Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (مجموعة التميز "توحيد الأنظمة في التحفيز") إلى T.F. و N.B. ومن قبل الوزارة الاتحادية للتعليم والعلوم (برنامج BMBF "HSP 2020" ، مشروع TU-WIMIplus SynTUBio) إلى F.-J.S. و T.M.T.T.

يكشف المؤلفون عن جميع وأي تضارب في المصالح.

في الطبيعة ، تحدث التلاعب بهياكل البروتين ووظائفه عادة بسبب الطفرات ، وهي الظاهرة التي تؤدي إلى تبادل هوية الأحماض الأمينية في مواقع معينة في تسلسل البروتين. يتم تطبيق هذه الآلية الطبيعية على نطاق واسع كطريقة للتكنولوجيا الحيوية لهندسة البروتين في شكل طفرات ، وتعتمد على ذخيرة الأحماض الأمينية الأساسية 20 المشاركة في العملية. بيد أن تبادل مخلفات البرولين يمثل إشكالية. نظرا لبنية المجموعة الأساسية الخاصة بها ، فهي بالكاد قابلة للتبديل مع البقايا ال 19 المتبقية لاستبدال72. على سبيل المثال ، يعرف البرولين عادة باسم قاطع البنية الثانوي في تسلسلات polypeptide بسبب سوء توافقه مع الهياكل الثانوية الأكثر شيوعا ، أي α-helix و β-strand. يتم فقدان ميزة البرولين هذه بسهولة عندما يتم تحور البقايا إلى حمض أميني آخر من الذخيرة الشائعة. يوفر استبدال البرولين بنظائره الكيميائية نهجا بديلا ، والذي يمكن من الحفاظ على ميزات العمود الفقري الأساسية لبقايا البرولين الأم مع فرض التحيز على انتقالاته التشكيلية المحددة أو إنتاج تعديلات للحجم الجزيئي والقطبية. على سبيل المثال ، من الممكن تزويد الثقافات البكتيرية بهياكل تناظرية مثل الهيدروكسي ، الفلورو ، الألكيل ، ديهيدروبرولين ، الهياكل ذات أحجام الحلقات المتغيرة وأكثر من ذلك ، مما يسهل إنتاج بروتين يحتوي على تغييرات محددة في بقايا البرولين.
تسمح طريقة دمج الضغط الانتقائي (SPI) الموصوفة في هذه الدراسة باستبدال عالمي ، أي بديل خاص بالبقايا لجميع البرولينات في البروتين المستهدف بنظائرها الكيميائية ذات الصلة. تنعكس أهمية الطريقة من خلال حقيقة أن SPI يسمح بإنشاء تغييرات تسلسل لا يمكن الوصول إليها من قبل تقنيات الطفرات الشائعة. على سبيل المثال ، يسمح بإنتاج بروتين مستهدف يحتوي على تغييرات هيكلية صغيرة إلى حد ما قد لا تتجاوز عادة واحدة أو اثنتين من عمليات استبدال / حذف / إضافة الذرة ، كما هو موضح في هذه الدراسة. ويطلق على هذه التعديلات البروتينية اسم "الطفرات الذرية"73,74. في بروتين الفلورسنت مثل GFP ، يمكن رؤية نتيجة هذا الاختراق الجزيئي في سرعة الطي ، والقطبية المحلية ، وتعبئة البروتين ، واستقرار السمات الهيكلية المعنية. يتم إنتاج التغيرات في خصائص الامتصاص والتألق بشكل غير مباشر بسبب التأثير على طي البروتين والبيئات الدقيقة المتبقية. عادة ما تكون دقة التغيرات الجزيئية التي يقوم بها SPI أعلى بكثير ، مقارنة بطفرات البرولين إلى المخلفات الأساسية الأخرى ، وعادة ما تكون الأخيرة ضارة بطي البروتين وإنتاجه وعزله.
كطريقة إنتاج ، يستخدم نهج SPI تحمل الركيزة لجيب سينثيتاز aminoacyl-tRNA نحو النظائر الكيميائية للحمض الأميني الأصلي. ال synthetase هو المسؤول عن التحديد الصحيح لبنية الأحماض الأمينية ، في حين أن الاندماج في البروتينات يحدث في اتجاه مجرى النهر في عملية الترجمة. من الناحية الأداتية ، يتم تنفيذ إنتاج البروتين وعزله وتنقيته في SPI بطريقة نموذجية لأي تقنيات أخرى للتعبير عن البروتين المؤتلف. ومع ذلك ، مع بعض الإضافات إلى البروتوكول على النحو التالي: يتم توفير البرولين ، الذي لا بد من استبداله ، في بداية عملية التخمير ، بحيث يمكن للخلايا أن تنمو وتطور آلاتها الخلوية السليمة. ومع ذلك ، لا يسمح لمزرعة الخلايا بالوصول إلى أقصى كثافة بصرية ، للحفاظ على الخلايا في المرحلة اللوغاريتمية المثلى للتعبير عن البروتين. هناك نوعان من الاختلافات الرئيسية لطريقة SPI في هذه المرحلة. في الأول ، يتم ضبط تركيز البرولين في وسط النمو الأولي (وسط محدد كيميائيا) بحيث يحدث استنفاد البرولين دون أي تدخل خارجي. تستنفد الخلايا البرولين في الوسط قبل أن تتمكن من الخروج من مرحلة النمو اللوغاريتمي ، وبعد ذلك ، يتم إضافة التناظرية ، ويتم تحفيز إنتاج البروتين محل الاهتمام. في الإصدار الثاني من الطريقة ، تزرع الخلايا في الوسط الذي يحتوي على البرولين حتى منتصف مرحلتها اللوغاريتمية. في هذه المرحلة ، يجب إخراج الخلايا ونقلها جسديا إلى وسط آخر ، لم يعد يحتوي على البرولين ، فقط التناظرية ، مع تحريض لاحق للبروتين محل الاهتمام. في كلا الإصدارين ، يتم توفير كاشف تحريض البروتين والتناظري للخلايا المزروعة مسبقا. يتم إجراء عزل وتنقية البروتين من النوع البري بنفس الطريقة التي يتم بها إجراء المتغيرات. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام كل سلالة Pro-auxotrophic المتاحة كمضيف تعبير. ومع ذلك ، ينصح بإجراء اختبارات التعبير لتحديد المضيف الأنسب. أيضا ، يمكن استخدام اختبارات الوسائط المختلفة المحددة كيميائيا لتحسين إنتاج البروتين.
هناك متطلبات معينة فيما يتعلق بالنظيرات الكيميائية التي يجب مراعاتها ل SPI ، مثل الذوبان والتركيز. يعتمد التوافر الأيضي وامتصاص الأحماض الأمينية على عدد الجزيئات الذائبة في الوسط. لزيادة قابلية ذوبان مركب معين ، يمكن اختيار الظروف الحمضية أو القلوية قليلا. نظرا لأن الجزيئات الاصطناعية يمكن أن تسبب تأثيرات مثبطة للنمو بسبب سميتها الخلوية ، فيجب خفض التركيز إلى الحد الأدنى لتجنب إجهاد الخلايا75.
نقطة ضعف طفيفة في SPI هي انخفاض كفاءة التأسيس مع أعداد أكبر من المواقف التي تحتاج إلى تبادل. من حيث المبدأ ، يمكن أن يؤدي تقليل تردد الأحماض الأمينية داخل الجزيء الحيوي المستهدف عن طريق الطفرات الموجهة إلى الموقع إلى حل هذه المشكلة. ومع ذلك ، قد تتأثر الخصائص الهيكلية والوظيفية للبروتين المطلوب بتغيير البنية الأولية.
كما ذكرنا من قبل ، يسمح SPI باستبدال الأحماض الأمينية الأساسية الخاصة بالبقايا. وهذا يعني أنه يتم إدخال الأحماض الأمينية غير الأساسية في كل موضع من الحمض الأميني الأساسي داخل البروتين المستهدف ، بما في ذلك المخلفات المحفوظة التي لا غنى عنها لوظيفة البروتين أو الطي. الطرق البديلة للتأسيس الخاص بالموقع هي الإمكانية الوحيدة للتغلب على هذه المشكلة3. في العقود القليلة الماضية ، تم تطوير طريقة الزوج المتعامد التي يمكن أن تنتج بروتينات تحتوي على بقايا معدلة في مواقع محددة مسبقا. يعرف التعديل الأكثر شيوعا لهذه الطريقة باسم قمع الكودون التوقفي. تعتمد هذه الطريقة على نظام ترجمة متعامد هندسي مخصص لدمج الأحماض الأمينية الاصطناعية76 في موقع محدد. تم دمج أكثر من 200 حمض أميني مع تعديلات مختلفة في السلسلة الجانبية في البروتينات حتى الآن باستخدام هذا النهج77. ومع ذلك ، لا تزال أنظمة الترجمة هذه غير مناسبة لإدخال نظائر البرولين في البروتينات المستهدفة. علاوة على ذلك ، يعتبر أداء الطريقة منخفضا في حالة التعديلات الطفيفة على الأحماض الأمينية لأن بعض الاختلاط في الخلفية لسينثيتاز أمينواسيل-tRNA يبقى عادة في أنظمة الترجمة الهندسية.
باستخدام SPI ، أنتجنا عددا من متغيرات البروتين الفلوري β برميل ودرسنا نتائج تبادل البرولين مع نظائره غير الطبيعية. في حالة استبدال البرولين ب R-Flp و Dfp ، تم إنتاج بروتين مختل وظيفيا بواسطة مضيف التعبير. من المحتمل أن ينتج التأثير عن طريق سوء طي البروتين. قد ينشأ هذا الأخير من تشكيل C 4-exo الذي تروج له R-Flp ، والذي لا تفضله هياكل البروتين الأم27. مع Dfp ، من المرجح أن ينتج سوء الطي عن طريق السرعة المتناقصة لأيزومرات رابطة الببتيد عبر رابطة الدول المستقلة عند بقايا البرولين27. ومن المعروف أن هذا الأخير هو من بين الخطوات المحددة في المظهر الحركي للبروتين القابل للطي الذي يؤثر على تكوين برميل β ونضج الكروموفور اللاحق. في الواقع ، بالنسبة لكل من الأحماض الأمينية ، R-Flp و Dfp ، أدى إنتاج البروتين إلى بروتين مجمع وغير قابل للذوبان. وبالتالي ، لا يمكن أن يحدث تكوين الكروموفور ، وتم فقدان التألق بالكامل. ومع ذلك ، مع S-Flp و Dhp ، لوحظ نضج البروتين المناسب ، مما أدى إلى عينات بروتين الفلورسنت لكل تركيبة تناظرية / بروتينية. على الرغم من بعض التعديلات في ميزات الامتصاص والتألق للبروتين ، إلا أنها ظلت مشابهة إلى حد كبير لتلك الموجودة في البروتينات البرية. تم الكشف عن تأثير استبدال الأحماض الأمينية في دراسات الحركية القابلة للطي. وقد أظهرت دراسات نموذج S-Flp أن هذه البقايا قد تولد بعض التحسن في سرعة دوران الأميد العابر إلى رابطة الدول المستقلة وتؤدي إلى تكوين التشكيل C4-endo. ومن المرجح أن يسهم هذان العاملان في الآثار الحركية المفيدة لهذه البقايا في EGFP. في المقابل ، أنتجت Dhp ملامح قابلة للطي حركية تشبه إلى حد كبير البروتين الأم. يوضح تنوع النتائج الناتجة عن مجرد طفرات ذرية في بروتينات الفلورسنت التي تم فحصها إمكانات طريقة إنتاج SPI في تغيير خصائص البروتين المستهدفة. إن تغيرات البروتين الناجمة عن استبدال البرولين مع نظائرها لها آثار أخرى في هندسة الإنزيمات78,79,80 والقنوات الأيونية81,82 ، وكذلك في الهندسة العامة لاستقرار البروتين.
القيد الأساسي لطريقة SPI هو وضع "الكل أو لا شيء" في تبادل البرولين الموجود مع النظير ذي الصلة. وسيكون من المفيد جدا أن تكون قادرا على الاختيار بدقة، أي بقايا البرولين ينبغي الاستعاضة عنها بنظائرها، وأيها ينبغي أن يظل دون تعديل. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر ، لا توجد تقنية يمكنها إجراء مثل هذا الإنتاج المتطور باستخدام مضيف إنتاج ميكروبي. التوليف الكيميائي للبروتينات 83,84 ، وكذلك الإنتاج الخالي من الخلايا 85,86 ، هما الطريقتان البديلتان اللتان يمكنهما إنتاج تعديلات البرولين الخاصة بالموقف. ومع ذلك ، فإن تعقيدها التشغيلي وانخفاض غلة الإنتاج يجعلها أقل شأنا مقارنة بالإنتاج في الخلايا الحية. اعتبارا من الآن ، لا يزال SPI هو النهج الأكثر بساطة وقوة من الناحية التشغيلية لإنتاج البروتينات المعقدة التي تحمل طفرات ذرية. من خلال إدخال بدائل الأحماض الأمينية غير الطبيعية ، تسمح هذه الطريقة بتعديل ميزات البروتين بطريقة مستهدفة ، كما هو موضح هنا من خلال التغييرات في الطي وامتصاص الضوء / انبعاث البروتينات الفلورية الناتجة عن بدائل البرولين.

يسمح الطفرات الكلاسيكية الموجهة للموقع بتباديل أي تسلسل بروتين مشفر جينيا موجودا عن طريق التلاعب بالكودون على مستوى الحمض النووي. لدراسة طي البروتين واستقراره ، غالبا ما يكون من المستحسن استبدال الأحماض الأمينية المماثلة بنظيراتها المماثلة. ومع ذلك ، فإن طفرات البروتين التقليدية تقتصر بالتأكيد على بدائل مماثلة هيكليا بين الأحماض الأمينية الأساسية مثل Ser / Ala / Cys و Thr / Val و Glu / Gln و Asp / Asn و Tyr / Phe ، والتي توجد في ذخيرة الشفرة الوراثية القياسية. من ناحية أخرى ، لا توجد مثل هذه الاحتمالات للأحماض الأمينية الأساسية الأخرى مثل Trp أو Met أو His أو Pro ، والتي غالبا ما تلعب أدوارا هيكلية ووظيفية أساسية في البروتينات1. النهج المثالي لدراسة هذه التفاعلات في سياق البنية الداخلية المحددة للغاية للبروتينات وعملية طيها هو توليد تعديلات متساوية غير مدمرة. في الواقع ، عندما يتم إدخال نظائر الأحماض الأمينية متساوي الستيريك لهذه الأحماض الأمينية الأساسية ، والمعروفة أيضا باسم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NCAAs) ، في البروتينات ، فإنها تسمح بتغييرات طفيفة حتى على مستوى الذرات المفردة أو مجموعات الذرات مثل H / F ، CH2 / S / Se / Te المعروفة باسم "الطفرات الذرية"2. تنتج هذه "الجراحة الجزيئية" بروتينات معدلة تنتج خصائصها فقط عن تبادل الذرات المفردة أو مجموعات الذرات ، والتي يمكن تحليلها في الحالات المواتية ، ويمكن ترشيد التغييرات المكتشفة. وبهذه الطريقة ، يمتد نطاق تخليق البروتين لدراسة طي البروتين وبنيته إلى ما هو أبعد من طفرات الحمض النووي الكلاسيكية. لاحظ أن البروتينات الناتجة عن الطفرات الموجهة للموقع يشار إليها عادة باسم "الطفرات" ، في حين يشار إلى البروتينات التي تحتوي على أحماض أمينية أساسية بديلة باسم "المتغيرات" 3 أو "البروتينات" 4 أو "متجانسات البروتين"5.
يظهر بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، الذي تم تحديده لأول مرة في الكائن البحري Aequorea Victoria ، تألقا أخضر ساطعا عند تعرضه للضوء فوق البنفسجي إلى الأزرق 6,7. اليوم ، يستخدم GFP بشكل شائع كأداة وضع علامات حساسة للغاية للتصور الروتيني للتعبير الجيني وتوطين البروتين في الخلايا عبر الفحص المجهري الفلوري. وقد أثبتت GFP أيضا أنها مفيدة في مختلف الدراسات الفيزيائية الحيوية8،9،10 والطبية الحيوية 11،12 ، وكذلك في هندسة البروتين13،14،15. مكن التحليل الدقيق لهيكل GFP من إنشاء العديد من المتغيرات التي تتميز بالاستقرار المتنوع والتألق الأقصى16,17. معظم متغيرات GFP المستخدمة في البيولوجيا الخلوية والجزيئية هي بروتينات أحادية اللون سواء في المحلول أو في البلورة18. تنظيمها الهيكلي الرئيسي نموذجي لجميع أفراد عائلة GFP ، بغض النظر عن أصلهم الجيني ، ويتكون من 11 خيوطا β تشكل ما يسمى برميل β ، في حين أن الحلزون α المتشابك يمر عبر مركز البرميل ويحمل الكروموفور (الشكل 1A). يتطلب النضج الذاتي للكروموفور (الشكل 1B) تحديد المواقع الدقيقة للسلاسل الجانبية المحيطة به في المكان المركزي للبروتين. يتم الحفاظ على العديد من هذه السلاسل الجانبية بشكل كبير في متغيرات GFP الأخرى19. في معظم البروتينات الفلورية من قناديل البحر مثل Aequorea Victoria ، يتكون الكروموفور الباعث للأخضر من حلقتين عطريتين ، بما في ذلك حلقة الفينول من Tyr66 والبنية الحلقية غير المتجانسة المكونة من خمسة أعضاء من إيميدازولينون (الشكل 1B). الكروموفور ، عندما يكون جزءا لا يتجزأ من مصفوفة البروتين بشكل صحيح ، يكون مسؤولا عن التألق المميز للبروتين بأكمله. يقع في وسط الهيكل ، في حين أن هيكل البرميل يعزله عن الوسط المائي20. إن تعرض الكروموفور للمياه السائبة سيؤدي إلى إخماد التألق ، أي فقدان التألق21.
يعد الطي السليم للبنية الشبيهة بالبرميل ضروريا لحماية الكروموفور من التبريد الفلوري22. تلعب بقايا البرولين (Pro) دورا خاصا في التنظيم الهيكلي ل GFP23. كونها غير قادرة على دعم β ، فإنها تشكل حلقات ربط مسؤولة عن الحفاظ على بنية البروتين ككل. ليس من المستغرب أن توجد 10-15 بقايا برولين في كل من GFPs المشتقة من Aequorea و Anthoathecata. يتم حفظ بعضها بشكل كبير في أنواع أخرى من البروتينات الفلورية β البرميل. من المتوقع أن يؤثر البرولين بشكل حاسم على خصائص الطي بسبب ميزاته الهندسية الغريبة. على سبيل المثال، في GFPs المشتقة من Aequorea، من بين بقايا البرولين العشرة (الشكل 2A)، تشكل تسعة منها ترانس وواحد فقط يشكل رابطة رابطة الدول المستقلة - الببتيد (Pro89). Pro58 ضروري ، أي غير قابل للتبديل مع بقية الأحماض الأمينية الأساسية ال 19. قد تكون هذه البقايا مسؤولة عن تحديد الموقع الصحيح لبقايا Trp57 ، والتي تم الإبلاغ عنها لتكون حاسمة لنضج الكروموفور وإجمالي GFP القابل للطي24. الجزء PVPWP مع ثلاثة بقايا برولين (Pro54 ، Pro56 ، Pro58) و Trp57 هو الجزء الأساسي من "الغطاء السفلي" في هيكل GFP من الشكل 1A. تم العثور على الشكل الهيكلي PVPWP في العديد من البروتينات مثل السيتوكروم وقنوات البوتاسيوم المنشطة بالجهد حقيقي النواة25. بدائل البرولين إلى الألانين في المواضع 75 و 89 ضارة أيضا بالتعبير عن البروتين والطي وإلغاء نضج الكروموفور. Pro75 و Pro89 هما جزء من "الجفن العلوي" الذي يدفن الكروموفور (الشكل 1A) ويتم حفظهما عبر بروتينات الفلورسنت β 11 التي تقطعت بها السبل23. هذان "الغطاءان" يبقيان الكروموفور مستبعدا من المذيب المائي ، حتى عندما يتم كسر البنية الثلاثية المستقرة جزئيا26. تحمي هذه البنية الجزيئية المحددة الفلوروفور من التبريد الفلوري التصادمي (الديناميكي) ، على سبيل المثال ، عن طريق الماء أو الأكسجين أو غيرها من الأربطة القابلة للانتشار.
من أجل إجراء الهندسة الجزيئية لبنية GFP ، ينبغي للمرء أن يدخل بدائل الأحماض الأمينية في البنية الأساسية للبروتين. تم إجراء العديد من الطفرات على GFP ، مما يوفر للمتغيرات استقرارا مرتفعا ، وطي سريع وموثوق به ، وخصائص فلورية متغيرة17. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، تعتبر طفرة بقايا البرولين نهجا محفوفا بالمخاطر بسبب حقيقة أنه لا يمكن لأي من الأحماض الأمينية الأساسية ال 19 المتبقية استعادة المظهر التوافقي لبقايا البرولين27 بشكل صحيح. وهكذا ، تم تطوير نهج بديل ، حيث يتم استبدال بقايا البرولين بهياكل أخرى قائمة على البرولين ، يطلق عليها اسم نظائر البرولين28. نظرا لتركيبته الكيميائية الدورية الفريدة ، يظهر البرولين انتقالين توافقيين مميزين (الشكل 1C): 1) تجعد حلقة البرولين ، وهي عملية سريعة تنطوي على تنظيم العمود الفقري ، والتي تؤثر في المقام الأول على زاوية التواء φ ، و 2) رابطة الببتيد cis/trans isomerization ، وهي عملية بطيئة تؤثر على طي العمود الفقري عبر زوايا التواء ω. نظرا لطبيعته البطيئة ، فإن الانتقال الأخير مسؤول عادة عن خطوات الحد من المعدل في عملية طي البروتين بأكمله. وقد تبين سابقا أن رابطة الببتيد CIS/trans isomerization حول بعض بقايا البرولين تتميز بخطوات بطيئة في طي متغيرات GFP. على سبيل المثال ، يتميز تكوين رابطة الدول المستقلة والببتيد في Pro89 بالخطوة البطيئة في عملية الطي لأنه يعتمد على انتقال الرابطة من trans إلى cis29. يمكن تحقيق إعادة طي أسرع بعد استبدال Pro89 بحلقة ببتيد متحولة بالكامل ، أي عن طريق إلغاء حدث الأيزومرات من رابطة الدول المستقلة إلى الترانس 30. بالإضافة إلى أيزومرات رابطة الدول المستقلة / عبر ، قد تولد انتقالات الثقب أيضا تغييرات عميقة في طي البروتين بسبب تنظيم العمود الفقري والتعبئة داخل البروتين الداخلي27,31.
تؤدي التعديلات الكيميائية إلى تغيير التحولات التوافقية الجوهرية لبقايا البرولين ، مما يؤثر على قدرة البروتين على الطي. بعض نظائر البرولين هي مرشحات جذابة بشكل خاص لاستبدال البرولين في البروتينات لأنها تسمح بالتلاعب ودراسة خصائص الطي. على سبيل المثال ، (4R) - فلوروبرولين (R-Flp) ، (4S) - فلوروبرولين (S-Flp) ، 4،4-ثنائي فلورو برولين (Dfp) ، و 3،4-ديهيدروبرولين (Dhp) هي أربعة نظائر (الشكل 1D) تختلف اختلافا طفيفا عن البرولين من حيث كل من الحجم الجزيئي والقطبية32. في الوقت نفسه ، يعرض كل تناظري تجعد حلقة مميزة: S-Flp يستقر في C 4-endo pucker ، R-Flp يستقر في C 4-exo pucker ، Dfp لا يظهر أي تفضيل واضح للبكر ، بينما يلغي Dhp التجعد (الشكل 1D)33. باستخدام هذه النظائر في بنية البروتين ، يمكن للمرء أن يتلاعب بالانتقال التوافقي لبقايا البرولين ، ومع هذا ، يؤثر على خصائص متغيرات GFP الناتجة.
في هذا العمل ، شرعنا في دمج المجموعة المعينة من نظائر البرولين (الشكل 1D) في بنية متغيرات GFP باستخدام طريقة دمج الضغط الانتقائي (SPI ، الشكل 3)34. استبدال بقايا الأحماض الأمينية بأقرب نظائرها متساوية البنية هو مفهوم التكنولوجيا الحيوية المطبق في تصميم البروتين35,36. وبالتالي ، فإن تأثيرات نظائر البرولين في بروتين نموذجي توضح قدرتها على العمل كأدوات في هندسة البروتين37. تم إنتاج البروتينات التي تحتوي على نظائرها المرغوبة في سلالات E. coli المعدلة غير القادرة على إنتاج البرولين (البرولين-أوكسوتروفي). وبالتالي ، يمكن إجبارهم على قبول استبدال الركائز في عملية التخليق الحيوي للبروتين38. يتم تمكين هذا الاستبدال العالمي للبرولين من خلال مرونة الركيزة الطبيعية لمركب أمينواسيل-tRNA الداخلي39 ، الإنزيمات الرئيسية التي تحفز أسترة tRNAs مع الأحماض الأمينية المناسبة40. بشكل عام ، كما هو موضح في الشكل 3 ، يتم إجراء النمو الخلوي في وسط محدد حتى يتم الوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط. في الخطوة التالية ، يتم استنفاد الحمض الأميني المراد استبداله داخل الخلايا من نظام التعبير أثناء التخمير ثم يتم استبداله لاحقا بواسطة التناظرية المطلوبة أو ncAA. ثم يتم تحفيز تعبير البروتين المستهدف لدمج الأحماض الأمينية غير الأساسية الخاصة بالبقايا. يحدث استبدال الحمض الأميني cognate مع نظيره بطريقة على نطاق البروتين. على الرغم من أن هذا التأثير الجانبي قد يكون له تأثير سلبي على نمو سلالة المضيف ، إلا أن جودة إنتاج البروتين المستهدف لا تتأثر في الغالب ، لأنه ، في التعبير المؤتلف ، يتم توجيه الموارد الخلوية بشكل أساسي إلى إنتاج البروتين المستهدف41,42. لذلك ، فإن نظام التعبير المنظم بإحكام والقابل للحث والمروجين الأقوياء أمر بالغ الأهمية لكفاءة التأسيس العالية43. يعتمد نهجنا على الدمج المتعدد الخاص بالبقايا ل ncAAs استجابة للكودونات الحسية (إعادة تعيين كودون الحس) ، حيث يمكن التلاعب بعدد المواضع للإدراج التناظري Pro داخل الجين المستهدف عبر الطفرات الموجهة للموقع44. تم تطبيق نهج مماثل في تقريرنا السابق على إعداد الببتيدات المؤتلفة ذات الخصائص المضادة للميكروبات45. في هذا العمل ، قمنا بتطبيق طريقة SPI ، والتي تسمح باستبدال جميع بقايا البرولين بنظائرها ذات الصلة ، لتوليد بروتينات من المتوقع أن تمتلك خصائص فيزيائية كيميائية متميزة غير موجودة في البروتينات المصنعة مع ذخيرة الأحماض الأمينية الأساسية. من خلال توصيف ملف تعريف الطي والتألق للمتغيرات الناتجة ، نهدف إلى عرض آثار البدائل الذرية في متغيرات GFP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

غالبا ما يكون استبدال بقايا البرولين (Pro) في البروتينات بالطفرات التقليدية الموجهة إلى الموقع بأي من الأحماض الأمينية الأساسية ال 19 المتبقية ضارا بطي البروتين ، وعلى وجه الخصوص ، نضج الكروموفور في بروتينات الفلورسنت الخضراء والمتغيرات ذات الصلة. البديل المعقول هو التلاعب بترجمة البروتين بحيث يتم استبدال جميع بقايا Pro - على وجه التحديد بنظيراتها ، وهي طريقة تعرف باسم دمج الضغط الانتقائي (SPI). يمكن استخدام التعديلات الكيميائية المدمجة كنوع من "الجراحة الجزيئية" لتشريح التغييرات القابلة للقياس بدقة أو حتى التلاعب بعقلانية بخصائص البروتين المختلفة. هنا ، توضح الدراسة فائدة طريقة SPI لدراسة دور البرولينات في تنظيم بنية β برميل نموذجية للمتغيرات الطيفية لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) مع 10-15 برولينات في تسلسلها: بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) ، NowGFP ، و KillerOrange. توجد المخلفات الاحترافية في أقسام الربط بين خيوط β الفردية وتشكل أغطية الإغلاق للسقالة البرميلية ، وبالتالي فهي مسؤولة عن عزل الكروموفور عن الماء ، أي خصائص التألق. تم إجراء تجارب دمج الضغط الانتقائي مع (4 R) - فلوروبرولين (R-Flp) ، (4 S) - فلوروبرولين (S-Flp) ، 4،4-ثنائي فلورو برولين (Dfp) ، و 3،4-ديهيدروبرولين (Dhp) باستخدام سلالة E. coli المختمنة بالبرولين كمضيف تعبير. وجدنا أن البروتينات الفلورية مع S-Flp و Dhp نشطة (أي الفلورسنت) ، في حين أن النظيرين الآخرين (Dfp و R-Flp) أنتجا بروتينات مختلة وظيفيا وغير مطوية. أظهر فحص امتصاص UV-Vis وملفات تعريف الانبعاثات الفلورية بعض التغييرات المميزة في البروتينات التي تحتوي على نظائرها Pro. أظهر فحص الملامح الحركية القابلة للطي في متغيرات EGFP عملية إعادة طي متسارعة في وجود S-Flp ، في حين كانت العملية مشابهة للنوع البري في البروتين الذي يحتوي على Dhp. تعرض هذه الدراسة قدرة طريقة SPI على إنتاج تعديلات طفيفة على بقايا البروتين على المستوى الذري ("الجراحة الجزيئية") ، والتي يمكن اعتمادها لدراسة البروتينات الأخرى ذات الاهتمام. وهو يوضح نتائج بدائل البرولين مع نظائرها الكيميائية الوثيقة على الخصائص القابلة للطي والطيفية في فئة البروتينات الفلورية β برميل.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

للتغلب على قيود الطفرات الكلاسيكية الموجهة للموقع ، تم دمج نظائر البرولين مع تعديلات محددة في العديد من البروتينات الفلورية. نوضح كيف يؤثر استبدال الهيدروجين بالفلور أو الواحد بروابط مزدوجة في بقايا البرولين ("الجراحة الجزيئية") على خصائص البروتين الأساسية ، بما في ذلك طيها وتفاعلها مع الضوء.

التبادل الخاص بالبقايا للبرولين بواسطة نظائر البرولين في البروتينات الفلورية: كيف تؤثر "الجراحة الجزيئية" للعمود الفقري على الطي والاستقرار

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

في معظم الحالات ، لا يكون الطفرات التقليدية الموجهة نحو الموقع مناسبة لدراسة الدور الوظيفي للبرولين في البروتينات. هنا ، نقدم طريقة لدمج نظائرها البرولين كأحماض أمينية غير قانونية في البروتينات المركبة الريبوسوميا للتحقيق في دور بقايا البرولين على طي البروتين ووظيفته. استبدال البرولين بالأحماض الأمينية القياسية هو نهج محفوف بالمخاطر.يسمح دمج نظائر البرولين بنوع من الجراحة الجزيئية. وبعبارة أخرى ، فإنه يقدم تغييرات جزيئية طفيفة للتأثير بشكل عقلاني على خصائص البروتين والتلاعب بها. نظرا لأن بقايا البرولين تلعب دورا أساسيا في استقرار سقالات البروتين ، فقد تكون تقنيتنا مفيدة لفهم الأسباب الكامنة وراء عجز طي البروتين ، والذي يكمن وراء بعض الحالات المرضية لدى البشر.إن تغيرات البروتين الناجمة عن بدائل البرولين لها آثار على الهندسة التكنولوجية الحيوية للإنزيمات وتوفر فرصا لتعزيز ترجمة البروتين الريبوسومي أو طيه. هذه الطريقة لا تتطلب معدات خاصة وأجهزة باهظة الثمن. وينبغي توخي الحذر بشكل خاص مع خطوات البروتوكول، التي يستنفد فيها البرولين الأصلي من ثقافات الإشريكية القولونية قبل إضافة نظائرها من البرولين.لبدء إنتاج البروتينات الفلورية مع البرولين الأصلي ، قم بتلقيح 200 ملليلتر من وسط NMM الطازج في قارورة Erlenmeyer سعة لترين مع ملليلترين من الثقافة بين عشية وضحاها. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في اهتزاز مداري عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 3.5 ساعات تقريبا. أثناء الحضانة ، قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي كل 30 دقيقة.عندما تصل الكثافة البصرية إلى 0.7 ، قم بتدوير تعليق الخلية وصب المادة الفائقة بلطف في النفايات. ثم ، اغسل الخلايا عن طريق التعليق في 50 ملليلتر من NMM البارد المثلج دون أي أحماض أمينية أو NMM بدون برولين. قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وصب السوبرناتانت في النفايات.بعد ذلك ، أعد تعليق بيليه الخلية عن طريق السحب اللطيف في 200 ملليلتر من NMM بدون برولين واستكماله بالأمبيسلين في قارورة Erlenmeyer سعة لترين ، واحتضن الخلايا في شاكر مداري لمدة 30 دقيقة للسماح بالنضوب الكامل للبرولين. بعد الحضانة ، أضف حجما مناسبا من L-proline أو نظائرها من نظائرها من محاليل المخزون 50 ملليمولار للحصول على تركيز نهائي واحد ملليمولار في تعليق الخلية. بعد ذلك ، حث التعبير عن البروتين المستهدف عن طريق إضافة 500-micromolar IPTG من محلول مخزون أحادي المول.عبر عن البروتين المستهدف بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري وقم بقياس الكثافة البصرية في اليوم التالي. جمع الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي وصب supernatant في النفايات. ثم ، اغسل الخلايا عن طريق السحب الدقيق في 50 ملليلتر من المخزن المؤقت المرتبط الذي يحتوي على 10٪ من الجلسرين.قم بتدوير الخلايا مرة أخرى ، وصب السوبرناتانت ، وتخزين حبيبات الخلية في أنبوب سعة 50 ملليلتر عند 20 أو 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من الاستخدام. قبل تقييم انبعاث التألق ، قم بإجراء SDS-PAGE للتأكد من أن نقاء العينة أعلى من 95٪ ثم ، اضبط عينات كل متغير بروتين منقى على تركيز 0.3 ميكرومول ، مع أخذ قيمة الامتصاص المحسوبة عند الطول الموجي المناسب كمرجع. تأكد من أن حجم العينة النهائي التقريبي هو 200 ميكرولتر.دع العينات المخففة تتوازن في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، انقل العينات إلى كوفيت كوارتز بطول سنتيمتر واحد وقم بقياس طيف الانبعاثات الفلورية للعينات باستخدام مطياف التألق. للحث على تمسخ ، قم بتخفيف عينات كل متغير بروتين عشرين ضعفا عن طريق إضافة ميكرولترين من عينات 300 ميكرومولار إلى 18 ميكرولتر من 1.11X PBS المخزن المؤقت الذي يحتوي على 8.89 من اليوريا المولية و 5.56 ملليمولار DTT.احتضان العينات عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف العينات 100 ضعف عن طريق إضافة 1،980 ميكرولتر من PBS تحتوي على DTT خمسة ملليمولات للحث على إعادة التشبع ونقل 200 ميكرولتر من العينات على الفور إلى كوفيت كوارتز بطول سنتيمتر واحد. أدخل كوفيت الكوارتز في مطياف التألق المناسب وراقب إعادة طي البروتين عن طريق الحصول على طيف التألق كل ثلاث ثوان على مدار 30 دقيقة.انقل العينات القابلة لإعادة الطي إلى أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر، ثم أغلق الغطاء وخزن العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام للسماح بإعادة الطي الكامل لمتغيرات EGFP. بعد 24 ساعة ، قم بقياس انبعاث التألق لعينات البروتين المطوية باستخدام نفس الطول الموجي للإثارة كما كان من قبل لالتقاط نقطة النهاية الزمنية لاستعادة التألق. الكريات من الخلايا التي تعبر عن البروتين الأصلي والمتغيرات التي تحمل S-fluoroproline و dehydroproline كان لها لون مشرق نموذجي بسبب الكروموفور السليم.في المقابل ، ظلت المتغيرات التي تحتوي على R-fluoroproline و difluoroproline عديمة اللون ، مما يشير إلى سوء الطي وترسب البروتين غير المطوي في أجسام التضمين. تحقق تحليل SDS-PAGE من وجود بروتينات غير قابلة للذوبان تحتوي على R-fluoroproline. في المقابل ، تم العثور على البروتينات الأصلية والمتغيرات الحاملة ل S-fluoroproline و dehydroproline في الكسور القابلة للذوبان.في تحليل الكروماتوغرافيا السائلة / قياس الطيف الكتلي ، أنتج كل استبدال للبرولين مع S-fluoroproline تحولا إيجابيا بمقدار 18 دالتون لكل بقايا برولين ، في حين أن الاستبدال ب dehydroproline أنتج تحولا سلبيا قدره دالتون اثنين لكل بقايا. في أطياف امتصاص الضوء والانبعاثات ، تم العثور على امتصاص الكروموفور عند 488 نانومتر ل EGFP و 493 نانومتر ل NowGFP. في KillerOrange ، تتكون منطقة امتصاص الكروموفور من نطاقين يقابلان حالتين تكوينيتين وشحنتين محتملتين للكروموفور المعقد.وعلاوة على ذلك، فإن أطياف التألق المسجلة عند الإثارة عند الأطوال الموجية القصوى المقابلة للامتصاص تعني ضمنا أن نظائرها لا تغير البيئة الكيميائية للكروموفورات. في تجارب إعادة الطي ، تعافى تألق كروموفور EGFP الأصلي جزئيا ، على الرغم من أن التألق الخاص بالتريبتوفان كان أكبر بعد إعادة التشبع. لوحظ سلوك مماثل للمتغير الذي يحتوي على ديهيدروبرولين.في EGFP المحتوي على S-fluoroproline ، لوحظت نتيجة مماثلة مع إثارة 295 نانومتر ، في حين تعافى التألق إلى حد أعلى بكثير عند 488 نانومتر. فقط متغيرات EGFP أظهرت حركية سريعة الطي مع استعادة انبعاثات التربتوفان أسرع مرتين مقارنة بانبعاث الكروموفور. يجب استخدام الثقافات البكتيرية الطازجة ذات وسائط النمو المناسبة.التقنيات المعقمة والرصد المنتظم لنمو الثقافة هي أيضا شروط مسبقة مهمة لنجاح التجربة. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على هندسة البروتين ، لأنها تسمح بدراسة دور الأحماض الأمينية الأساسية الأخرى. لهذا ، هناك حاجة إلى سلالات E.coli auxotrophic المناسبة ونظائرها من الأحماض الأمينية.مطلوب قياس الطيف الكتلي للبروتينات الكاملة كدليل تحليلي لتأكيد دمج نظائرها من الأحماض الأمينية غير القانونية. تسمح لنا طريقة SPI لدمج نظائرها البرولين بالتعامل مع العمود الفقري للبروتين مباشرة ، وتوفر مزايا للتصميم العقلاني وتسهيل إنتاج البروتينات من خلال الاستقرار العالمي وتحسين الترجمة الريبوسومية أو الطي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

الديناميكا الحرارية من البروتين للطي غشاء المقاسة بواسطة التحليل الطيفي الإسفار

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

الفلورسنت النانوية لقياس تركيز ايون في النظم البيولوجية

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

ميكروفلويديك الخلاطات لدراسة طي البروتين

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

الكمي لالعالمي الانبساطي وظيفة عن طريق تحليل يستند النمذجة-الحركية من Transmitral التدفق عبر الشكلية ملء Parametrized الانبساطي

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

تسليم والبروتينات، والببتيدات أو خلية بردة الجزيئات الصغيرة إلى الخلايا الحية التي الحضانة مع Endosomolytic الكاشف dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

دمج ايون الاستقطاب التركيز بين جنبا إلى جنب التبادل الأيوني الأغشية لمنع الانتشار من منطقة الاستقطاب

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

بيوبرينتينج الغضاريف والجلد الأنسجة النظير استخدام سلبية رواية خلط وحدة تقنية بريسيلولاريزيشن بيوينك

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...