Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
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这项工作得到了德国研究基金会（卓越集群“催化中的统一系统”）对T.F.和N.B.以及联邦教育和科学部（BMBF计划“HSP 2020”，TU-WIMIplus项目SynTUBio）对F.-J.S.的支持。和T.M.T.T.

1. 将表达质粒引入感受态促营养大 肠杆菌 细胞
<ol><li>将每个样品质粒，pQE-80L H6-EGFP，pQE-80L H6-NowGFP和pQE-80L H6-KillerOrange的1ng与原自营养大 肠 杆菌K12衍生菌株JM83（Addgene #50348或ATCC #35607）的50μL化学性质或电负载细胞混合，以根据可用的方案通过热休克方法或电穿孔进行转化46，47. 注意：表达载体pQE-80L EGFP-H6编码C端6xHis标记的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），表达载体pQE-80L H 6-NowGFP和pQE-80L H6-KillerOrange分别编码N端6xHis标记的NowGFP48或N末端6xHis标记的KillerOrange49，分别编码在pQE-80L质粒骨架中。所有靶基因都在由lac操作者调节的细菌T5启动子的控制之下。氨苄西林耐药性用作选择标记，ColE1作为复制的起源。有关pQE-80L质粒的更多信息，请参见材料表。来自菌株K-12和B的替代促营养性大肠杆菌也可用于表达，并且应该产生类似的结果。H6标记的单质子化（[M + H]+）野生型蛋白质（发色团成熟后）的计算分子量为27，745.33 Da（EGFP-H6），27，931.50 Da（H 6-NowGFP）和27，606.09 Da（H6-KillerOrange）。目标蛋白的主要结构在表1中给出（His-tag下划线）。NowGFP的His-tag序列中的谷氨酰胺（Q）在从Pletnev等人51接收到的NowGFP cDNA亚克隆到pQE-80L质粒中后通过DNA测序鉴定。它不会妨碍蛋白质纯化或荧光蛋白的性质。</li>
	<li>在37°C下在950μLSOC培养基中回收细胞1小时。</li>
	<li>将50μL回收的细胞扩散到含有葡萄糖（10g / L）和氨苄西林（100μg/ mL）的Luria琼脂（LA）培养基板上（参见 补充材料）。</li>
	<li>将LA培养基板在37°C下孵育过夜或30°C孵育24小时。</li>
</ol>2. 生产重组野生型荧光蛋白（含有规范脯氨酸）和选择性压力掺入（SPI）程序，以生产具有脯氨酸类似物（S-Flp，R-Flp，Dfp，Dhp）的荧光蛋白
<ol><li>含有pQE-80L EGFP-H 6、pQE-80L H 6-NowGFP和pQE-80LH 6-KillerOrange的促营养性大肠杆菌K12衍生菌株JM83的过夜培养<ol>
<li>使用无菌移液器吸头或接种环从LA培养基板中选择单个菌落，并将细胞重悬于5mL溶原肉汤（LB）培养基（参见 补充材料;含有10g / L葡萄糖，100μg/ mL氨苄西林）中无菌14mL聚苯乙烯培养管中。 注意：建议接种新鲜转化的菌落。储存在4°C下的LA培养基板上的细胞（来自步骤2.2.）应在几天内使用。</li>
		<li>在200-250rpm的轨道振荡器中在37°C下生长细胞培养物过夜。</li>
	</ol></li>
	<li>生产重组EGFP-H6，H6-NowGFP 和 H6-KillerOrange与天然脯氨酸和相应的蛋白质变体与脯氨酸类似物<ol><li>接种200毫升新鲜NMM培养基（7.5 mM（NH4）2SO4，50 mM K2HPO4 和22 mM KH2PO4，8.5 mM NaCl，1 mM MgSO4，20 mM D-葡萄糖，1 μg/ mL FeCl2，1 μg/ mL CaCl2，10μg/ mL硫胺素，10μg/ mL生物素，0.01μg/ mL微量元素（CuSO4， ZnCl2，MnCl2，（NH4）2MoO4），pH ~7.2）与所有规范的l-氨基酸（50mg / L）;参见 补充材料）补充100μg/ mL氨苄西林和2mL过夜培养物在2-L锥形瓶中。 注意：根据蛋白质的类型，可以测试替代培养基，如MOPS培养基52，葡萄糖 - 矿物盐培养基53，Davis最小培养基54，M9最小培养基55或GMML56 ，以优化蛋白质产量。</li>
		<li>将细胞在37°C下以220rpm在轨道振荡器中孵育〜3小时30分钟。</li>
		<li>每30分钟在分光光度计中测量600nm（OD 600）处的光密度，直到达到〜0.7的OD600 值。 注意：对于分光光度计中的OD600 测定，比色皿的路径长度应为1厘米。相应的培养基用于参考（“零”）测量。直到OD600 值达到〜0.7的孵育时间可能取决于培养体积。3小时30分钟是一个近似值。在方案子步骤2.2.1-2.2.3的变体中，培养子步骤2.1.2。用于接种补充有有限浓度脯氨酸（例如，5mg / L而不是50mg / L）的新鲜NMMΔPro培养基（参见 补充材料），并且细胞在37°C下以220rpm的轨道振荡器中生长过夜。第二天，每30 分钟进行一次OD 600测定，直到测量之间的差异小于0.05。最大 OD600 值应约为 1（± 0.3）。初始的有限脯氨酸浓度可以根据表达菌株和培养基进行调整（参见 讨论）。</li>
		<li>在3，000× g 和4°C下旋转细胞悬浮液10分钟。</li>
		<li>轻轻地将上清液倾析成废物。</li>
		<li>洗涤步骤：通过仔细移液将细胞重悬于50mL冰冷的NMMΔAA（不含任何氨基酸，参见 补充材料）或NMMΔPro（不含脯氨酸，参见 补充材料）培养基中。 注意：对于该洗涤步骤，可以使用两种所述缓冲液中的任何一种，因为仅除去孵育培养基中残留的脯氨酸才重要。</li>
		<li>通过在3，000× g 离心机中以4°C沉降将细胞从培养基中分离10分钟。</li>
		<li>轻轻地将上清液倾析成废物。</li>
		<li>轻轻地上下移液，将细胞沉淀重悬于200mL NMMΔPro培养基中，补充有100μg/ mL氨苄西林，放入2-L锥形瓶中。 注意：将所得的细胞悬浮液分离成几个等体积的样品，以获得相同的起始培养物，用于在Pro或脯氨酸类似物存在下比较蛋白质表达（例如，在100 mL锥形瓶中分离成4 x 50 mL）。</li>
		<li>在37°C下以220rpm在轨道振荡器中孵育30分钟，以完全耗尽Pro。 注意：此步骤对于从细胞中完全耗尽Pro至关重要。</li>
		<li>从50mM储备溶液中加入适当体积的 L-脯氨酸或R-Flp，S-Flp，Dfp和Dhp，以调节细胞悬浮液中的1mM终浓度。 注意：作为一般规则，在使用前应始终准备新的50 mM Pro或脯氨酸衍生物的储备溶液。仅当水溶液中特定规范性或非规范性氨基酸的水解不是问题时，才可以使用冷冻储备液。</li>
		<li>从1 M储备溶液中加入0.5mM IPTG以诱导靶蛋白表达。</li>
		<li>在37°C下以220rpm在轨道振荡器中表达目标蛋白过夜（12小时）。</li>
		<li>第二天测量OD600 。 注意：OD600 测定用于量化蛋白质表达后的细胞量。与洗涤步骤2.2.3之前测量的值相比，较低的OD600 值表明所供应氨基酸的细胞毒性。在这种情况下，应重复该过程，并将供应的氨基酸的浓度降至最低（低至0.1mM）。</li>
		<li>离心并收集细菌细胞在5，000× g 和4°C下10分钟，并将上清液倾析成废物。</li>
		<li>洗涤步骤：通过在含有10%甘油的50mM结合缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，1mM DTT）中小心移液重悬细胞，并将细胞悬浮液转移到50mL锥形聚苯乙烯管中。</li>
		<li>离心并收集细菌细胞在5，000× g 和4°C下10分钟，并将上清液倾析成废物。</li>
		<li>将细胞沉淀在-20°C或-80°C的50mL锥形聚苯乙烯管中，直到进一步使用（蛋白质纯化，见下文）。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 固定化金属离子亲和色谱（IMAC）纯化蛋白质样品
<ol><li>细菌细胞裂解 注意：在冰上或在4°C下执行细胞裂解的所有步骤，以防止目标蛋白的降解。<ol>
<li>将细菌细胞沉淀在冰上或在4°C下在50mL锥形聚苯乙烯管中解冻10-20分钟。</li>
		<li>加入10mL冰冷结合缓冲液（参见 补充材料），轻轻上下移液以重悬细胞沉淀。</li>
		<li>加入100μL50mg / mL溶菌酶，100μL1mg / mL DNase I，100μL 1mg / mL RNase A，30μL 1M MgCl2。小心地将细胞悬浮液倒置五次，并将封闭的管保持在冰上或在4°C下60分钟。 注意：溶菌酶通过破坏细菌细胞壁来诱导化学细胞裂解。</li>
		<li>使用超声均质机超声处理样品以进行细胞破坏（例如，在冰 - 水混合物上的50mL聚苯乙烯管中超声处理3次3分钟，脉冲2 s /暂停4 s，振幅45%）。 注意：或者，也可以使用其他细胞破碎方法，例如，在14，000 psi下在20个循环中进行高压均质化。如有必要，使用结合缓冲液（参见 补充材料）稀释以达到最小的仪器体积。此外，蛋白质提取试剂可用于细胞破碎。有关示例，请参阅 材料表 。</li>
		<li>在18，000× g，4°C下离心60分钟。</li>
		<li>记下子步骤 3.1.9 的液体体积。并将上清液倒入新鲜的50mL聚苯乙烯管中。</li>
		<li>使用孔径为0.45μm的膜过滤器清除上清液。</li>
		<li>以SDS-PAGE的“裂解物”样本为例（见下文第4节）;这对应于“可溶性蛋白质级分”，上清液来自亚阶3.1.6。</li>
		<li>加入子步骤 3.1.6 中确定的等体积的 ddH2O。重悬细胞碎片，以保持样品的相同稀释度，以便进行后续的SDS-PAGE分析。</li>
		<li>以SDS-PAGE的“颗粒”样本为例（见下文第4节）;这对应于“不溶性蛋白质部分”，即来自亚阶梯3.1.9的细胞碎片悬浮液。</li>
	</ol></li>
	<li>固定化金属亲和色谱 （IMAC） 纯化 注意：靶荧光蛋白的纯化可以在4°C或室温（RT）下进行。对于后一种选择，等待裂解液，色谱柱和所有缓冲液在RT处平衡，以防止由于放置在温柱中时被困在冷溶液中的空气蒸发而形成气泡。<ol>
<li>根据制造商的说明，使用1 mL预包装或自包装的IMAC FPLC（快速蛋白质[或高效]液相色谱）色谱柱纯化样品;将最大柱压设置为0.3 MPa，流量设置为1 mL / min;使用结合缓冲液（参见 补充材料）进行色谱柱平衡，使用洗涤缓冲液（参见 补充材料）进行洗涤步骤，使用洗脱缓冲液（参见 补充材料）进行目标蛋白质洗脱。 注意：或者，可以应用自动FPLC系统来洗脱目标蛋白，洗脱缓冲液运行线性咪唑浓度梯度（20-200 mM）。</li>
		<li>收集洗脱液级分与荧光蛋白（通过可见的绿色或橙色选择）混合。</li>
		<li>根据制造商的说明将合并的馏分转移到透析膜（分子量截止值（MWCO）为5，000-10，000）中，并用透析缓冲液或MS缓冲液透析至少三次（参见 补充材料）。例如，对100 mL缓冲液进行1mL样品透析三次，每轮至少2小时。有关详细的协议，请参阅Budia et al.34。</li>
		<li>在PBS缓冲液中制备透析洗脱部分的1：100倍稀释液（参见 补充材料）。</li>
		<li>在紫外可见分光光度计中记录稀释样品的吸光度光谱。</li>
		<li>根据兰伯特-比尔定律计算蛋白质浓度，如下所示，使用特定波长下摩尔消光系数ε文献值（对于EGFP在488nm处ε488 = 55，000 cm-1·M-1， NowGFP 在 493 nm ε493 = 53，600 cm-1·M-1， 杀手橙在514 nm ε514 = 22，600 cm-1·M-1）： <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63320/63320eq01.jpg"> （兰伯特-比尔定律） c蛋白质 = 蛋白质浓度 [毫克/毫升] A = 特定波长处的吸光度 ε = 特定波长下的摩尔消光系数 [M-1·cm-1] d = 比色皿路径长度，此处为 1 厘米 MW = 蛋白质分子量 [g/mol] 使用透析缓冲液（参见 补充材料）进行参考（“零”）测量。</li>
		<li>取SDS-PAGE的“洗脱液”样品（见下面的第4节），每个样品上样1-10μg蛋白质（根据上一步计算）用于考马斯亮蓝染色凝胶。 注意：如果使用与考马斯亮蓝不同的化合物进行蛋白质条带染色，则根据所应用的染色方法和染料的灵敏度调整SDS样品量。</li>
		<li>将蛋白质样品冷冻并储存在-80°C的透析缓冲液（参见 补充材料）中。 注意：在这种储存条件下，蛋白质样品应稳定至少6个月。替代实验室紫外可见分光光度计和荧光分光光度计可用于记录目标蛋白的吸收和荧光发射光谱。以下激发波长可用于荧光发射测量：488 nm （EGFP）、493 nm （NowGFP） 和 510 nm （KillerOrange）。</li>
	</ol></li>
</ol>4. SDS-PAGE 样品制备
<ol><li>从第3部分确定样品“洗脱液”，“裂解物”和“沉淀物”在280nm（A 280nm）处的吸光度A。通过添加适量的洗脱缓冲液来调节探针体积以达到A280nm = 2（最终探针体积应至少为80μL）。</li>
	<li>通过移液，以4：1（v / v）的比例将样品与5x SDS上样染料缓冲液（参见 补充材料）混合，例如，将80μL样品与20μL5x SDS上样缓冲液混合。</li>
	<li>将SDS样品在95°C下在水浴或加热块中煮沸5分钟以使蛋白质变性。</li>
	<li>让样品冷却至室温，并在微量离心机中以13，000× g 旋转探针1分钟，然后上样到凝胶上。</li>
	<li>使用5-10μL考马斯亮蓝色染色SDS-PAGE。有关SDS-PAGE程序的详细信息，请参阅57。 注意：根据所应用的染色方法和染料的灵敏度调整SDS样品量。应仔细检查SDS-PAGE的结果，以确保样品在与所需蛋白质的预期分子量相对应的条带中含有超过95%的总蛋白质。为此，拍摄考马斯染色凝胶的照片，并通过密度测量将所需分子量的蛋白质条带的强度与泳道中所有其他条带（如果有）的强度进行比较。对于带强度的密度评估，可以使用软件ImageJ58。为了实验证明将所需的ncAA掺入感兴趣的蛋白质中，应按所述59进行通过高效液相色谱（HPLC）耦合到电喷雾电离飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS）的完整蛋白质质量分析（参见示例性设备的协议第5节和其中 的材料表 ）。</li>
</ol>5. 蛋白质变体的荧光发射
<ol><li>在手术之前，检查SDS-PAGE实验的结果，以确保样品纯度>95%（参见步骤4.5之后的注释）。</li>
	<li>将每个纯化的蛋白质变体的样品调节至0.3μM的浓度，以适当波长处计算的吸光度值作为参考（子步长3.2.5）。确保最终样品体积约为 200 μL。</li>
	<li>让稀释的样品在室温下平衡1小时。</li>
	<li>将样品转移到1厘米石英比色皿中，并使用荧光光谱仪（参见 材料表）测量样品的荧光发射光谱，应用以下激发波长：488nm（EGFP），493nm（NowGFP），510nm（KillerOrange）。</li>
</ol>6. EGFP变体的变性和重折叠
<ol><li>在手术之前，检查SDS-PAGE实验的结果，以确保样品纯度>95%（参见步骤4.5之后的注释）。</li>
	<li>为每个纯化的蛋白质变体制备两个2μL终体积的样品，浓度为300μM（参见子步骤3.2.4-3.2.6中的蛋白质浓度测定）。</li>
	<li>向2μL每种纯化的蛋白质变体中加入18μL含有8.89M尿素和5.56mM DTT的1.11x PBS缓冲液（参见 补充材料）以诱导变性。 注意：对于步骤6.4-6.6，请单独处理每个样品。</li>
	<li>将样品在95°C下孵育5分钟。</li>
	<li>通过加入1980μL含有5mM DTT的1x PBS（参见 补充材料）来诱导再饱和，产生0.3μM最终蛋白质浓度，并立即将200μL样品转移到1cm石英比色皿中，将200μL样品稀释100倍。 注意：在这里快速工作非常重要，因为恢复饱和会立即开始。</li>
	<li>将石英比色皿插入适当的荧光光谱仪（参见 材料表），并通过在30分钟内每3秒获得荧光光谱来监测样品中的蛋白质重折叠。对于每种蛋白质变体，对第一个样品使用295nm荧光激发，对第二个样品使用488nm荧光激发。</li>
	<li>将重新折叠的样品转移到1.5 mL微量离心管中，关闭盖子并将样品在室温下在黑暗中储存24小时，以便完全重新折叠EGFP变体。</li>
	<li>根据步骤6.6使用与之前相同的激发波长测量重折叠蛋白质样品的荧光发射，以捕获荧光恢复的时间终点。</li>
</ol>

作者披露了所有和任何利益冲突。

在自然界中，对蛋白质结构和功能的操作通常是由于突变而发生的，突变是导致蛋白质序列中某些位置氨基酸身份交换的现象。这种自然机制以诱变的形式被广泛用作蛋白质工程的生物技术方法，它依赖于参与该过程的20种典型氨基酸的库。然而，脯氨酸残基的交换是有问题的。由于其特殊的骨干组架构，它几乎不能与剩余的19个残基物互换以替换72。例如，脯氨酸在多肽序列中通常被称为二级结构破坏剂，因为它与最常见的二级结构（即α螺旋和β链）的相容性较差。当残基从普通库中突变为另一种氨基酸时，这种脯氨酸特征很容易丢失。用其化学类似物取代脯氨酸提供了一种替代方法，可以保持母体脯氨酸残基的基本骨架特征，同时对其特定的构象转变施加偏差或产生分子体积和极性的调节。例如，可以向具有类似结构的细菌培养物提供例如羟基，氟，烷基，脱氢脯氨酸，具有可变环尺寸等的结构，从而促进含有特定脯氨酸残基改变的蛋白质的产生。
本研究中描述的选择性压力掺入（SPI）方法允许用相关的化学类似物全局，即残基特异性替换目标蛋白中的所有脯氨酸。该方法的重要性反映在SPI允许创建常见诱变技术无法实现的序列更改这一事实中。例如，它允许产生含有相当小的结构变化的靶蛋白，这些变化通常不超过一个或两个原子替换/缺失/添加，如本研究所示。这种蛋白质修饰被称为“原子突变”73，74。在诸如GFP之类的荧光蛋白中，这种分子侵入的结果可以在折叠速度，局部极性，蛋白质填料，所涉及的结构特征的稳定性中看到。吸光度和荧光特性的变化是由于对蛋白质折叠和残留微环境的影响而间接产生的。与脯氨酸突变到其他规范残基相比，SPI进行的分子变化的精度通常要高得多，后者通常对蛋白质折叠，生产和分离有害。
作为一种生产方法，SPI方法使用氨基酰基-tRNA合成酶口袋的底物耐受性来对天然氨基酸的化学类似物。合成酶负责氨基酸结构的正确鉴定，而掺入蛋白质发生在翻译过程的下游。在仪器上，SPI中的蛋白质生产，分离和纯化以任何其他重组蛋白表达技术的典型方式进行;然而，在方案中添加一些如下：在发酵过程开始时提供用于替代的脯氨酸，使得细胞可以生长并发展其完整的细胞机制。然而，不允许细胞培养达到最大光密度，以使细胞保持在对数相中最适合蛋白质表达。此时，SPI 方法有两种主要变体。在第一个中，在初始生长培养基（化学定义的培养基）中调整脯氨酸的浓度，使得脯氨酸的耗尽发生而没有任何外部入侵。细胞在离开对数生长期之前在培养基中耗尽脯氨酸，然后随后加入类似物，诱导感兴趣的蛋白质产生。在该方法的第二个版本中，细胞在含有脯氨酸的培养基中生长，直到其对数期的中间。此时，应将细胞取出并物理转移到另一种培养基中，该培养基不再含有脯氨酸，仅含有类似物，随后诱导感兴趣的蛋白质。在这两个版本中，将类似物和蛋白质诱导试剂提供给预生长的细胞。野生型蛋白质的分离和纯化以与变体相同的方式进行。原则上，每种可用的Pro-auxotropiic菌株都可以用作表达宿主。然而，建议进行表达测试以确定最合适的宿主。此外，还可以使用不同化学定义的培养基进行测试来优化蛋白质产量。
对于SPI需要考虑的化学类似物的某些要求，例如溶解度和浓度。氨基酸的代谢可用性和摄取取决于培养基中溶解分子的数量。为了增加特定化合物的溶解度，可以选择微酸性或碱性条件。由于人造分子由于其细胞毒性而可引起生长抑制作用，因此应将浓度降低到最低限度以避免细胞应激75。
SPI的一个小弱点是合并效率下降，需要交换的头寸数量更多。原则上，通过定点诱变降低目标生物分子内的氨基酸频率可以解决这个问题。然而，所需蛋白质的结构和功能特性可能会受到改变一级结构的影响。
如前所述，SPI允许对规范氨基酸进行残基特异性替换。这意味着非正则氨基酸入到靶蛋白内规范氨基酸的每个位置，包括蛋白质功能或折叠不可或缺的保守残基。特定地点合并的替代方法是克服这一问题的唯一可能性3.在过去的几十年中，已经开发了正交对方法，可以在预定义的位点产生含有修饰残基的蛋白质。这种方法最常见的修改称为停止密码子抑制。该方法基于专用于特定位点掺入合成氨基酸76的工程正交翻译系统。迄今为止，使用这种方法已经将200多种具有不同侧链修饰的氨基酸掺入蛋白质中77。然而，这些翻译系统仍然不适合将脯氨酸类似物插入靶蛋白中。此外，在轻微的氨基酸修饰的情况下，该方法的性能被认为是低的，因为氨基酰基-tRNA合成酶的一些背景混杂性通常保留在工程翻译系统中。
使用SPI，我们产生了许多β-桶荧光蛋白变体，并研究了脯氨酸与其非天然类似物交换的结果。在用R-Flp和Dfp替代脯氨酸的情况下，表达宿主产生功能失调的蛋白质。这种效应可能是由蛋白质错误折叠产生的。后者可能起源于由R-Flp促进的C 4-exo构象，其不受亲本蛋白结构27的青睐。使用Dfp，错误折叠可能是由脯氨酸残基27处的反式到顺式肽键异构化速度降低引起的。已知后者是蛋白质折叠动力学谱的限制性步骤之一，影响β-桶形成和随后的发色团成熟。事实上，对于两种氨基酸，R-Flp和Dfp，蛋白质的产生导致了聚集和不溶性蛋白质。因此，发色团的形成不会发生，荧光完全丧失。然而，使用S-Flp和Dhp，观察到适当的蛋白质成熟，从而为每个类似物/蛋白质组合产生荧光蛋白质样品。尽管蛋白质的吸光度和荧光特征有一些调节，但这些在很大程度上与野生型蛋白质相似。氨基酸取代的作用在重折叠动力学研究中被揭示出来。模型研究表明，该残留物可能在反式到顺式酰胺旋转速度方面产生一些改善，并导致C4-内构象的形成。这两个因素都可能有助于EGFP中该残基的有益动力学效应。相比之下，Dhp产生的动力学折叠曲线与母蛋白最大相似。仅由所检查的荧光蛋白中的原子突变产生的结果的多样性说明了SPI生产方法在改变靶蛋白性质方面的潜力。用类似物替代脯氨酸诱导的蛋白质改变对酶78，79，80和离子通道81，82的工程以及蛋白质稳定性的一般工程具有进一步的影响。
SPI方法的基本局限性是其在将脯氨酸与相关类似物交换时的“全有或全无”模式。能够精确地选择哪些脯氨酸残基应该被类似物取代，哪些脯氨酸残基应该保持未修饰，这将是非常有利的。然而，目前，没有技术可以使用微生物生产宿主进行如此复杂的生产。蛋白质83，84的化学合成以及无细胞生产85，86是可以产生位置特异性脯氨酸修饰的两种替代方法。尽管如此，它们的操作复杂性和低产量使它们与活细胞的生产相比较差。截至目前，SPI仍然是生产具有原子突变的复杂蛋白质的最简单和最强大的方法。通过引入非天然氨基酸替代品，该方法允许以有针对性的方式修改蛋白质特征，例如通过脯氨酸替代物产生的荧光蛋白的折叠和光吸收/发射的改变。

经典的定点诱变允许通过在DNA水平上进行密码子操作来排列任何现有的基因编码蛋白序列。为了研究蛋白质的折叠和稳定性，通常需要用相似的氨基酸代替相似的氨基酸。然而，传统的蛋白质诱变绝对局限于规范氨基酸之间结构相似的替代品，例如Ser/Ala/Cys，Thr/Val，Glu/Gln，Asp/Asn，Tyr/Phe，这些氨基酸存在于标准遗传密码库中。另一方面，其他规范氨基酸（如Trp，Met，His或Pro）没有这种可能性，它们通常在蛋白质1中起着重要的结构和功能作用。在蛋白质的高度特异性内部结构及其折叠过程的背景下研究这些相互作用的理想方法是产生非破坏性的等位站修饰。事实上，当将这些规范氨基酸（也称为非规范氨基酸（ncAAs））的异位点氨基酸类似物插入蛋白质中时，它们即使在单个原子或原子基团（如H / F，CH2 / S / Se / Te）的水平上也允许微妙的变化，称为“原子突变”2。这种“分子手术”产生改变的蛋白质，其性质仅由单个原子或原子组的交换产生，在有利的情况下可以对其进行分析，并且可以合理化检测到的变化。通过这种方式，研究蛋白质折叠和结构的蛋白质合成范围远远超出了经典的DNA诱变。请注意，由定点诱变产生的蛋白质通常被称为“突变体”，而具有取代的规范氨基酸的蛋白质被称为“变体”3，“同种异体蛋白”4或“蛋白质同源物”5。
绿色荧光蛋白（GFP）首先在海洋生物 Aequorea victoria中鉴定，当暴露于紫外线至蓝光6，7时表现出明亮的绿色荧光。今天，GFP通常被用作一种高度灵敏的标记工具，用于通过荧光显微镜对细胞中的基因表达和蛋白质定位进行常规可视化。GFP还被证明在各种生物物理8，9，10 和生物医学11，12 研究中有用，以及蛋白质工程13，14，15。对GFP结构的严格分析能够创建许多变体，其特征在于不同的稳定性和荧光最大值16，17。用于细胞和分子生物学的大多数GFP变体都是溶液和晶体中的单体蛋白18。它们的主要结构组织是GFP家族所有成员的典型组织，独立于其系统发育起源，由11条β链组成，形成所谓的β，而扭结的α螺旋穿过桶的中心并带有发色团（图1A）。发色团的自催化成熟（图1B）需要将其周围的侧链精确定位在蛋白质的中心位置;这些侧链中的许多在其他GFP变体19中都是高度保守的。在大多数来自水母的荧光蛋白如 维多利亚蜈螈中，绿色发光的发色团由两个芳香环组成，包括Tyr66的酚环和咪唑啉酮的五元杂环结构（图1B）。当发色团正确嵌入蛋白质基质中时，负责整个蛋白质的特征荧光。它位于结构的中心，而桶状结构将其与水介质20隔离开来。发色团暴露于本体水中会导致荧光猝灭，即荧光损失21。
桶状结构的适当折叠对于保护发色团免受荧光猝灭至关重要22。脯氨酸（Pro）残基在GFP23的结构组织中起着特殊的作用。由于无法支持β链，它们构成了负责维持整个蛋白质结构的连接环。毫不奇怪，在 Aequorea和 Anthothecata衍生的GFP中都发现了10-15个脯氨酸残基;其中一些在其他类型的荧光β桶蛋白中高度保守。脯氨酸由于其独特的几何特征，预计将对折叠性能产生重大影响。例如，在 Aequorea衍生的GFP中，在十个脯氨酸残基中（图2A），九个形成 反式，只有一个形成 顺式肽键（Pro89）。Pro58是必不可少的，即不能与19种规范氨基酸中的其余氨基酸互换。该残基可能是Trp57残基的正确定位的原因，据报道，这对于发色团成熟和整体GFP折叠24至关重要。具有三个脯氨酸残基（Pro54，Pro56，Pro58）和Trp57的片段PVPWP是 图1A中GFP结构中“下盖”的重要组成部分。PVPWP结构基序存在于几种蛋白质中，例如细胞色素和真核电压激活的钾通道25。位于 75 和 89 位的脯氨酸-丙氨酸取代也不利于蛋白表达和折叠，并消除发色团成熟。Pro75和Pro89是掩埋发色团的“上盖”的一部分（图1A），并且在11链β筒荧光蛋白23中保守。这两个“盖子”保持发色团从水溶剂中排除，即使稳定的三级结构已被部分破坏26。这种特定的分子结构保护荧光团免受碰撞（动态）荧光猝灭，例如，通过水，氧或其他可扩散配体。
为了进行GFP结构的分子工程，应该在蛋白质的一级结构中引入氨基酸取代。在GFP上进行了许多突变，使变异具有更高的稳定性，快速可靠的折叠和可变的荧光特性17。尽管如此，在大多数情况下，脯氨酸残基的突变被认为是一种危险的方法，因为剩余的19个规范氨基酸中没有一个可以适当地恢复脯氨酸残基27的构象谱。因此，已经开发了一种替代方法，其中脯氨酸残基被其他基于脯氨酸的结构取代，称为脯氨酸类似物28。由于其独特的循环化学结构，脯氨酸表现出两个特征性的构象转变（图1C）：1）脯氨酸环起皱，这是一个需要组织骨架的快速过程，主要影响φ扭转角，以及2）肽键顺式/反式异构化，这是一个通过ω扭转角影响骨架折叠的缓慢过程。由于其缓慢的性质，后一种转变通常负责整个蛋白质折叠过程中的限速步骤。先前已经表明，围绕一些脯氨酸残基的肽键顺式/反式异构化在GFP变体的折叠中具有缓慢的步骤。例如，Pro89处顺式肽键的形成具有折叠过程中的缓慢步骤，因为它依赖于从反式到顺式29的键过渡。在用全反式肽环取代Pro89后，即通过消除顺式到反式异构化事件30，可以实现更快的重折叠。除了顺式/反式异构化之外，由于蛋白质内部27，31内的骨架组织和包装，褶皱转变也可能在蛋白质折叠中产生深刻的变化。
化学修饰导致脯氨酸残基的固有构象转变的改变，从而影响蛋白质折叠的能力。某些脯氨酸类似物是蛋白质中脯氨酸取代的特别有吸引力的候选者，因为它们允许操作和研究折叠特性。例如，（4R）-氟脯氨酸（R-Flp），（4S）-氟脯氨酸（S-Flp），4，4-二氟脯氨酸（Dfp）和3，4-脱氢脯氨酸（Dhp）是四个类似物（图1D），它们在分子体积和极性方面与脯氨酸差异最小32。同时，每个类似物都表现出明显的环褶皱：S-Flp稳定C 4-endo褶皱，R-Flp稳定C4-exo褶皱，Dfp没有表现出明显的褶皱偏好，而Dhp消除了褶皱（图1D）33。通过在蛋白质结构中使用这些类似物，可以操纵脯氨酸残基的构象转变，并因此影响所得GFP变体的性质。
在这项工作中，我们开始使用选择性压力掺入法（SPI，图3）将指定的脯氨酸类似物（图1D）整合到GFP变体的结构中34。用最接近的等结构类似物替换氨基酸残基是蛋白质设计35，36中的应用生物技术概念。因此，脯氨酸类似物在模型蛋白质中的作用说明了它们在蛋白质工程中作为工具的潜力37。含有所需类似物的蛋白质的产生是在不能产生脯氨酸（脯氨酸 - auxotrophy）的改良大肠杆菌菌株中进行的。因此，它们可以被迫接受蛋白质生物合成过程中底物38的替换。脯氨酸的这种全局取代是由内源性氨基酰基-tRNA合成酶39的天然底物灵活性实现的，该关键酶催化tRNA与适当氨基酸40的酯化。通常，如图3所示，细胞生长在定义的培养基中进行，直到达到对数生长阶段中期。在下一步中，待替换的氨基酸在发酵过程中从表达系统中细胞内耗尽，然后由所需的类似物或ncAA交换。然后诱导靶蛋白表达进行残基特异性非规范氨基酸掺入。同源氨基酸与其类似物的取代以蛋白质组范围的方式发生。虽然这种副作用可能对宿主菌株的生长产生负面影响，但目标蛋白生产的质量大多不受影响，因为在重组表达中，细胞资源主要针对靶蛋白41，42的产生。因此，严格调控、可诱导的表达系统和强大的启动子对于高掺入效率至关重要43。我们的方法基于ncAA的多个残基特异性掺入以响应感测密码子（感测密码子重新分配），从而在靶基因内，Pro类似物插入的位置数量可以通过定点诱变44进行操纵。在我们上一份关于制备具有抗菌特性的重组肽的报告中应用了类似的方法45。在这项工作中，我们应用了SPI方法，该方法允许所有脯氨酸残基被相关类似物取代，以产生预期具有独特物理化学性质的蛋白质，这些性质不存在于用规范氨基酸库合成的蛋白质中。通过表征所得变体的折叠和荧光谱，我们的目标是展示GFP变体中原子取代的影响。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

通过传统的定点诱变，用剩余的19个规范氨基酸中的任何一个取代蛋白质中的脯氨酸（Pro）残基通常不利于蛋白质折叠，特别是绿色荧光蛋白和相关变体中的发色团成熟。一个合理的替代方案是操纵蛋白质的翻译，以便所有Pro残基都被类似物取代残基 - 特别是类似物，这种方法称为选择性压力掺入（SPI）。内置的化学修饰可以用作一种“分子手术”，以精细地剖析可测量的变化，甚至合理地操纵不同的蛋白质性质。在这里，该研究证明了SPI方法在研究脯氨酸在绿色荧光蛋白（GFP）光谱变体的典型β-桶结构组织中的作用的有用性，其序列中含有10-15个脯氨酸：增强绿色荧光蛋白（EGFP），NowGFP和KillerOrange。Pro残留物存在于单个β线之间的连接部分，并构成桶形支架的封闭盖，因此负责发色团与水的绝缘，即荧光特性。以脯氨酸-自养大肠杆菌菌株为表达宿主，对（4R）-氟脯氨酸（R-Flp）、（4S）-氟脯氨酸（S-Flp）、4，4-二氟脯氨酸（Dfp）和3，4-脱氢脯氨酸（Dhp）进行选择性加压实验。我们发现具有S-Flp和Dhp的荧光蛋白是活性的（即荧光蛋白），而另外两个类似物（Dfp和R-Flp）产生功能失调的，错误折叠的蛋白质。对紫外-可见吸收和荧光发射曲线的检查显示，含有Pro类似物的蛋白质几乎没有特征改变。对EGFP变体中折叠动力学谱的检查显示，在存在S-Flp的情况下，重折叠过程加速，而该过程与含有Dhp的蛋白质中的野生型相似。这项研究展示了SPI方法在原子水平上产生蛋白质残基的细微修饰的能力（“分子手术”），这可以用于研究其他感兴趣的蛋白质。它说明了在β筒荧光蛋白类中具有紧密化学类似物的折叠和光谱特性的脯氨酸替代的结果。

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Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

为了克服经典定点诱变的局限性，将具有特定修饰的脯氨酸类似物掺入几种荧光蛋白中。我们展示了氟替代氢或脯氨酸残基中的单双键（“分子手术”）如何影响基本的蛋白质特性，包括它们的折叠和与光的相互作用。

荧光蛋白中脯氨酸类似物对脯氨酸的残基特异换：骨架的“分子手术”如何影响折叠和稳定性

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

在大多数情况下，传统的定点诱变不适合研究脯氨酸在蛋白质中的功能作用。在这里，我们提出了一种将脯氨酸类似物作为非规范氨基酸掺入核糖体合成蛋白质中的方法，以研究脯氨酸残基对蛋白质折叠和功能的作用。用标准氨基酸取代脯氨酸是一种危险的方法。掺入脯氨酸类似物允许一种分子手术。换句话说，它引入了微妙的分子变化，以合理地影响和操纵蛋白质特性。由于脯氨酸残基在蛋白质支架的稳定性中起着至关重要的作用，我们的技术可能有助于了解蛋白质折叠缺陷背后的原因，这是人类某些病理状态的基础。脯氨酸替代诱导的蛋白质改变对酶的生物技术工程具有重要意义，并为增强核糖体蛋白质翻译或折叠提供了机会。这种方法不需要特殊的设备和昂贵的仪器仪表。应特别注意方案步骤，其中在添加脯氨酸类似物之前从大肠杆菌培养物中耗尽天然脯氨酸。要开始用天然脯氨酸生产荧光蛋白，请在装有两毫升过夜培养物的两升锥形瓶中接种200毫升新鲜NMM培养基。将细胞在37摄氏度下以220 RPM的轨道振荡器孵育约3.5小时。在孵育过程中，每30分钟在分光光度计中测量600纳米的光密度。当光密度达到0.7时，旋转下细胞悬浮液并轻轻地将上清液倾析成废物。然后，通过重悬于50毫升不含任何氨基酸的冰冷NMM或不含脯氨酸的NMM来洗涤细胞。再次旋转细胞并将上清液倾析成废物。接下来，通过在200毫升不含脯氨酸的NMM中轻柔移液并在两升锥形瓶中补充氨苄青霉素来重悬细胞沉淀，并将细胞在眼眶振荡器中孵育30分钟，以允许脯氨酸完全耗尽。孵育后，从50毫摩尔储备溶液中加入适当体积的L-脯氨酸或脯氨酸类似物，以获得细胞悬浮液中的一毫摩尔终浓度。接下来，通过从单摩尔储备溶液中加入500微摩尔IPTG来诱导靶蛋白表达。在轨道振荡器中以37摄氏度表达目标蛋白质过夜，并在第二天测量光密度。通过离心收集细菌细胞，并将上清液倾析成废物。然后，通过在含有10%甘油的50毫升结合缓冲液中小心移液来洗涤细胞。再次旋转细胞，倾析上清液，并将细胞沉淀以零下20或80摄氏度储存在50毫升管中，直到进一步使用。在评估荧光发射之前，执行SDS-PAGE以确保样品纯度高于95%，然后将每个纯化的蛋白质变体的样品调整为0.3微摩尔的浓度，以适当波长处的计算吸光度值作为参考。确保近似的最终样品体积为200微升。让稀释的样品在室温下平衡。一小时后，将样品转移到一厘米的石英比色皿中，并使用荧光光谱仪测量样品的荧光发射光谱。为了诱导变性，通过将两微升300微摩尔样品加入18微升含有8.89摩尔尿素和5.56毫摩尔DTT的1.11X PBS缓冲液中，将每种蛋白质变体的样品稀释20倍。将样品在95摄氏度下孵育5分钟。然后，通过加入1， 980微升含有5毫摩尔DTT的PBS来稀释样品100倍以诱导再饱和，并立即将200微升样品转移到一厘米石英比色皿中。将石英比色皿插入适当的荧光光谱仪，并通过在30分钟内每三秒获取一次荧光光谱来监测蛋白质重折叠。将重新折叠的样品转移到1.5毫升微量离心管中，然后关闭盖子并将样品在室温下储存在黑暗中，以允许EGFP变体的完全重新折叠。24小时后，使用与以前相同的激发波长测量重折叠蛋白质样品的荧光发射，以捕获荧光恢复的时间终点。来自表达天然蛋白的细胞的沉淀以及含有S-氟脯氨酸和脱氢脯氨酸的变体由于发色团完整，具有典型的鲜艳颜色。相比之下，含有R-氟脯氨酸和二氟脯氨酸的变体保持无色，表明未折叠的蛋白质在包涵体中错误折叠和沉积。SDS-PAGE分析验证了含R-氟脯氨酸的不溶性蛋白质的存在。相比之下，在可溶性馏分中发现了天然蛋白和S-氟脯氨酸和含有脱氢脯氨酸的变体。在液相色谱/质谱分析中，每个用S-氟脯氨酸替代脯氨酸产生每个脯氨酸的正18道尔顿位移，而用脱氢脯氨酸替代产生每个残留物两个道尔顿的负位移。在光吸收和发射光谱中，EGFP的发色团吸光度为488纳米，NowGFP的发色团吸光度为493纳米。在KillerOrange中，发色团吸光度区域由两个条带组成，对应于复合发色团的两种可能的构型和电荷状态。此外，在相应的最大吸光度波长下激发时记录的荧光光谱意味着类似物不会改变发色团的化学环境。在重折叠实验中，天然EGFP发色团荧光部分恢复，尽管色氨酸特异性荧光在复性后更大。对于含有脱氢脯氨酸的变体，观察到类似的行为。在含有EGFP的S-氟脯氨酸中，用295纳米的激发观察到类似的结果，而荧光在488纳米处恢复到更高的程度。只有EGFP变体显示出快速的重折叠动力学，色氨酸发射回收率是发色团发射的两倍。必须使用具有合适生长培养基的新鲜细菌培养物。无菌技术和定期监测培养生长也是实验成功的重要先决条件。这种方法适用于蛋白质工程，因为它可以研究其他规范氨基酸的作用。为此，需要合适的自养性大肠杆菌菌株和氨基酸类似物。需要全蛋白的质谱作为分析证据来确认非规范氨基酸类似物的掺入。掺入脯氨酸类似物的SPI方法使我们能够直接操纵蛋白质主链，并通过全局稳定和改善核糖体翻译或折叠，为合理设计和促进蛋白质生产提供了优势。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

荧光光谱法测定膜蛋白质折叠的热力学

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

科研

生物工程

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

在生物系统中的离子浓度测量荧光纳米粒子

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

无试剂检测核酸，蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

负染色的EM可视化蛋白质和大分子复合物：从电网的制备图像采集

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

研究蛋白质折叠的微流体混合器

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

全球舒张功能通过静脉流的通过参数化舒张形式主义运动学建模为基础的定量分析

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

交货蛋白质，多肽或细胞不可渗透的小分子进入活细胞被孵化与核内体溶解试剂dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

并列的合并离子交换膜之间的离子浓差极化，以块极化区的传播

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

一个<em&gt;体外</em鼠类的椎间盘&gt;器官培养模型

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioink Precellularization 无源混合装置打印软骨及皮肤组织类似物的应用

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...