Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
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Los autores desean expresar su agradecimiento a Aline Burda Farias por la asistencia técnica con el horno de vacío, así como a la administración del Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil) por permitir el acceso a dicho equipo. Este trabajo fue financiado parcialmente por la subvención CNPq 445954/2020-5.

1. Preparación de soluciones madre y mezcla de gelificación
NOTA: Se prepararán cuatro soluciones madre (400 mg/ml de melezitosa, 400 mg/ml de trehalosa, 0,75 mg/ml de lisina y 200 mg/ml de glucógeno) y se mezclarán de acuerdo con la proporción mostrada en la Tabla 1 para producir la mezcla de gelificación. Aunque el protocolo describe 10 ml de producción de soluciones madre, se puede adaptar para volúmenes más bajos o más altos.
<ol><li>Solución...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

Los últimos años han puesto de relieve la necesidad de encontrar tecnologías más sensibles y específicas para ayudar a diagnosticar enfermedades tropicales y desatendidas. Aunque son importantes para el control epidemiológico, las pruebas parasitológicas (microscopía óptica) y serológicas tienen limitaciones, especialmente con respecto a la sensibilidad y la aplicabilidad en el punto de atención. Las técnicas de amplificación de ADN como la PCR, la amplificación isotérmica y las variaciones respectivas se ...

La enfermedad de Chagas fue descubierta a principios delsiglo XX en las regiones rurales de Brasil, donde la pobreza era generalizada 1,2. Incluso hoy en día, la enfermedad sigue estando conectada a los determinantes sociales y económicos de la salud en las Américas. La enfermedad de Chagas es bifásica, comprendiendo una fase aguda y otra crónica. Es causada por infección por el parásito Trypanosoma cruzi, siendo transmitida por insectos vectores, transfusiones de sangre por vía congénita o ingestión oral de alimentos contaminados 3,4.
El diagnóstico de la enfermedad de Chagas puede realizarse mediante la observación de síntomas clínicos (especialmente el signo de Gaña), microscopía de frotis de sangre, serología y pruebas moleculares como PCR en tiempo real (qPCR) o amplificación isotérmica 4,5,6,7,8,9. Los síntomas clínicos y la microscopía de frotis de sangre se utilizan en casos sospechosos de infecciones agudas, mientras que la búsqueda de anticuerpos se utiliza como una herramienta de detección en pacientes asintomáticos. Debido a su sensibilidad y especificidad, se ha sugerido que la qPCR sea utilizada como una herramienta de monitoreo para pacientes crónicos, para pacientes agudos sometidos a tratamiento que mide la carga del parásito en la sangre y como un marcador sustituto de fracaso terapéutico 6,8,10,11,12 . Aunque más sensible y específica que las pruebas disponibles actualmente, la qPCR se evita efectivamente de ser conocida como herramientas de diagnóstico en regiones desfavorecidas de todo el mundo debido al requisito de temperaturas de congelación para el transporte y almacenamiento13,14,15.
Para sortear este obstáculo, se han explorado técnicas de conservación como la liofilización y la gelificación16,17. Mientras que la liofilización proporciona conservación durante años, requiere reactivos especialmente fabricados sin la presencia de glicerol, que es comúnmente utilizado para la estabilización/conservación de enzimas18. Si bien se ha demostrado que la gelificación proporciona conservación durante meses, permite el uso de reactivos regulares19. La solución de gelificación comprende cuatro componentes, cada uno con funciones específicas en el proceso: los azúcares trehalosa y melezitosa protegen las biomoléculas durante el proceso de desecación al reducir las moléculas de agua libre en la solución, el glucógeno produce una matriz protectora más amplia y el aminoácido lisina se utiliza como eliminador de radicales libres para inhibir las reacciones oxidantes entre el carboxilo de la biomolécula, grupos amino y fosfato. Estos componentes definen una mezcla sol-gel que evita la pérdida de la estructura terciaria o cuaternaria durante el proceso de desecación, ayudando así a mantener la actividad de las biomoléculas tras la rehidratación19. Una vez estabilizadas dentro de los tubos de reacción, las reacciones pueden almacenarse durante unos meses a 2-8 °C o unas semanas a 21-23 °C en lugar de los -20 °C habituales. Este enfoque ya ha sido incorporado en pruebas diseñadas para ayudar a diagnosticar enfermedades como la enfermedad de Chagas, la malaria, la leishmaniasis, la tuberculosis y la ciclosporiasis13,14,15,20.
El presente trabajo describe todos los pasos para preparar las soluciones requeridas para el procedimiento de gelificación, las trampas en el proceso y el aspecto final esperado de una qPCR gelificada lista para usar dentro de tiras de ocho tubos. El mismo protocolo se puede adaptar para tubos individuales o placas de 96 pocillos. Finalmente, la detección de ADN de T. cruzi se mostrará como una ejecución de control.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

La PCR en tiempo real (qPCR) es una técnica notablemente sensible y precisa que permite amplificar cantidades diminutas de objetivos de ácido nucleico a partir de una multitud de muestras. Se ha utilizado ampliamente en muchas áreas de investigación y ha logrado una aplicación industrial en campos como el diagnóstico humano y la selección de rasgos en cultivos de organismos genéticamente modificados (OGM). Sin embargo, la qPCR no es una técnica a prueba de errores. La mezcla de todos los reactivos en una sola mezcla maestra distribuida posteriormente en 96 pocillos de una placa de qPCR regular podría dar lugar a errores del operador, como la mezcla incorrecta de reactivos o la dispensación inexacta en los pozos. Aquí, se presenta una técnica llamada gelificación, mediante la cual la mayor parte del agua presente en la mezcla maestra es sustituida por reactivos que forman una mezcla sol-gel cuando se somete al vacío. Como resultado, los reactivos de qPCR se conservan eficazmente durante algunas semanas a temperatura ambiente o unos pocos meses a 2-8 oC. Los detalles de la preparación de cada solución se muestran aquí junto con el aspecto esperado de una reacción gelificada diseñada para detectar ADN satélite de T. cruzi (satDNA). Se puede aplicar un procedimiento similar para detectar otros organismos. Iniciar una serie de qPCR gelificada es tan simple como sacar la placa del refrigerador, agregar las muestras a sus respectivos pocillos y comenzar la corrida, disminuyendo así el tiempo de configuración de una reacción de placa completa al tiempo que lleva cargar las muestras. Además, las reacciones de PCR gelificadas se pueden producir y controlar para determinar la calidad en lotes, ahorrando tiempo y evitando errores comunes del operador mientras se ejecutan las reacciones de PCR de rutina.

Tres de los reactivos que forman la mezcla de gelificación se solubilizan fácilmente en vórtices vigorosos. Sin embargo, el glucógeno requiere un vórtice cuidadoso para garantizar que el polvo haya sido completamente solubilizado. Desafortunadamente, el vórtice vigoroso produce muchas burbujas, lo que dificulta determinar el volumen real de la solución (Figura 1A-B). Por lo tanto, es esencial dejar reposar la solución de glucógeno en el refrigerador...

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Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

El presente trabajo describe los pasos para producir qPCR lista para usar para la detección de ADN de T. cruzi que puede precargarse en el recipiente de reacción y almacenarse en el refrigerador durante varios meses.

QPCR lista para usar para la detección de ADN de Trypanosoma cruzi u otros organismos patógenos

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

El protocolo de gelificación produce reacciones de qPCR listas para usar que disminuyen el tiempo y los pasos necesarios para iniciar una carrera. Este protocolo permite que las reacciones de qPCR se produzcan y controlen para determinar la calidad y grandes cantidades a la vez, disminuyendo las posibilidades de error del operador durante los cálculos de recetas o la alícuota en pozos. Este método se puede aplicar a cualquier qPCR que ya esté totalmente optimizada en el formato congelado convencional.La demostración visual de este método es importante porque dos de los principales pasos de control de calidad son visuales. Para preparar la solución de melezitosa, pese cuatro gramos de melezitosa en un tubo de plástico de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórtice a velocidad máxima hasta que el polvo esté solubilizado. Haga el volumen final a 10 mililitros con agua libre de nucleasa, luego etiquete y almacene la solución a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de seis meses.Para preparar la solución de trehalosa, pese cuatro gramos de trehalosa en un tubo de plástico de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórtice a la velocidad máxima hasta que el polvo esté solubilizado. Luego enrasar el volumen a 10 mililitros con agua libre de nucleasas y filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 micras. Etiquete y guarde la solución a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de seis meses.Para preparar la solución de glucógeno, pese dos gramos de glucógeno en un tubo de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórtice hasta que el polvo esté solubilizado. Mantenga la solución a dos a ocho grados centígrados durante ocho a 12 horas porque la solubilización del glucógeno produce muchas burbujas. Al día siguiente, retirando la solución de la incubación, enrasar el volumen a 10 mililitros con agua libre de nucleasas y almacenar la solución etiquetada a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de seis meses.Para preparar la solución de lisina, pese 7.5 miligramos de lisina en un tubo de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórtice hasta que el polvo esté solubilizado. Enrasar el volumen a 10 mililitros con agua libre de nucleasas. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 micras y guárdela a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de seis meses.Para preparar la mezcla de gelificación, mezcle los volúmenes apropiados de soluciones madre en un tubo de plástico de 50 mililitros. Mezcle los reactivos invirtiendo el tubo 10 veces y guarde la solución etiquetada a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de tres meses. Para preparar la mezcla maestra de qPCR para la gelificación, descongele los reactivos en un recipiente refrigerado.Luego mezcle los volúmenes apropiados de los reactivos en un tubo de 1.5 mililitros para preparar suficiente mezcla maestra para una tira de ocho tubos o una placa de 96 pocillos. A continuación, pipetear 18,5 microlitros de la mezcla maestra de gelificación en cada pocillo de reacción y colocar los tubos o la placa en el soporte conductor del calor dentro del horno de vacío. Si usa 96 placas de pozo, coloque una bolsa de arcilla de bentonita en el horno por cada dos placas de 96 pocillos para la absorción de agua.Cuando se complete el ciclo, verifique la gelificación adecuada de los reactivos en los tubos o placas asegurándose de que el volumen se reduzca visiblemente a unos cinco microlitros y que los líquidos no se muevan al golpear los tubos o placas con los dedos. Selle y guarde los tubos o placas a dos a ocho grados centígrados durante ocho a 12 horas antes de usarlos. Para usar la qPCR gelificada, retire la tira de tubo o la placa del refrigerador y ábrala en una estación de trabajo para la manipulación de muestras.Agregue 15 microlitros de agua libre de nucleasa y cinco microlitros de muestra de ADN a cada recipiente de reacción. Selle los tubos o placas, ejecute el experimento deseado y realice análisis de datos regulares. En el protocolo actual, la temperatura dentro de la cámara se mantiene constante a 30 grados centígrados, mientras que la presión varía entre 910 y 930 milibares y cerca del vacío.Después del ciclo de vacío, la mezcla maestra dentro del tubo disminuye de volumen, se gelifica en la parte inferior y no salpica las paredes cuando se golpean los tubos. Si la gelificación es incompleta, el líquido salpica las paredes del tubo cuando se golpean los tubos. La detección de ADN de Trypanosoma cruzi utilizando secuencias de oligonucleótidos publicadas se muestra aquí.La detección de la misma muestra cuando la gelificación no se ejecutó correctamente, resultó en una pérdida de sensibilidad. El paso más crítico es el cálculo del volumen de reactivos antes de la gelificación. El operador debe recordar no agregar agua, ya que se eliminará durante el proceso.Si se siguen de cerca los pasos del protocolo, los operadores con conocimientos básicos de laboratorio y biología molecular no tendrán dificultades para realizar el proceso de gelificación.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Investigación

Bioquímica

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Detección de actividad de fosfolipasa C en el homogeneizado de cerebro de la abeja

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Aislamiento de F1-ATPasa de los Protista parásito Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Estudio sobre el metabolismo de seis insecticidas sistémicos en un cultivo de suspensión celular recién establecido derivado del té (Camellia Sinensis L.) Hojas

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

In vitro Detección de drogas contra todas las etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...