Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Dette arbejde blev støttet af den tyske forskningsfond (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) til T.F. og NB og af forbundsministeriet for uddannelse og videnskab (BMBF-programmet "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) til F.-J.S. og T.M.T.T.

Forfatterne afslører alle og eventuelle interessekonflikter.

I naturen forekommer manipulationer med proteinstrukturer og funktioner typisk på grund af mutationer, fænomenet, der fører til udveksling af en aminosyreidentitet på bestemte positioner i proteinsekvensen. Denne naturlige mekanisme anvendes i vid udstrækning som en bioteknologisk metode til proteinteknik i form af mutagenese, og den er afhængig af repertoiret af de 20 kanoniske aminosyrer, der er involveret i processen. Udvekslingen af prolinrester er imidlertid problematisk. På grund af sin specielle rygradsgruppearkitektur er den næppe udskiftelig med de resterende 19 rester til erstatning72. For eksempel er prolin typisk kendt som en sekundær strukturbryder i polypeptidsekvenser på grund af dets dårlige kompatibilitet med de mest almindelige sekundære strukturer, dvs. α-helix og β-streng. Denne prolinfunktion går let tabt, når resten muteres til en anden aminosyre fra det fælles repertoire. Udskiftningen af prolin med dets kemiske analoger tilbyder en alternativ tilgang, som gør det muligt at bevare de grundlæggende rygradsegenskaber i moderprolinresten, samtidig med at der pålægges bias på dets specifikke konformationsovergange eller producerer moduleringer af molekylært volumen og polaritet. For eksempel er det muligt at forsyne bakteriekulturer med analoge strukturer såsom hydroxy-, fluor-, alkyl-, dehydroproliner, strukturer med variable ringstørrelser og mere, hvilket letter produktionen af et protein, der indeholder specifikke prolinresterændringer.
Den selektive trykinkorporeringsmetode (SPI), der er beskrevet i denne undersøgelse, muliggør en global, dvs. restspecifik udskiftning af alle proliner i målproteinet med relaterede kemiske analoger. Betydningen af metoden afspejles af, at SPI gør det muligt at skabe sekvensændringer, der er utilgængelige for almindelige mutageneseteknikker. For eksempel tillader det produktion af et målprotein, der indeholder ret små strukturelle ændringer, der typisk ikke kan overstige en eller to atomudskiftninger /deletioner/tilføjelser, som det fremgår af denne undersøgelse. Sådanne proteinmodifikationer kaldes "atommutationer"73,74. I et fluorescerende protein som GFP kan resultatet af denne molekylære indtrængen ses i foldningshastigheden, lokale polariteter, proteinpakning, stabilitet af de involverede strukturelle træk. Ændringerne i absorbans- og fluorescensegenskaberne produceres indirekte på grund af virkningen på proteinfoldning og restmikromiljøer. Præcisionen af de molekylære ændringer, der udføres af SPI, er typisk meget højere sammenlignet med mutationer af proliner til andre kanoniske rester, hvor sidstnævnte typisk er skadelig for proteinfoldning, produktion og isolering.
Som produktionsmetode bruger SPI-tilgangen substrattolerancen for aminoacyl-tRNA-syntetaselommen over for kemiske analoger af den oprindelige aminosyre. Syntetase er ansvarlig for den korrekte identifikation af aminosyrestrukturen, mens inkorporeringen i proteiner sker nedstrøms i oversættelsesprocessen. Instrumentelt udføres proteinproduktion, isolering og oprensning i SPI på en måde, der er typisk for andre rekombinante proteinekspressionsteknikker; dog med nogle tilføjelser til protokollen som følger: Prolin, som er på vej til udskiftning, tilvejebringes i begyndelsen af fermenteringsprocessen, således at cellerne kan vokse og udvikle deres intakte cellulære maskineri. Cellekulturen får imidlertid ikke lov til at nå den maksimale optiske densitet for at holde cellerne i den logaritmiske fase optimal til proteinekspression. Der er to store variationer af SPI-metoden på dette tidspunkt. I den første justeres koncentrationen af prolin i det oprindelige vækstmedium (et kemisk defineret medium), således at udtømning af prolin sker uden nogen ekstern indtrængen. Cellerne udtømmer prolin i mediet, før de kan forlade den logaritmiske vækstfase, og derefter tilsættes analogen efterfølgende, og proteinet af interesseproduktion induceres. I den anden version af metoden dyrkes cellerne i det medium, der indeholder prolin indtil midten af deres logaritmiske fase. På dette tidspunkt skal cellerne tages ud og fysisk overføres til et andet medium, som ikke længere indeholder prolin, kun analogen, med efterfølgende induktion af proteinet af interesse. I begge versioner tilvejebringes det analoge og proteininduktionsreagenset til de forvoksede celler. Isoleringen og oprensningen af vildtypeproteinet udføres på samme måde som for varianterne. I princippet kan enhver tilgængelig Pro-auxotrofisk stamme bruges som udtryksvært. Ikke desto mindre anbefales ekspressionstest for at identificere den mest egnede vært. Test af forskellige kemisk definerede medier kan også bruges til at optimere proteinudbyttet.
Der er visse krav til de kemiske analoger, der skal overvejes for SPI, såsom opløselighed og koncentration. Den metaboliske tilgængelighed og optagelse af aminosyrer er afhængig af antallet af opløste molekyler i mediet. For at øge opløseligheden af en bestemt forbindelse kan der vælges let sure eller alkaliske forhold. Da de kunstige molekyler kan forårsage væksthæmmende virkninger på grund af deres celletoksicitet, bør koncentrationen sænkes til et minimum for at undgå cellestress75.
En mindre svaghed ved SPI er faldet i inkorporeringseffektiviteten med et større antal positioner, der skal udveksles. I princippet kan en reduktion af aminosyrefrekvensen i målbiomolekylet ved stedstyret mutagenese løse dette problem. Imidlertid kan de strukturelle og funktionelle egenskaber ved et ønsket protein påvirkes ved at ændre den primære struktur.
Som tidligere nævnt tillader SPI restspecifik udskiftning af den kanoniske aminosyre. Dette indebærer, at ikke-kanoniske aminosyrer indsættes i alle positioner af den kanoniske aminosyre i målproteinet, herunder konserverede rester, der er uundværlige for proteinfunktion eller foldning. Alternative metoder til stedsspecifik inkorporering er den eneste mulighed for at løse dette problem3. I de sidste par årtier er den ortogonale parmetode blevet udviklet, der kan producere proteiner indeholdende modificerede rester på foruddefinerede steder. Den mest almindelige ændring af denne metode er kendt som stopkodonundertrykkelse. Denne metode er baseret på et konstrueret ortogonalt oversættelsessystem dedikeret til stedsspecifik inkorporering af syntetiske aminosyrer76. Mere end 200 aminosyrer med forskellige sidekædemodifikationer er blevet inkorporeret i proteiner til dato ved hjælp af denne tilgang77. Disse oversættelsessystemer er dog stadig ikke egnede til indsættelser af prolinanaloger i målproteiner. Desuden betragtes metodens ydeevne som lav i tilfælde af mindre aminosyremodifikationer, fordi en vis baggrundspromiskuitet af aminoacyl-tRNA-syntetase typisk forbliver i de konstruerede oversættelsessystemer.
Ved hjælp af SPI producerede vi en række β-tønde fluorescerende proteinvarianter og studerede resultaterne af udvekslingen af prolin med dets unaturlige analoger. I tilfælde af prolinudskiftning med R-Flp og Dfp blev der produceret et dysfunktionelt protein af ekspressionsværten. Effekten er sandsynligvis produceret af protein misfoldning. Sidstnævnte kan stamme fra C4-exo-konformationen fremmet af R-Flp, som ikke er ugunstigt stillet af moderproteinstrukturerne27. Med Dfp vil fejlfoldningen sandsynligvis blive produceret af den formindskede hastighed af trans-til-cis-peptidbindingsisomeriseringen ved prolinresten27. Sidstnævnte er kendt for at være blandt de begrænsende trin i den kinetiske profil af proteinfoldningen, der påvirker β-tønde dannelse og efterfølgende kromoformodning. For begge aminosyrer, R-Flp og Dfp, resulterede proteinproduktionen faktisk i et aggregeret og uopløseligt protein. Følgelig kunne kromofordannelse ikke forekomme, og fluorescensen gik helt tabt. Med S-Flp og Dhp blev der imidlertid observeret korrekt proteinmodning, hvilket resulterede i fluorescerende proteinprøver for hver analog / proteinkombination. På trods af nogle moduleringer i proteinets absorbans- og fluorescensegenskaber forblev disse stort set de samme som for vildtypeproteinerne. Effekten af aminosyresubstitutionen blev afsløret i de omfoldede kinetikundersøgelser. Sidstnævnte viste en hurtigere omfoldning i tilfælde af udskiftning med S-Flp. Modelundersøgelser har vist, at denne rest kan generere en vis forbedring i trans-til-cis-amidrotationshastigheden og føre til dannelsen af C4-endo-konformationen. Begge disse faktorer vil sandsynligvis bidrage til de gavnlige kinetiske virkninger af denne rest i EGFP. I modsætning hertil producerede Dhp kinetiske foldeprofiler, der maksimalt ligner moderproteinet. Mangfoldigheden af de resultater, der frembringes af blotte atommutationer i de undersøgte fluorescerende proteiner, illustrerer SPI-produktionsmetodens potentiale til at ændre målproteinets egenskaber. Proteinændringerne induceret ved prolinudskiftning med analogerne har yderligere konsekvenser i konstruktionen af enzymer 78,79,80 og ionkanaler 81,82 samt i generel teknik af proteinstabilitet.
Den grundlæggende begrænsning af SPI-metoden er dens "alt-eller-ingen" -tilstand ved udveksling af prolin, der befinder sig med relaterede analoger. Det ville være en stor fordel at kunne vælge præcist, hvilke prolinrester der skal erstattes med analogerne, og hvilke der skal forblive uændrede. På nuværende tidspunkt er der imidlertid ingen teknik, der kan udføre en så sofistikeret produktion ved hjælp af en mikrobiel produktionsvært. Kemisk syntese af proteiner83,84 samt cellefri produktion85,86 er de to alternative metoder, der kan producere positionsspecifikke prolinmodifikationer. Ikke desto mindre gør deres operationelle kompleksitet og lave produktionsudbytter dem ringere sammenlignet med produktionen i levende celler. Fra nu af er SPI fortsat den mest operationelt enkle og robuste tilgang til produktion af komplekse proteiner, der bærer atommutationer. Ved at indføre unaturlige aminosyreerstatninger gør metoden det muligt at modificere proteinegenskaber på en målrettet måde, som her eksemplificeret ved ændringer i foldning og lysabsorption/emission af fluorescerende proteiner genereret af prolinudskiftninger.

Klassisk stedstyret mutagenese tillader permutation af enhver eksisterende genkodet proteinsekvens ved kodonmanipulation på DNA-niveau. For at studere proteinfoldning og stabilitet er det ofte ønskeligt at erstatte lignende aminosyrer med lignende modstykker. Imidlertid er traditionel proteinmutagenese bestemt begrænset til strukturelt lignende udskiftninger blandt kanoniske aminosyrer som Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, som er til stede i standard genetisk kode repertoire. På den anden side er der ingen sådanne muligheder for andre kanoniske aminosyrer som Trp, Met, His eller Pro, som ofte spiller væsentlige strukturelle og funktionelle roller i proteiner1. En ideel tilgang til at studere disse interaktioner i forbindelse med den meget specifikke interne arkitektur af proteiner og deres foldeproces er at generere ikke-forstyrrende isosteriske modifikationer. Når isosteriske aminosyreanaloger af disse kanoniske aminosyrer, også kendt som ikke-kanoniske aminosyrer (ncAA'er), indsættes i proteiner, tillader de subtile ændringer selv på niveau med enkeltatomer eller atomgrupper såsom H / F, CH2 / S / Se / Te kendt som "atommutationer"2. En sådan "molekylær kirurgi" producerer ændrede proteiner, hvis egenskaber udelukkende skyldes udveksling af enkeltatomer eller grupper af atomer, som i gunstige tilfælde kan analyseres, og de detekterede ændringer kan rationaliseres. På denne måde udvides omfanget af proteinsyntese til undersøgelse af proteinfoldning og struktur langt ud over klassisk DNA-mutagenese. Bemærk, at proteiner genereret af stedstyret mutagenese normalt betegnes som "mutanter", mens proteiner med substituerede kanoniske aminosyrer betegnes som "varianter" 3, "alloproteiner"4 eller "proteinkongenere"5.
Det grønne fluorescerende protein (GFP), der først blev identificeret i den marine organisme Aequorea victoria, udviser lysegrøn fluorescens, når den udsættes for ultraviolet-til-blåt lys 6,7. I dag bruges GFP almindeligvis som et meget følsomt mærkningsværktøj til rutinemæssig visualisering af genekspression og proteinlokalisering i celler via fluorescerende mikroskopi. GFP har også vist sig nyttig i forskellige biofysiske 8,9,10 og biomedicinske 11,12 undersøgelser samt i proteinteknik 13,14,15. Streng analyse af GFP-strukturen muliggjorde oprettelsen af adskillige varianter præget af varieret stabilitet og fluorescensmaksemaksima 16,17. De fleste af de GFP-varianter, der anvendes i celle- og molekylærbiologi, er monomere proteiner både i opløsning og i krystal18. Deres vigtigste strukturelle organisation er typisk for alle medlemmer af GFP-familien, uafhængig af deres fylogenetiske oprindelse, og består af 11 β-strenge, der danner en såkaldt β-tønde, mens en knækket α-helix løber gennem midten af tønden og bærer kromoforen (figur 1A). Den autokatalytiske modning af kromoforen (figur 1B) kræver præcis placering af sidekæderne omkring den på proteinets centrale sted; mange af disse sidekæder er stærkt bevaret i andre GFP-varianter19. I de fleste fluorescerende proteiner fra vandmænd som Aequorea victoria består den grønnemitterende kromofor af to aromatiske ringe, herunder en phenolring af Tyr66 og den femleddede heterocykliske struktur af imidazolinon (figur 1B). Kromoforen, når den er korrekt indlejret i proteinmatrixen, er ansvarlig for den karakteristiske fluorescens af hele proteinet. Den er placeret i midten af strukturen, mens tøndestrukturen isolerer den fra det vandige medium20. Eksponering af kromoforen for bulkvandet ville resultere i fluorescensslukning, dvs. tab af fluorescens21.
Den korrekte foldning af den tøndelignende struktur er afgørende for at beskytte kromoforen mod fluorescensslukning22. Prolin (Pro) rester spiller en særlig rolle i den strukturelle organisation af GFP23. Da de ikke er i stand til at understøtte en β-streng, udgør de forbindelsessløjfer, der er ansvarlige for at opretholde proteinstrukturen som helhed. Ikke overraskende findes 10-15 prolinrester i både Aequorea- og Anthoathecata-afledte GSP'er; nogle af dem er stærkt bevaret i andre typer fluorescerende β-tønde proteiner. Proliner forventes kritisk at påvirke foldeegenskaber på grund af deres ejendommelige geometriske egenskaber. For eksempel danner ni i Aequorea-afledte GMP'er af de ti prolinrester (figur 2A) trans- og kun en danner en cis-peptidbinding (Pro89). Pro58 er essentiel, dvs. ikke udskiftelig med resten af de 19 kanoniske aminosyrer. Denne rest kan være ansvarlig for den korrekte placering af Trp57-restproduktet, som er rapporteret at være afgørende for kromoformodning og den samlede GFP-foldning24. Fragmentet PVPWP med tre prolinrester (Pro54, Pro56, Pro58) og Trp57 er den væsentlige del af det "nedre låg" i GFP-strukturen fra figur 1A. PVPWP-strukturmotivet findes i flere proteiner såsom cytokromer og eukaryote spændingsaktiverede kaliumkanaler25. Prolin-til-alanin-substitutioner i positionerne 75 og 89 er også skadelige for proteinekspression og foldning og afskaffelse af kromoformodning. Pro75 og Pro89 er en del af det "øvre låg", der begraver kromoforen (figur 1A) og bevares på tværs af 11-strengede fluorescerende proteiner β tønde23. Disse to "låg" holder kromoforen udelukket fra det vandige opløsningsmiddel, selv når den stabile tertiære struktur er delvist brudt26. En sådan specifik molekylær arkitektur beskytter fluoroforen mod kollisionel (dynamisk) fluorescensslukning, f.eks. ved vand, ilt eller andre diffusible ligander.
For at udføre molekylær teknik af GFP-strukturen bør man indføre aminosyresubstitutioner i proteinets primære struktur. Talrige mutationer er blevet udført på GFP, hvilket giver varianter med forhøjet stabilitet, hurtig og pålidelig foldning og variable fluorescensegenskaber17. Ikke desto mindre betragtes mutation af prolinrester i de fleste tilfælde som en risikabel tilgang på grund af det faktum, at ingen af de resterende 19 kanoniske aminosyrer korrekt kan genoprette prolinrestens konformationsprofil27. Således er der udviklet en alternativ tilgang, hvor prolinrester erstattes med andre prolinbaserede strukturer, kaldet prolinanaloger28. På grund af sin unikke cykliske kemiske struktur udviser prolin to karakteristiske konformationsovergange (figur 1C): 1) prolinringen puckering, en hurtig proces, der indebærer organisering af rygraden, som primært påvirker φ torsionsvinkel, og 2) peptidbinding cis / trans isomerisering, en langsom proces, der påvirker rygradsfoldning via ω torsionsvinklerne. På grund af sin langsomme natur er sidstnævnte overgang almindeligvis ansvarlig for de hastighedsbegrænsende trin i foldeprocessen af hele proteinet. Det har tidligere vist sig, at peptidbinding cis / trans-isomerisering omkring nogle prolinrester har langsomme trin i foldningen af GFP-varianter. For eksempel har dannelsen af cis-peptidbindingen ved Pro89 det langsomme trin i foldningsprocessen, fordi den er afhængig af bindingsovergangen fra trans til cis29. En hurtigere omfoldning kan opnås efter udskiftning af Pro89 med en all-trans peptid loop, dvs. ved at afskaffe en cis-to-trans isomeriseringshændelse 30. Ud over cis / trans-isomeriseringen kan puckerovergangene også generere dybtgående ændringer i proteinfoldning på grund af rygradsorganisationen og pakningen inden for proteininteriøret27,31.
Kemiske modifikationer resulterer i ændring af prolinresternes iboende konformationsovergange og påvirker derved proteinets evne til at folde. Visse prolineanaloger er særligt attraktive kandidater til prolinsubstitution i proteiner, da de tillader manipulation og undersøgelse af foldeegenskaberne. For eksempel er (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluorprolin (S-Flp), 4,4-difluoroprolin (Dfp) og 3,4-dehydroprolin (Dhp) fire analoger (figur 1D), der adskiller sig minimalt fra prolin med hensyn til både molekylært volumen og polaritet32. Samtidig udviser hver analog en særskilt ringpuckering: S-Flp stabiliserer C 4-endo puckeren, R-Flp stabiliserer C 4-exo puckeren, Dfp udviser ingen tilsyneladende pucker præference, mens Dhp afskaffer puckering (figur 1D) 33. Ved at anvende disse analoger i proteinstrukturen kan man manipulere med den konformationelle overgang af prolinresterne og dermed påvirke egenskaberne af de resulterende GFP-varianter.
I dette arbejde satte vi os for at indarbejde det udpegede sæt prolineanaloger (figur 1D) i strukturen af GFP-varianter ved hjælp af den selektive trykinkorporeringsmetode (SPI, figur 3)34. Udskiftning af aminosyrerester med deres nærmeste isostrukturelle analoger er et anvendt bioteknologisk koncept i proteindesign35,36. Således illustrerer virkningerne af prolinanaloger i et modelprotein deres potentiale til at tjene som værktøjer inden for proteinteknik37. Produktionen af proteiner indeholdende ønskede analoger blev udført i modificerede E. coli-stammer, der ikke er i stand til at producere prolin (prolin-auxotrofi). Således kunne de blive tvunget til at acceptere udskiftning af substrater i processen med proteinbiosyntese38. Denne globale substitution af prolin er muliggjort af den naturlige substratfleksibilitet af endogene aminoacyl-tRNA-syntetaser39, de vigtigste enzymer, der katalyserer esterificeringen af tRNA'er med passende aminosyrer40. Generelt, som skitseret i figur 3, udføres cellulær vækst i et defineret medium, indtil den midterste logaritmiske vækstfase er nået. I det næste trin udtømmes aminosyren, der skal udskiftes, intracellulært fra ekspressionssystemet under fermentering og udveksles efterfølgende med den ønskede analog eller ncAA. Målproteinekspression induceres derefter til restspecifik ikke-kanonisk aminosyreinkorporering. Substitutionen af den kognataminosyre med dens analog forekommer på en proteom-bred måde. Selv om denne bivirkning kan have en negativ indvirkning på væksten af værtsstammen, påvirkes kvaliteten af målproteinproduktionen for det meste ikke, da de cellulære ressourcer i rekombinant ekspression hovedsageligt er rettet mod produktionen af målproteinet 41,42. Derfor er et stramt reguleret, inducerbart udtrykssystem og stærke promotorer afgørende for høj inkorporeringseffektivitet43. Vores tilgang er baseret på flere restspecifikke inkorporelser af ncA'er som reaktion på sansekodoner (sense codon-omfordeling), hvorved antallet af positioner til Pro-analog indsættelse inden for målgenet kan manipuleres via stedstyret mutagenese44. En lignende tilgang blev anvendt i vores tidligere rapport om fremstilling af rekombinante peptider med antimikrobielle egenskaber45. I dette arbejde har vi anvendt SPI-metoden, som gør det muligt at erstatte alle prolinrester med beslægtede analoger for at generere proteiner, der forventes at have forskellige fysisk-kemiske egenskaber, der ikke er til stede i proteiner syntetiseret med det kanoniske aminosyrerepertoire. Ved at karakterisere folde- og fluorescensprofilen for resulterende varianter sigter vi mod at fremvise virkningerne af atomsubstitutioner i varianter af GFP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

Udskiftning af prolinrester (Pro) i proteiner med den traditionelle stedstyrede mutagenese med en af de resterende 19 kanoniske aminosyrer er ofte skadelig for proteinfoldning og især kromoformodning i grønne fluorescerende proteiner og beslægtede varianter. Et rimeligt alternativ er at manipulere oversættelsen af proteinet, så alle Pro-rester erstattes af rester - specifikt af analoger, en metode kendt som selektiv trykinkorporering (SPI). De indbyggede kemiske modifikationer kan bruges som en slags "molekylær kirurgi" til fint at dissekere målbare ændringer eller endda rationelt manipulere forskellige proteinegenskaber. Her viser undersøgelsen nytten af SPI-metoden til at studere prolinernes rolle i organisationen af den typiske β-tønde struktur af spektrale varianter af det grønne fluorescerende protein (GFP) med 10-15 proliner i deres rækkefølge: forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), NowGFP og KillerOrange. Pro-rester er til stede i forbindelsessektioner mellem individuelle β-strenge og udgør tøndestilladsets lukkelåg og er således ansvarlige for isolering af kromoforen fra vand, dvs. fluorescensegenskaber. Selektive trykinkorporeringsforsøg med (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluorprolin (S-Flp), 4,4-difluorprolin (Dfp) og 3,4-dehydroprolin (Dhp) blev udført under anvendelse af en prolin-auxotrofisk E. coli-stamme som ekspressionsvært. Vi fandt ud af, at fluorescerende proteiner med S-Flp og Dhp er aktive (dvs. fluorescerende), mens de to andre analoger (Dfp og R-Flp) producerede dysfunktionelle, misfoldede proteiner. Inspektion af UV-Vis absorptions- og fluorescensemissionsprofiler viste få karakteristiske ændringer i proteinerne indeholdende Pro-analoger. Undersøgelse af de foldbare kinetiske profiler i EGFP-varianter viste en accelereret omfoldningsproces i nærvær af S-Flp, mens processen lignede vildtype i proteinet indeholdende Dhp. Denne undersøgelse viser SPI-metodens evne til at producere subtile modifikationer af proteinrester på atomart niveau ("molekylær kirurgi"), som kan vedtages til undersøgelse af andre proteiner af interesse. Det illustrerer resultaterne af prolinudskiftninger med tætte kemiske analoger på folde- og spektroskopiske egenskaber i klassen af fluorescerende proteiner med β tønde.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

For at overvinde begrænsningerne ved klassisk stedstyret mutagenese blev prolinanaloger med specifikke modifikationer inkorporeret i flere fluorescerende proteiner. Vi viser, hvordan udskiftningen af hydrogen med fluor eller af singlen med dobbeltbindinger i prolinrester ("molekylær kirurgi") påvirker grundlæggende proteinegenskaber, herunder deres foldning og interaktion med lys.

Restspecifik udveksling af prolin ved hjælp af prolinanaloger i fluorescerende proteiner: Hvordan "molekylær kirurgi" af rygraden påvirker foldning og stabilitet

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

I de fleste tilfælde er konventionel stedstyret mutagenese ikke egnet til at studere prolinernes funktionelle rolle i proteiner. Her præsenterer vi en metode til at inkorporere prolinanaloger som ikke-kanoniske aminosyrer i ribosomatisk syntetiserede proteiner for at undersøge prolinresternes rolle på proteinfoldning og funktion. Substitutionen af proliner med standard aminosyrer er en risikabel tilgang.Inkorporering af prolinanaloger tillader en slags molekylær kirurgi. Med andre ord introducerer det subtile molekylære ændringer for rationelt at påvirke og manipulere proteinegenskaber. Da prolinrester spiller en væsentlig rolle i stabiliteten af proteinstilladser, kan vores teknologi være nyttig til at forstå årsagerne til proteinfoldningsunderskud, som ligger til grund for visse patologiske tilstande hos mennesker.De proteinændringer, der induceres af prolinudskiftninger, har konsekvenser for den bioteknologiske teknik af enzymer og giver mulighed for forbedring af ribosomal proteinoversættelse eller foldning. Denne metode kræver ikke specielt udstyr og dyr instrumentering. Der skal tages særlig omhu med protokoltrin, hvor indfødt prolin er udtømt fra E.coli-kulturer inden tilsætning af prolinanaloger.For at starte produktionen af de fluorescerende proteiner med indfødt prolin inokuleres 200 ml frisk NMM-medium i en to-liters Erlenmeyer-kolbe med to milliliter af overnatningskulturen. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i en orbital ryster ved 220 RPM i ca. 3,5 timer. Under inkubationen måles den optiske densitet ved 600 nanometer i et spektrofotometer hvert 30. minut.Når den optiske densitet når 0,7, skal du dreje ned ad cellesuspensionen og forsigtigt dekantere supernatanten til affald. Vask derefter cellerne ved at genbruge i 50 ml iskold NMM uden aminosyrer eller NMM uden prolin. Spin cellerne igen og dekanter supernatanten i affald.Derefter suspenderes cellepillen igen ved blid pipettering i 200 ml NMM uden prolin og suppleres med ampicillin i en to-liters Erlenmeyer-kolbe, og inkuber cellerne i en orbital ryster i 30 minutter for at muliggøre fuldstændig udtømning af prolin. Efter inkubation tilsættes et passende volumen af enten L-prolin eller prolinanalogerne fra de 50 millimolære stamopløsninger for at opnå en en millimolær slutkoncentration i cellesuspensionen. Dernæst induceres målproteinekspression ved at tilsætte 500-mikromolær IPTG fra en en-molær stamopløsning.Målproteinet udtrykkes natten over ved 37 grader Celsius i en orbital shaker og måler den optiske densitet den næste dag. Saml bakteriecellerne ved centrifugering og dekanter supernatanten i affald. Vask derefter cellerne ved omhyggelig pipettering i 50 ml bindende buffer indeholdende 10% glycerol.Spin cellerne igen, dekanter supernatanten, og opbevar cellepillen i et 50 ml rør ved minus 20 eller 80 grader Celsius indtil videre brug. Før du evaluerer fluorescensemission, skal du udføre en SDS-PAGE for at sikre, at prøverenhed er over 95%Derefter justeres prøverne af hver oprenset proteinvariant til en koncentration på 0,3 mikromol, idet den beregnede absorbansværdi ved den relevante bølgelængde justeres som reference. Sørg for, at det omtrentlige endelige prøvevolumen er 200 mikroliter.Lad de fortyndede prøver udligne ved stuetemperatur. Efter en time overføres prøverne til en kvartskuvette på en centimeter og måles fluorescensemissionsspektret for prøverne ved hjælp af et fluorescensspektrometer. For at fremkalde denaturering fortyndes prøverne af hver proteinvariant tyve gange ved at tilsætte de to mikroliter af 300 mikromolære prøver til 18 mikroliter 1,11X PBS-buffer indeholdende 8,89-molært urinstof og 5,56 millimolær DTT.Inkuber prøverne ved 95 grader Celsius i fem minutter. Fortynd derefter prøverne 100 gange ved at tilsætte 1.980 mikroliter PBS indeholdende fem millimolær DTT for at fremkalde renaturering og straks overføre 200 mikroliter af prøverne til en kvartskuvette på en centimeter. Indsæt kvartskuvetten i et passende fluorescensspektrometer, og overvåg proteinfoldningen ved at erhverve et fluorescensspektrum hvert tredje sekund over 30 minutter.Overfør omfoldningsprøverne til 1,5 ml mikrocentrifugerør, luk derefter låget, og opbevar prøverne ved stuetemperatur i mørke for at muliggøre fuldstændig omfoldning af EGFP-varianter. Efter 24 timer måles fluorescensemissionen af de omfoldede proteinprøver ved hjælp af den samme excitationsbølgelængde som før for at fange det tidsmæssige endepunkt for fluorescensgenvinding. Pellets fra celler, der udtrykker indfødt protein og varianter, der bærer S-fluorprolin og dehydroprolin, havde en typisk lys farve på grund af den intakte kromofor.I modsætning hertil forblev varianter indeholdende R-fluorprolin og difluorprolin farveløse, hvilket indikerer fejlfoldning og aflejring af udfoldet protein i inklusionslegemer. SDS-PAGE-analyse bekræftede tilstedeværelsen af uopløselige R-fluorprolinholdige proteiner. I modsætning hertil blev indfødte proteiner og S-fluorprolin og dehydroprolinbærende varianter fundet i de opløselige fraktioner.I væskekromatografi/massespektrometrianalyse producerede hver prolinudskiftning med S-fluorprolin et positivt skift på 18 dalton pr. prolinrest, mens udskiftning med dehydroprolin frembragte en negativ forskydning på to dalton pr. rest. I lysabsorptions- og emissionsspektre blev kromoforabsorbance fundet ved 488 nanometer for EGFP og 493 nanometer for NowGFP. I KillerOrange bestod kromoforabsorbanceområdet af to bånd svarende til to mulige konfigurations- og ladningstilstande for den komplekse kromofor.Endvidere indebar fluorescensspektre registreret ved excitation ved de tilsvarende maksimale absorbansbølgelængder, at analogerne ikke ændrede kromoforernes kemiske miljø. Ved omfoldningsforsøg genvandt den oprindelige EGFP-kromoforfluorfluorescens delvist, selvom den tryptofanspecifikke fluorescens var større efter renaturering. Lignende adfærd blev observeret for varianten indeholdende dehydroprolin.I EGFP-holdige S-fluorprolin blev et lignende resultat observeret med en 295-nanometer excitation, mens fluorescens genvandt i meget højere grad ved 488 nanometer. Kun EGFP-varianterne viste hurtig omfoldningskinetik, hvor tryptofanemissionsgenvinding var dobbelt så hurtig sammenlignet med kromoforemissionen. Friske bakteriekulturer med egnede vækstmedier skal anvendes.Sterile teknikker og regelmæssig overvågning af kulturvækst er også vigtige forudsætninger for eksperimentets succes. Denne metode gælder for proteinteknik, da den gør det muligt at studere rollen som andre kanoniske aminosyrer. Til dette er der brug for egnede auxotrofiske E.coli-stammer og aminosyreanaloger.Massespektrometri af hele proteiner er påkrævet som analytisk bevis for at bekræfte inkorporeringen af ikke-kanoniske aminosyreanaloger. SPI-metoden til inkorporering af prolinanaloger giver os mulighed for at manipulere proteinrygraden direkte og giver fordele for rationelt design og lettet produktion af proteiner gennem global stabilisering og forbedring af ribosomal oversættelse eller foldning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisere Proteiner og makromolekylære Komplekser af negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Mikrofluidenheder Blandere til at studere proteinfoldning

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantificering af Global diastolisk funktion ved Kinematisk Modeling-baseret analyse af Transmitral Flow via parametriserede diastolisk Filling Formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Levering af proteiner, peptider eller celleimpermeable små molekyler i levende celler ved inkubering med Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

Fletning Ion Koncentration Polarisering mellem sidestillede ionbyttermembraner at blokere Forplantningen Polarisering Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting af brusk og huden væv analoger udnytter en roman passiv blanding enhed teknik for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...