eller överuttrycket av human vildtyp α-synuklein resulterar i motorisk försämring och i vissa fall också utvecklingen av synukleinopati, reproducerar de inte framträdande neurodegenerering av de nigrala dopaminerga neuronerna, vilket är en väsentlig aspekt av Parkinsons sjukdom13, 14. En tredje typ av djurmodell av neurodegeneration har lyckats uppfylla de flesta av de väsentliga aspekterna av Parkinsons sjukdom, stereotaxisk leverans av adenoassocierade virusvektorer (AAV) som kodar för den mänskliga α-synuklein (AAV-hαSyn)14,15. Viktigt är att AAV tillåter transduktion av neuroner med hög effekt och på lång sikt i den vuxna hjärnan hos däggdjur. Dessutom har stereotaxisk leverans av AAV-hαSyn i SN visat sig reproducera många av de väsentliga aspekterna av sjukdomen, inklusive αSyn-patologi, mikroglial aktivering, neurodegeneration och motorisk försämring 16,17,18,19,20. Denna studie presenterar en analys av hur dosen av viral vektor och tiden efter viral vektorleverans påverkar omfattningen av hαSyn-uttryck, neurodegeneration och neuroinflammation i den nigrostriatala vägen, liksom graden av motorisk försämring i musmodellen för ensidig stereotaxisk leverans av hαSyn i SN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS AND ANIMAL FOOD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3-GFP C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No:&#160;023800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Rodent Diet</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>Rodent Diet 5001</td>
			<td>Standard Rodent diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIRAL VECTORS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-&#945;Syn</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 10E13 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-eGFP</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANESTHETICS AND ANALGESICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>218082</td>
			<td>1% for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>CHE30</td>
			<td>70 mg/Kg&#160; for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>VE2L9117</td>
			<td>For before transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>DPH134</td>
			<td>30 mg/Kg every 24 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Centrovet</td>
			<td>EHL40</td>
			<td>9 mg/kg for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam test</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>S2800 Coolpix</td>
			<td>For recording the beam test performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Used for IHC analysis (section 4.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI8</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Standard Stereotaxic, mouse</td>
			<td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td>
			<td>51500</td>
			<td>stereotaxic frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>C-flex L/S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-RFL-T</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture</td>
			<td>Sylkam&#174;, B Braun</td>
			<td>C0760171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 100 U</td>
			<td>BD</td>
			<td>324918</td>
			<td>For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>HA-7641-01</td>
			<td>For viral vector innoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUFFERS AND REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviden, Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>189728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotrotection buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20% glycerine and 2% DMSO in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount -G T</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>5000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.125 M, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase inactivating buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.03% H2O2 in methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>111065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-Iba-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR16588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism</td>
			<td>6.0</td>
			<td>Fos stats analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Leica microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProgRes Capture Pro</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Olympus microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLC media player</td>
			<td>VideoLAN Organization</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For analysis of behavioural tests</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein

Parkinsons sjukdom är en neurodegenerativ sjukdom som involverar döden av de dopaminerga neuronerna i den nigrostriatala vägen och följaktligen den progressiva förlusten av kontroll över frivilliga rörelser. Denna neurodegenerativa process utlöses av avsättningen av proteinaggregat i hjärnan, vilka huvudsakligen består av α-synuklein. Flera studier har visat att neuroinflammation krävs för att utveckla neurodegenerationen i samband med Parkinsons sjukdom. I synnerhet involverar den neuroinflammatoriska processen mikroglial aktivering samt infiltration av perifera T-celler i substantia nigra (SN). Detta arbete analyserar en musmodell av Parkinsons sjukdom som rekapitulerar mikroglial aktivering, T-cellinfiltration i SN, neurodegeneration av nigral dopaminerga neuroner och motorisk försämring. Denna musmodell av Parkinsons sjukdom induceras av stereotaxisk leverans av adenoassocierade virusvektorer som kodar för den mänskliga vildtypen α-synuklein (AAV-hαSyn) i SN. Korrekt leverans av virala vektorer till SN bekräftades med hjälp av kontrollvektorer som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP). Därefter utvärderades hur dosen av AAV-hαSyn administrerad i SN påverkade omfattningen av hαSyn-uttryck, förlusten av nigral dopaminerga neuroner och motorisk försämring. Dessutom bestämdes dynamiken i hαSyn-uttryck, mikroglial aktivering och T-cellinfiltration under hela sjukdomsutvecklingen. Således ger denna studie kritiska tidpunkter som kan vara användbara för att rikta in sig på synukleinpatologi och neuroinflammation i denna prekliniska modell av Parkinsons sjukdom.

Validera korrekt leverans av AAV-vektorer i de dopaminerga neuronerna i den nigrostriatala vägen För att studera processerna för neuroinflammation, neurodegeneration och motorisk försämring som främjas av synukleinpatologi användes en musmodell av Parkinsons sjukdom inducerad av den ensidiga stereotaxiska leveransen av AAV-kodning av hαSyn i SN 16,17,30,31 (se den experimentella designen i kompletterande figur 1 ). För att validera korrekt leverans av AAV-vektorer i de dopaminerga neuronerna i den nigrostriatala vägen injicerades AAV-kodning av GFP (AAV-GFP) i SN, och 12 veckor senare analyserades GFP-fluorescens och tyrosinhydroxylas (TH) immunreaktivitet i SN och striatum genom immunofluorescens. Den GFP-associerade fluorescensen observerades uteslutande på ipsilateralsidan, och det fanns signifikant samlokalisering med TH-immunreaktivitet i både SN och striatum, vilket indikerar korrekt leverans av AAV-vektorer i de dopaminerga neuronerna i den nigrostriatala vägen (Figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig01.jpg"> Figur 1: Analys av leveransen av AAV-GFP i den nigrostriatala vägen. Möss fick AAV-GFP (1 x 1010 vg/mus) och 12 veckor senare offrades, och TH immunstifierades i (A) SN (skalstängerna är 118 μm) och (B) striatum (skalstängerna är 100 μm). TH- och GFP-associerad fluorescens analyserades med epifluorescensmikroskopi. Kärnor färgades med DAPI. Representativa bilder av sammanfogade eller enstaka färgningar av TH (röd), GFP (grön) och DAPI (blå) visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Ställa in dosen av viral vektor administrerad för att inducera neurodegeneration och motorisk försämring i musmodellen av Parkinsons sjukdom inducerad av AAV-hαSyn För att testa dosen av AAV-hαSyn som krävs för att inducera ett signifikant överuttryck av hαSyn som främjar neurodegeneration av de nigrala dopaminerga neuronerna injicerades olika doser (1 x 108 virala genom [vg]/mus, 1 x 109 vg/mus eller1 x 10 10 vg/mus) av AAV-hαSyn, och 12 veckor senare utvärderades hαSyn-immunreaktivitet och omfattningen av TH-immunreaktivitet i den nigrostriatala vägen. Även om hαSyn-immunreaktivitet var uppenbar med alla doser som testades i SN (figur 2), presenterade endast möss som fick 1 x10 10 vg/mus uppenbar hαSyn-immunoreaktivitet i striatum (figur 3). Dessutom visade möss som fick 1 x10 10 vg/mus av AAV-hαSyn en signifikant förlust av dopaminerga nervceller i SN (figur 4A,B). Även om möss som fick 1 x10 10 vg/mus av AAV-GFP uppvisade en låg grad (~20%) av neuronal förlust (figur 4A,B), uppvisade möss som fick samma dos av AAV-hαSyn en signifikant högre grad av neurodegeneration av nigral dopaminerga nervceller (figur 4C). Följaktligen utfördes ytterligare experiment med användning av 1 x 1010 vg/mus av AAV-hαSyn. Dessutom bestämdes omfattningen av motorisk försämring hos möss som fick olika doser av AAV-hαSyn med hjälp av stråltestet (figur 5A), som beskrivits före25. En signifikant minskning av motorprestanda upptäcktes uteslutande med 1 x 1010 vg/mus av AAV-hαSyn i stråltestet både när man jämförde antalet fel som gjorts av höger och vänster dyna (figur 5B) och vid jämförelse av det totala antalet fel hos möss som fick AAV-hαSyn jämfört med möss som fick kontrollvektorn AAV-GFP (figur 5C). Följaktligen utfördes ytterligare experiment med användning av 1 x 1010 vg/mus av AAV-hαSyn.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig02.jpg"> Figur 2: Analys av humant α-synukleinuttryck i SN hos möss som behandlats med olika doser av AAV-hαSyn. Möss fick AAV-hαSyn vid (A) 1 x 1010 vg/mus, (B) 1 x 109 vg/mus, eller (C) 1 x 108 vg/mus och 12 veckor senare offrades, och hαSyn-uttrycket analyserades med immunofluorescens i SN med epifluorescensmikroskopi. Kärnor färgades med DAPI. Representativa bilder av sammanfogad eller enkel färgning av hαSyn (röd) eller DAPI (blå) visas. Skalstrecken är 118 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig03.jpg"> Figur 3: Analys av humant α-synukleinuttryck i striatum hos möss som behandlats med olika doser av AAV-hαSyn. Möss fick AAV-hαSyn vid (A) 1 x10 10 vg/mus, (B) 1 x 109 vg/mus, eller (C) 1 x 108 vg/mus) och 12 veckor senare offrades, och hαSyn-uttrycket analyserades med immunofluorescens i striatumet med epifluorescensmikroskopi. Kärnor färgades med DAPI. Representativa bilder av sammanfogad eller enkel färgning av hαSyn (röd) eller DAPI (blå) visas. Skalstänger är 100 μm. Infogningen i det övre högra hörnet av de sammanfogade bilderna visar ett område av intresse för högre förstoring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig04.jpg"> Figur 4: Förlust av dopaminerga nervceller i SN hos möss som behandlats med olika doser av AAV-hαSyn eller kontrollvektor. Möss fick AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mus, 1 x 109 vg/mus eller 1 x 108 vg/mus) eller AAV-GFP (1 x10 10 vg/mus) och 12 veckor senare offrades, och TH analyserades i SNpc genom immunohistokemi. (A) Representativa bilder. Skalstänger, 100 μm. (B,C) Tätheten av neuroner kvantifierades som antalet TH+ neuroner/mm2. Data representerar genomsnittlig ± SEM. n = 3–8 möss per grupp. (B) En jämförelse av ipsilaterala med kontralaterala sidor utfördes med hjälp av det tvåsidiga parade Students t-test. (C) En jämförelse av ipsilaterala sidor från möss som fick 1 x 1010 vg/mus av AAV-hαSyn eller AAV-GFP utfördes. (B,C) Medan vita staplar indikerar kvantifieringen av TH + -neuroner på ipsilateralsidan av möss som får AAV-hαSyn, indikerar gröna staplar kvantifieringen av TH + -neuroner på ipsilateralsidan av möss som får AAV-GFP. Grå staplar indikerar kvantifieringen av TH + -neuroner på den kontralaterala sidan av motsvarande grupp. Jämförelserna gjordes med ett tvåsidigt oparfördelat Students t-test. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig05.jpg"> Figur 5: Analys av motorns prestanda hos möss som behandlats med olika doser av AAV-hαSyn. Möss fick olika doser (1 x 1010 vg/mus, 1 x 109 vg/mus eller 1 x 108 vg/mus) av AAV-hαSyn eller AAV-GFP, och 12 veckor senare utvärderades motorprestandan genom stråltestet. (A) Bild av en mus som går på strålen. (B) Antalet fel som utfördes av vänster extremitet (kontraateral) kontra höger extremitet (ipsilateral) kvantifierades i grupperna möss som fick AAV-hαSyn. (C) Det totala antalet fel jämfördes mellan olika experimentgrupper som fick samma dos av AAV-hαSyn eller AAV-GFP. Data representerar medelvärdet ± SEM. n = 3–5 möss per grupp. Jämförelserna utfördes av (B) ett parat tvåsidigt Students t-test eller av (C) ett oparat tvåsidigt Students t-test. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Ställa in kinetiken för Parkinsons sjukdomsmodell inducerad av AAV-αSyn Efter att ha bestämt rätt AAV-hαSyn-dos som användes för att inducera en signifikant nivå av neurodegeneration och motorisk försämring, genomfördes experiment för att definiera uppkomsten av hαSyn-överuttryck. För detta ändamål behandlades möss med 1 x 1010 vg/mus av AAV-hαSyn eller skenkirurgi. Omfattningen av hαSyn-uttrycket analyserades i SN en gång per vecka under vecka 2-5 efter stereotaxisk kirurgi (se den experimentella designen i kompletterande figur 2). Resultaten visar att trots att hαSyn-uttryck detekterades vid låga nivåer så tidigt som 2 veckor efter operationen, uppträdde hαSyn-kluster vid vecka 5 efter stereotaxisk operation (figur 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig06.jpg"> Figur 6: Analys av tidsförloppet för humant α-synukleinuttryck i SN hos möss behandlade med AAV-hαSyn. Möss fick AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/mus) eller bara bluffstereotaxisk kirurgi, och uttrycket av hαSyn i SN analyserades (A) 2 veckor, (B) 3 veckor, (C) 4 veckor, eller (D) 5 veckor senare genom immunofluorescens med epifluorescensmikroskopi. Kärnor färgades med DAPI. Representativa bilder av sammanfogad eller enkel färgning av hαSyn (röd) eller DAPI (blå) visas. Skalstänger, 100 μm. Infogningen i det övre högra hörnet av de sammanfogade bilderna visar ett område av intresse för högre förstoring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Därefter genomfördes experiment för att bestämma lämpliga tidpunkter för att analysera neuroinflammation och T-cellsinfiltration i centrala nervsystemet (CNS) efter stereotaxisk leverans av AAV-hαSyn. För att bestämma toppen av mikroglial aktivering efter behandling av möss med AAV-hαSyn utvärderades omfattningen av celler som uttrycker höga nivåer av Iba1 i striatum en gång per vecka under veckorna 2-15 efter stereotaxisk operation. Resultaten visar en signifikant ökning av mikroglial aktivering av ipsilateralsidan jämfört med den kontralaterala sidan hos möss 15 veckor efter AAV-hαSyn-behandlingen (figur 7). Antalet Treg -celler (CD4 + Foxp3 +) som infiltrerades i SNpc utvärderades också vid olika tidpunkter efter stereotaxisk leverans av AAV-hαSyn genom immunofluorescens följt konfokalmikroskopiobservation. Resultaten visar att toppen av Treg-infiltrationen i SNpc var 11 veckor efter operationen, medan omfattningen av Treg som infiltrerade detta område av hjärnan var lägre vid vecka 8 eller vecka 13 efter operationen (figur 8). Inga CD4 + T-celler upptäcktes som infiltrerade striatum (data visas inte). Sammantaget indikerar dessa resultat att med hjälp av 1 x 1010 vg / mus av AAV-hαSyn är den lämpligaste tidpunkten för att analysera neuroinflammation vecka 15 efter stereotaxisk operation, medan en korrekt tidpunkt för att analysera T-cellinfiltration i CNS verkar vara vecka 11 efter AAV-hαSyn-behandling.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig07.jpg"> Figur 7: Analys av tidsförloppet för mikroglial aktivering hos möss inokulerade med AAV-hαSyn. Möss fick AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mus) och mikroglial aktivering utvärderades genom immunohistokemisk analys av Iba1 i striatum vid olika tidpunkter efter operationen. (A) Representativa översiktsbilder av immunohistokemisk analys av Iba1 från möss som offrats 5 veckor, 10 veckor eller 15 veckor efter inokulering med AAV-hαSyn visas. Skalstänger, 110 μm. (B) Densiteten hos aktiverad mikroglia kvantifierades som antalet celler som uttrycker höga nivåer av Iba1 och ameboidform per område. Data representerar medelvärdet ± SEM. Ett tvåsidigt parat Students t-test användes för att bestämma statistiska skillnader mellan ipsilateral och kontralateral Iba1 i varje grupp. *p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig08.jpg"> Figur 8: Analys av tidsförloppet för CD4 + T-cellinfiltration i SN hos möss som inokulerats med AAV-hαSyn. Foxp3gfp reportermöss fick AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mus). Närvaron av CD4 + T-celler som uttrycker Foxp3 och närvaron av TH + -neuroner analyserades vid olika tidpunkter (vecka 8, vecka 11 och vecka 13 efter operationen) i SN genom immunofluorescens. (A) Representativa bilder för enstaka immunfärgning eller sammanslagning visas. Skalstänger, 100 μm. (B) Antalet CD4+ Foxp3+ T-celler per område i SN kvantifierades. Data representerar genomsnittlig ± SEM från 3 möss per grupp. *p<0.05, ipsilaterala kontra kontraterala CD4+ Foxp3+ T-celler med tvåsidig Students t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande figur 1: Experimentell design för att utvärdera effekten av olika doser av AAV-vektorer på synukleinpatologi, neurodegeneration och motorisk funktionsnedsättning. Vildtyps hane C57BL/6-möss sövdes och fick stereotaxisk ympning av olika doser (1 x 1010 vg/mus, 1 x 109 vg/mus eller 1 x 108 vg/mus) av AAV som kodar för humant α-synuklein (AAV-hαSyn) eller eGFP (AAV-GFP) under kontroll av CBA-promotorn till höger substantia nigra (SN). Efter 12 veckor utvärderades uttrycket av GFP och hαSyn i SN och striatum (Str) med immunofluorescens (IF), tyrosinhydroxylaspositiva (TH+) celler kvantifierades med immunohistokemi (IHC) i SN och motorprestanda utvärderades av stråltestet. Antalet möss i varje experimentgrupp anges inom parentes. * anger grupper där en mus dog före analyserna. Varje analys anger inom parentes numret på figuren från papperets kropp där motsvarande resultat visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 2: Experimentell design för att bestämma kinetiken för T-cellsinfiltration, neuroinflammation och hαSyn-uttryck. Foxp3 gfp-reportermöss bedövades och fick stereotaxisk ympning av AAV (1 x 1010 vg/mus) som kodade för humant α-synuklein (AAV-hαSyn) under kontroll av CBA-promotorn till rätt substantia nigra (SN) eller skenkirurgi (PBS). Möss offrades vid olika tidpunkter, och uttrycket av hαSyn i SN och striatum utvärderades av immunofluorescens (IF), GFP (Foxp3), CD4 och tyrosinhydroxylaspositiva (TH+) celler kvantifierades av IF i SN, och Iba1-uttrycket analyserades med immunohistokemi (IHC) i striatum (Str). Antalet möss i varje experimentgrupp anges. Tidsintervallet som ingår i varje analys anges. Varje analys anger inom parentes numret på figuren från papperets kropp där motsvarande resultat visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein

Detta arbete analyserar vektordosen och exponeringstiden som krävs för att inducera neuroinflammation, neurodegeneration och motorisk försämring i denna prekliniska modell av Parkinsons sjukdom. Dessa vektorer som kodar för den mänskliga α-synuklein levereras till substantia nigra för att rekapitulera synukleinpatologin associerad med Parkinsons sjukdom.

Analysera Parkinsons sjukdom musmodell inducerad av adenoassocierade virala vektorer som kodar för humant α-synuklein

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

Det övergripande målet med denna procedur är att reproducera de flesta av de väsentliga aspekterna av Parkinsons sjukdom i en djurmodell. Den stereotaxiska leveransen av adenoassocierade virala vektorer, som kodar för det humana synukleinet i substantia nigra. Parkinsons sjukdom är en neurodegenerativ sjukdom som involverar döden av dopaminerg neuron, i den nigrostriatala vägen, och följaktligen utvecklingen av förlust av kontroll av frivillig rörelse.Denna neurodegenerativa process åtföljs av avsättning av proteinaggregat i hjärnan, som huvudsakligen utgörs av synuklein. Nya bevis har indikerat att synukleinaggregat kan stimulera tollliknande receptorer på mikroglia, vilket utlöser neural inflammation i substantia nigra. Dessutom tyder bevis på att synukleinaggregat kan fångas och presenteras, genom antigenpresenterande celler till T-celler, vilket inducerar ett adaptivt immunsvar specifikt för synuklein.Den stereotaxiska leveransen av adenoassocierade virala vektorer som kodar för det humana synukleinet i substantia nigra, har visat sig reproducera många väsentliga aspekter av sjukdomen, inklusive synukleinpatologi, mikroglial aktivering, T-cellaktivering, neurodegeneration och motorisk försämring. Denna studie presenterar en analys av hur en viral vektor och tiden efter viral vektorleverans påverkar omfattningen av humant synukleinuttryck, neurodegeneration och neuroinflammation i den nigrostriatala vägen, liksom graden av motorisk försämring i en musmodell av ensidig stereotaxisk leverans av humant synuklein i substantia nigra. För att upprätthålla en aseptisk miljö, använd lämpliga kirurgiska kläder under hela operationen, inklusive skoskydd, operationsmask, sanitetsbarriär, handskar och operationsmössa.Spraya etanol på musen och allt kirurgiskt material för att bibehålla den aseptiska miljön. För att inducera en analgesi, injicera carprofen subkutant var 12: e timme, börja en timme före operationen och fortsätt till tre dagar efter operationen. För att bedöva musen, placera djuret i en induktionskammare.Öppna isofluranflödet med en hastighet av 0,5% och öka det sedan långsamt upp till 5% under cirka fem minuter tills musen har tappat sin rätningsreflex. Ta bort djuret från induktionskammaren. Överför omedelbart djuret till en icke-rebreathing krets med en lämpligt stor noskotte.Behåll musanestesi, med isofluran 1% under hela operationstiden. Bekräfta att musen är helt bedövad genom att klämma i svansar och tassar. När musen inte reagerar när den klämmer i svansen och tassarna betyder det att musen är helt sövd.Raka mushuvudet med sax. Rengör mushuden med en bomullspinne med klorhexidin 2% och ta bort allt hår. Fixa mushuvudet i stereotaxisk ram.Placera ett hornhinneskyddsmedel i båda musögonen med en bomullspinne. För att förhindra stressinduktion hos andra gnagare, undvik närvaron av någon annan mus i operationsrummet. Rengör mushuvudet med tre omgångar klorhexidin 2% följt av etanol 70% Exponera skallen med kirurgiskt material och gör ett tunt hål med en borr vid koordinaterna anteroposterior 2,8 mm och mediolateral 1,4 mm, med avseende på medial linje.Sätt nålen på en 10 mikroliter spruta i hålet och flytta nålen långsamt inuti hjärnan tills du kommer till 7,2 mm dorsoventral, respekt för dura. Lämna nålen i det slutliga läget i två minuter, så att vävnaden kan sätta sig lite, och injicera sedan en mikroliter virala vektorer i rätt substantia nigra, med en hastighet av 0,2 mikroliter var 30: e sekund. Lämna nålen i samma position i fem minuter efter leverans av virala vektorer och dra sedan långsamt ut den.Stäng såret med en steril silkesutur. Sätt musen i hemburet, förvärmd genom att placera den över en elektrisk varm madrass. 12 veckor efter stereotaxisk operation, bedöma motorns prestanda med hjälp av en förenklad version av stråltestet, som beskrivits tidigare.Använd för detta ändamål en horisontell balk på 25 cm i längd och 3 cm i bredd. Strålytan måste täckas av ett metalliskt galler med kvadrater på en centimeter och förhöjd en centimeter ovanför strålen. Gör en video av musen medan du korsar gallerytans stråle, från ena änden till motsatt ände av strålen, där hemburet är beläget.Träna musen i två dagar innan du bestämmer motorns prestanda. På den första dagen, träna musen att gå genom strålen fem gånger, utan gallret. På andra dagen, träna musen att gå genom strålen, i närvaro av galler fem gånger.På den tredje dagen, utvärdera motorprestanda. För att göra detta, kvantifiera antalet fel som utförs, av vänster tassar eller av höger tassar separat, genom att titta på videorna i ett slowmotion-läge. För att bedöva musen, injicera en blandning av ketamin och xylazin intraperitonealt.När musen är helt bedövad, öppna bröstkorgen med kirurgiskt material och exponera hjärtat. Sätt sedan in en platt spetsnål i hjärtats vänstra kammare. Genom att koppla nålen till ett rör, perfuse 50 ml fosfatbuffert saltlösning, med en hastighet av 9,5 ml per minut, med användning av en peristaltisk pump.Ta bort hjärnan med sax och pincett och fixa den sedan genom nedsänkning, i fem milliliter 4% paraformaldehyd, i fosfatbuffertsaltlinje. Lägg sedan den fasta hjärnan i 15 milliliter 30% sackaros i 48 timmar. Lägg sedan hjärnan i fyra milliliter kryoprotektionslösning och spara hjärnan vid 80 grader, eller använd den omedelbart i nästa steg.För att få striatala skivor, skär hjärnan i 40 mikrometer tjocka sektioner, börja vid 1,34 mm och avsluta vid 0,26 mm. Skörda varje skiva i en två milliliter kryotube, enligt anteroposterior ordning. För att utföra immunohistokemisk och immunofluorescerande analys i striatum, välj fem koronala striatala sektioner tagna med enhetliga intervall, som täcker hela rostrocaudal utsträckning av kärnan.För att validera korrekt leverans av virala vektorer i de dopaminerga neuronerna i den nigrostriatala vägen injicerades vektorer som kodade för GFP, i substantia nigra, och 12 veckor senare analyserades GFP-fluorescensen och tyrosinhydroxylasimmunreaktiviteten i substantia nigra och striatum genom immunofluorescens. Den GFP-associerade fluorescensen var uteslutande belägen på ipsilateralplatsen, och en signifikant samlokalisering med tyrosinhydroxylasimmunreaktivitet observerades i både substantia nigra och striatum, vilket indikerar korrekt leverans av virala vektorer i de dopaminerga neuronerna i den nigrostriatala vägen. För att testa dosen av vektorer, kodning av synuklein som krävs, för att inducera ett signifikant överuttryck av humant synuklein som främjar neurodegeneration av de nigrala dopaminerga neuronerna, injicerades olika doser av vektorerna.Och 12 veckor senare testades den humana synukleinimmunreaktiviteten och omfattningen av tyrosinhydroxylasimmunreaktivitet i den nigrostriatala vägen. Human synukleinimmunreaktivitet var uppenbar, med alla doser testade i substantia nigra. Men endast möss som fick 10 till de 10 virala genomen per mus, presenterade uppenbar human synukleinimmunreaktivitet, i striatum.Möss som fick 10 till 10 virala genom per mus av vektorer som kodar för humant synuklein, visade en signifikant förlust av dopaminerga neuroner i substantia nigra. Även om möss som fick samma dos vektorer som kodade för GFP, visade en låg grad av neuronal förlust, presenterade dessa möss signifikant lägre grad av neurodegeneration, jämfört med de möss som fick vektorer, som kodade för humant synuklein. Med hjälp av stråltestet upptäcktes en signifikant minskning av motorisk prestanda uteslutande hos dessa möss, som fick 10 till 10 virala genom per mus av vektorer som kodar för humant synuklein, när man jämförde antalet fel som gjorts av höger och vänster tassar, eller när man jämför det totala antalet fel, av möss som får vektorer som kodar för humant synuklein, med de möss som får kontrollvektorn.För att definiera uppkomsten av humant synukleinuttryck behandlades möss med 10 till 10 virala genom per mus, av vektorer som kodar för humant synuklein eller skenkirurgi, och omfattningen av humant synukleinuttryck analyserades i substantia nigra, en gång i veckan, under veckorna två till fem efter stereotaxisk kirurgi. Resultaten visar att det mänskliga synukleinuttrycket började vara tydligt vecka fem efter stereotaxisk operation. För att bestämma toppen av mikroglial aktivering kvantifierades omfattningen av celler som uttrycker höga nivåer av Iba1 i striatum hos möss under veckorna 2-15 efter operationen.Resultaten visar en signifikant ökning av mikroglial aktivering av ipsilateralsidan, jämfört med den kontralaterala sidan av möss, 15 veckor efter virusinokuleringen. Antalet regulatoriska T-celler som infiltrerades i den betydande nigra analyserades vid olika tidpunkter, efter stereotaxisk kirurgi genom immunofluorescens, följt av konfokalmikroskopiobservation. Toppen av regulatorisk T-cellinfiltration i substantia nigra observerades vid vecka 11 efter operationen.Musmodellen för neurodegeneration som analyseras här representerar en användbar modell för att studera antal viktiga aspekter i patofysiologi vid Parkinsons sjukdom. Involveringsmekanismer involverade i synukleinpatologi, mikroglial aktivering, involvering av det perifera immunsystemet, vid neuroinflammation och mekanismerna för neurodegeneration En korrekt dos av adenoassocierad viral vektor, subtyp fem som kodar för humant synuklein för att inducera neurodegeneration, neuroinflammation, T-cellsinfiltration och motorisk försämring, är 10 till de 10 virala genomerna per mus. Denna studie visar, att fem veckor efter stereotaxisk operation, utgör en viktig tidpunkt, där mänskligt synukleinuttryck redan var uppenbart, men i avsaknad av motorisk försämring i denna djurmodell.Därmed representerar denna tidpunkt en intressant tidspunkt för att starta administreringen av experimentella terapier skräddarsydda för att stoppa utvecklingen av neuroinflammation och neurodegeneration. Den lämpligaste tidpunkten för att analysera neuroinflammation i denna djurmodell är vid vecka 15 efter en stereotaxisk operation. Medan en korrekt tidpunkt för att analysera T-cellinfiltration i centrala nervsystemet.verkar vara i vecka 11 efter viral vektorinokulering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakraniell Injektion av Adeno-associerad virala vektorer

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Upptäckt av Neuritic plack i Alzheimers sjukdom musmodell

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Metoder för att karaktärisera Spontan och skrämma inducerad Locomotion i en Rotenon-inducerad Parkinsons sjukdom modellen<em&gt; Drosophila</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulär Viral Injektion av neonatal mus hjärnans för långlivade och Utbredd neuronal Transduktion

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Konvektion förbättrad leverans av Optogenetiska Adeno-associerad viral vektor till cortex av Rhesus macaque under ledning av online MRI-bilder

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo direkt omprogrammering av bosatta gliaceller i interneuroner genom intracerebral injektion av virala vektorer

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Cochlears ytbehandling i den vuxna musen

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Tillämpa RatWalker-systemet för gånganalys i en genetisk råttmodell av Parkinsons sjukdom

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

6-hydroxydopaminråttmodellen för Parkinsons sjukdom

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...