Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

يود المؤلفون أن يعربوا عن امتنانهم لألين بوردا فارياس للمساعدة التقنية في فرن التفريغ ، وكذلك للإدارة في معهد البيولوجيا الجزيئية في بارانا (IBMP ، كوريتيبا ، البرازيل) للسماح بالوصول إلى المعدات المذكورة. تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال منحة CNPq 445954 / 2020-5.

1. تحضير محاليل المخزون وخليط الهلام
ملاحظة: سيتم تحضير أربعة محاليل مخزون (400 ملغم/مل من ميليزيتوز، 400 ملغم/مل من تريهالوز، 0.75 ملغم/مل من اللايسين، و200 ملغم/مل من الجليكوجين) وخلطها وفقا للنسبة المبينة في الجدول 1 لإنتاج خليط الهلام. على الرغم من أن البروتوكول...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

وقد أبرزت السنوات الأخيرة الحاجة إلى إيجاد تكنولوجيات أكثر حساسية وتحديدا للمساعدة في تشخيص الأمراض المدارية والمهملة. على الرغم من أهمية الاختبارات الطفيلية (المجهر الضوئي) والاختبارات المصلية للمكافحة الوبائية ، إلا أن لها قيودا ، خاصة فيما يتعلق بالحساسية وقابلية التطبيق في نقطة الر...

تم اكتشاف مرض شاغاس فيأوائل القرن العشرين في المناطق الريفية في البرازيل ، حيث كان الفقر منتشرا على نطاق واسع 1,2. وحتى اليوم، لا يزال المرض مرتبطا بالمحددات الاجتماعية والاقتصادية للصحة في الأمريكتين. مرض شاغاس ثنائي الطور ، ويتألف من مرحلة حادة ومزمنة. وهو ناتج عن العدوى بطفيلي المثقبية الكروزية ، الذي ينتقل عن طريق ناقلات الحشرات ، أو نقل الدم عبر الطريق الخلقي ، أو الابتلاع الفموي للأغذية الملوثة 3,4.
يمكن إجراء تشخيص مرض شاغاس من خلال ملاحظة الأعراض السريرية (خاصة علامة رومانا) ، والفحص المجهري لطاخة الدم ، والأمصال ، والاختبارات الجزيئية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR) أو التضخيم متساوي الحرارة4،5،6،7،8،9. تستخدم الأعراض السريرية والفحص المجهري لطاخة الدم في الحالات المشتبه في إصابتها بالعدوى الحادة ، بينما يستخدم البحث عن الأجسام المضادة كأداة فحص في المرضى الذين لا تظهر عليهم أعراض. نظرا لحساسيته وخصوصيته ، فقد تم اقتراح استخدام qPCR كأداة مراقبة للمرضى المزمنين ، للمرضى الحادين الذين يخضعون للعلاج لقياس حمل الطفيلي في الدم ، وكعلامة بديلة للفشل العلاجي6،8،10،11،12 . على الرغم من أنه أكثر حساسية وتحديدا من الاختبارات المتاحة حاليا ، إلا أن qPCR يمنع بشكل فعال من أن يعرف كأدوات تشخيصية في المناطق المحرومة في جميع أنحاء العالم بسبب متطلبات درجات الحرارة المتجمدة للنقل والتخزين13،14،15.
للتحايل على هذه العقبة ، تم استكشاف تقنيات الحفظ مثل التجفيد والهلام16,17. في حين أن التجفيد يوفر الحفظ لسنوات ، فإنه يتطلب كواشف مصنوعة خصيصا دون وجود الجلسرين ، والذي يستخدم عادة لتثبيت / حفظ الإنزيم18. بينما ثبت أن الهلام يوفر الحفظ لعدة أشهر ، فإنه يسمح باستخدام الكواشف العادية19. يتكون محلول الهلام من أربعة مكونات ، لكل منها أدوار محددة في العملية: السكريات trehalose و melezitose تحمي الجزيئات الحيوية أثناء عملية التجفيف عن طريق تقليل جزيئات الماء الحرة في المحلول ، ينتج الجليكوجين مصفوفة واقية أوسع ، ويستخدم ليسين الأحماض الأمينية ككاسح للجذور الحرة لمنع التفاعلات المؤكسدة بين كربوكسيل الجزيء الحيوي ، المجموعات الأمينية والفوسفات. تحدد هذه المكونات خليط سول جل يمنع فقدان البنية الثلاثية أو الرباعية أثناء عملية التجفيف ، مما يساعد على الحفاظ على نشاط الجزيئات الحيوية عند الإماهة19. بمجرد الاستقرار داخل أنابيب التفاعل ، يمكن تخزين التفاعلات لبضعة أشهر عند 2-8 درجة مئوية أو بضعة أسابيع عند 21-23 درجة مئوية بدلا من -20 درجة مئوية العادية. تم بالفعل دمج هذا النهج في الاختبارات المصممة للمساعدة في تشخيص أمراض مثل مرض شاغاس والملاريا وداء الليشمانيات والسل وداء السيكلوسبوريا13،14،15،20.
يصف هذا العمل جميع الخطوات لإعداد الحلول المطلوبة لإجراء الهلام ، والمزالق في العملية ، والجانب النهائي المتوقع من qPCR الهلامي الجاهز للاستخدام داخل شرائط ثمانية أنابيب. يمكن تكييف نفس البروتوكول مع الأنابيب المفردة أو ألواح 96 بئرا. أخيرا ، سيتم عرض اكتشاف الحمض النووي T. cruzi كتشغيل تحكم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR) تقنية حساسة ودقيقة بشكل ملحوظ تسمح بتضخيم كميات دقيقة من أهداف الحمض النووي من العديد من العينات. وقد تم استخدامه على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث وحقق التطبيق الصناعي في مجالات مثل التشخيص البشري واختيار السمات في محاصيل الكائنات المعدلة وراثيا (GMO). ومع ذلك ، فإن qPCR ليست تقنية مقاومة للخطأ. قد يؤدي خلط جميع الكواشف في مزيج رئيسي واحد يتم توزيعه لاحقا على 96 بئرا من لوحة qPCR العادية إلى أخطاء المشغل مثل الخلط غير الصحيح للكواشف أو التوزيع غير الدقيق في الآبار. هنا ، يتم تقديم تقنية تسمى الهلام ، حيث يتم استبدال معظم الماء الموجود في المزيج الرئيسي بالكواشف التي تشكل خليط سول جل عند تقديمه إلى فراغ. نتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على كواشف qPCR بشكل فعال لبضعة أسابيع في درجة حرارة الغرفة أو بضعة أشهر عند 2-8 درجةمئوية. يتم عرض تفاصيل تحضير كل محلول هنا جنبا إلى جنب مع الجانب المتوقع من تفاعل هلامي مصمم للكشف عن الحمض النووي للأقمار الصناعية T. cruzi (satDNA). يمكن تطبيق إجراء مماثل للكشف عن الكائنات الحية الأخرى. يعد بدء تشغيل qPCR الهلامي أمرا بسيطا مثل إزالة اللوحة من الثلاجة ، وإضافة العينات إلى الآبار الخاصة بها ، وبدء التشغيل ، وبالتالي تقليل وقت إعداد تفاعل اللوحة الكاملة إلى الوقت المستغرق لتحميل العينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إنتاج تفاعلات PCR الهلامية والتحكم فيها من أجل الجودة على دفعات ، مما يوفر الوقت وتجنب أخطاء المشغل الشائعة أثناء تشغيل تفاعلات PCR الروتينية.

ثلاثة من الكواشف التي تشكل خليط الهلام يمكن إذابتها بسهولة عند الدوامة القوية. ومع ذلك ، يتطلب الجليكوجين دوامة دقيقة لضمان ذوبان المسحوق تماما. لسوء الحظ ، تنتج الدوامة القوية الكثير من الفقاعات ، مما يجعل من الصعب تحديد الحجم الفعلي للمحلول (الشكل 1A-B). ?...

Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

يصف هذا العمل خطوات إنتاج qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي T. cruzi الذي يمكن تحميله مسبقا على وعاء التفاعل وتخزينه في الثلاجة لعدة أشهر.

qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي من المثقبية الكروزية أو الكائنات المسببة للأمراض الأخرى

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

ينتج بروتوكول الهلام تفاعلات qPCR جاهزة للاستخدام تقلل من الوقت والخطوات المطلوبة لبدء التشغيل. يسمح هذا البروتوكول بإنتاج تفاعلات qPCR والتحكم فيها من أجل الجودة والكميات الكبيرة في وقت واحد ، مما يقلل من فرص خطأ المشغل أثناء حسابات الوصفة أو الاقتباس في الآبار. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي qPCR تم تحسينه بالكامل بالفعل بالتنسيق المجمد التقليدي.يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مهما لأن خطوتين من خطوات مراقبة الجودة الرئيسية مرئية. لتحضير محلول ميليزيتوز ، قم بوزن أربعة جرامات من ميليزيتوز في أنبوب بلاستيكي سعة 15 ملليلتر ، وأضف ستة ملليلتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة حتى يذوب المسحوق. اجعل الحجم النهائي يصل إلى 10 ملليلتر بماء خال من النيوكلياز ، ثم قم بتسمية المحلول وتخزينه عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.لتحضير محلول تريهالوز ، قم بوزن أربعة جرامات من التريهالوز في أنبوب بلاستيكي سعة 15 ملليلتر ، أضف ستة ملليلتر من الماء الخالي من النيوكلياز ودوامة بأقصى سرعة حتى يذوب المسحوق. ثم قم بتكوين الحجم إلى 10 ملليلتر بالماء الخالي من النيوكلياز وتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرون. قم بتسمية المحلول وتخزينه عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.لتحضير محلول الجليكوجين ، قم بوزن جرامين من الجليكوجين في أنبوب سعة 15 ملليلترا ، وأضف ستة ملليلترات من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة حتى يذوب المسحوق. احتفظ بالمحلول عند درجتين إلى ثماني درجات سلزية لمدة ثماني إلى 12 ساعة لأن إذابة الجليكوجين تنتج الكثير من الفقاعات. في اليوم التالي ، قم بإزالة المحلول من الحضانة ، وقم بتكوين الحجم إلى 10 ملليلتر بالماء الخالي من النيوكلياز وتخزين المحلول المسمى عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.لتحضير محلول اللايسين ، قم بوزن 7.5 ملليغرام من اللايسين في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، وأضف ستة ملليلتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة حتى يذوب المسحوق. تشكل حجم إلى 10 ملليلتر مع الماء خالية من النيوكلياز. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرون وخزنه في درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.لتحضير خليط الهلام ، امزج الأحجام المناسبة من محاليل المخزون في أنبوب بلاستيكي سعة 50 ملليلتر. امزج الكواشف عن طريق قلب الأنبوب 10 مرات وتخزين المحلول المسمى عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. لتحضير مزيج qPCR الرئيسي للهلام ، قم بإذابة الكواشف في حاوية مبردة.ثم امزج كميات مناسبة من الكواشف في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر لإعداد مزيج رئيسي كاف لشريط ثمانية أنابيب أو لوحة بئر 96. ماصة التالية 18.5 ميكرولتر من مزيج الهلام الرئيسي على كل بئر تفاعل ووضع الأنابيب أو اللوحة في دعامة موصلة للحرارة داخل فرن التفريغ. في حالة استخدام 96 طبقا جيدا ، ضع كيسا واحدا من طين البنتونيت في الفرن لكل طبقين 96 بئرا لامتصاص الماء.عند اكتمال الدورة ، افحص الأنابيب أو الألواح بحثا عن الهلام المناسب للكواشف من خلال التأكد من تقليل الحجم بشكل واضح إلى حوالي خمسة ميكرولتر وأن السوائل لا تتحرك عند النقر على الأنابيب أو الألواح بالأصابع. أغلق الأنابيب أو الألواح وقم بتخزينها عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة ثماني إلى 12 ساعة قبل الاستخدام. لاستخدام qPCR الهلامي ، قم بإزالة شريط الأنبوب أو اللوحة من الثلاجة وافتحه في محطة عمل لمعالجة العينات.أضف 15 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز وخمسة ميكرولترات من عينة الحمض النووي (DNA) إلى كل وعاء تفاعل. أغلق الأنابيب أو الألواح ، وقم بإجراء التجربة المطلوبة ، وقم بإجراء تحليل منتظم للبيانات. في البروتوكول الحالي ، تظل درجة الحرارة داخل الغرفة ثابتة عند 30 درجة مئوية ، بينما يتراوح الضغط بين 910 إلى 930 مليبار وشبه فراغ.بعد دورة التفريغ ، يتناقص حجم المزيج الرئيسي داخل الأنبوب ، ويصبح هلاميا في الأسفل ولا يتناثر على الجدران عند النقر على الأنابيب. إذا كان الهلام غير مكتمل ، يتناثر السائل على جدران الأنبوب عند النقر على الأنابيب. يظهر هنا الكشف عن الحمض النووي للمثقبية الكروزية باستخدام تسلسلات قليلة النوكليوتيد المنشورة.أدى اكتشاف نفس العينة عندما لم يتم تنفيذ الهلام بشكل صحيح إلى فقدان الحساسية. الخطوة الأكثر أهمية هي حساب حجم الكواشف قبل الهلام. يجب أن يتذكر المشغل عدم إضافة الماء ، حيث سيتم إزالته أثناء العملية.إذا تم اتباع خطوات البروتوكول عن كثب ، فلن يواجه المشغلون ذوو المهارات المختبرية والبيولوجيا الجزيئية الأساسية صعوبة في أداء عملية الهلام.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

الكشف عن نشاط ج فوسفوليباسي في هوموجيناتي المخ من نحل العسل

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

عزل و1-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

إعداد الأقسام الفرعية بلاستيدات الخضراء من نبات لتحليل البروتين التعريب Immunoblotting أو البروتيوميات

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

التفريد الحمض النووي باستخدام أورانج Thiazole بدلاً من اثيديوم بروميد أو الأصباغ البديلة

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

في المختبر فحص المخدرات ضد جميع مراحل دورة حياة المثقبيات الكروزية باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...