Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Dit werk werd ondersteund door de German Research Foundation (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) aan T.F. en N.B. en door het federale ministerie van Onderwijs en Wetenschap (BMBF-programma "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) aan F.-J.S. en T.M.T.T.

De auteurs onthullen alle belangenconflicten.

In de natuur treden manipulaties met eiwitstructuren en -functies meestal op als gevolg van mutaties, het fenomeen dat leidt tot een uitwisseling van een aminozuuridentiteit op bepaalde posities in de eiwitsequentie. Dit natuurlijke mechanisme wordt op grote schaal toegepast als een biotechnologische methode voor eiwittechnologie in de vorm van mutagenese en is gebaseerd op het repertoire van de 20 canonieke aminozuren die bij het proces betrokken zijn. De uitwisseling van prolineresiduen is echter problematisch. Door de speciale backbone-groepsarchitectuur is hij nauwelijks uitwisselbaar met de overige 19 resten voor vervanging72. Proline is bijvoorbeeld meestal bekend als een secundaire structuurbreker in polypeptidesequenties vanwege de slechte compatibiliteit met de meest voorkomende secundaire structuren, d.w.z. α-helix en β-streng. Deze proline-functie gaat gemakkelijk verloren wanneer het residu wordt gemuteerd tot een ander aminozuur uit het gemeenschappelijke repertoire. De vervanging van proline door zijn chemische analogen biedt een alternatieve benadering, die het mogelijk maakt om de basisbackbonekenmerken van het moederprolineresidu te behouden, terwijl vertekening wordt opgelegd aan de specifieke conformatieovergangen of modulaties van het moleculaire volume en de polariteit worden geproduceerd. Het is bijvoorbeeld mogelijk om bacterieculturen te voorzien van analoge structuren zoals hydroxy-, fluoro-, alkyl-, dehydroprolines, structuren met variabele ringgroottes en meer, waardoor de productie van een eiwit met specifieke prolineresiduveranderingen wordt vergemakkelijkt.
De selectieve drukincorporatie (SPI) methode die in deze studie wordt beschreven, maakt een globale, d.w.z. residuspecifieke vervanging van alle prolines in het doeleiwit door verwante chemische analogen mogelijk. Het belang van de methode wordt weerspiegeld door het feit dat SPI het mogelijk maakt om sequentieveranderingen te creëren die niet toegankelijk zijn voor gangbare mutagenesetechnieken. Het maakt bijvoorbeeld de productie mogelijk van een doeleiwit met vrij kleine structurele veranderingen die doorgaans niet groter zijn dan een of twee atoomvervangingen / deleties / toevoegingen, zoals aangetoond in deze studie. Dergelijke eiwitmodificaties worden "atomaire mutaties" genoemd 73,74. In een fluorescerend eiwit zoals GFP is het resultaat van deze moleculaire intrusie te zien in de snelheid van vouwing, lokale polariteiten, eiwitpakking, stabiliteit van de betrokken structurele kenmerken. De veranderingen in de absorptie- en fluorescentie-eigenschappen worden indirect geproduceerd als gevolg van de impact op eiwitvouwing en residumicro-omgevingen. De precisie van de moleculaire veranderingen die door SPI worden uitgevoerd, is meestal veel hoger, in vergelijking met mutaties van prolines naar andere canonieke residuen, waarbij de laatste meestal schadelijk zijn voor de eiwitvouwing, productie en isolatie.
Als productiemethode gebruikt de SPI-benadering de substraattolerantie van de aminoacyl-tRNA-synthetasezak naar chemische analogen van het inheemse aminozuur. Het synthetase is verantwoordelijk voor de juiste identificatie van de aminozuurstructuur, terwijl de opname in eiwitten stroomafwaarts in het translatieproces plaatsvindt. Instrumenteel worden de eiwitproductie, isolatie en zuivering in SPI uitgevoerd op een manier die typerend is voor andere recombinante eiwitexpressietechnieken; echter, met enkele toevoegingen aan het protocol als volgt: Proline, dat op weg is naar vervanging, wordt aan het begin van het fermentatieproces verstrekt, zodat de cellen kunnen groeien en hun intacte cellulaire machinerie kunnen ontwikkelen. De celkweek mag echter niet de maximale optische dichtheid bereiken, om de cellen in de logaritmische fase optimaal te houden voor eiwitexpressie. Er zijn op dit moment twee belangrijke variaties van de SPI-methode. In de eerste wordt de concentratie van proline in het initiële groeimedium (een chemisch gedefinieerd medium) zodanig aangepast dat uitputting van proline plaatsvindt zonder enige externe indringing. De cellen putten proline uit in het medium voordat ze de logaritmische groeifase kunnen verlaten, en vervolgens wordt het analoge toegevoegd en wordt de productie van het eiwit van belang geïnduceerd. In de tweede versie van de methode worden de cellen gekweekt in het medium dat proline bevat tot het midden van hun logaritmische fase. Op dit punt moeten de cellen worden verwijderd en fysiek worden overgebracht naar een ander medium, dat niet langer proline bevat, alleen het analoge, met daaropvolgende inductie van het eiwit van belang. In beide versies worden het analoge en het eiwitinductiereagens aan de voorgekweekte cellen geleverd. De isolatie en zuivering van het wild-type eiwit worden op dezelfde manier uitgevoerd als voor de varianten. In principe kan elke beschikbare Pro-auxotrofe stam worden gebruikt als expressiegastheer. Niettemin zijn expressietests om de meest geschikte host te identificeren raadzaam. Ook kunnen tests van verschillende chemisch gedefinieerde media worden gebruikt om de eiwitopbrengst te optimaliseren.
Er zijn bepaalde vereisten met betrekking tot de chemische analogen die in aanmerking moeten worden genomen voor SPI, zoals oplosbaarheid en concentratie. De metabole beschikbaarheid en opname van aminozuren zijn afhankelijk van het aantal opgeloste moleculen in het medium. Om de oplosbaarheid van een bepaalde verbinding te verhogen, kunnen licht zure of alkalische omstandigheden worden gekozen. Aangezien de kunstmatige moleculen groeiremmende effecten kunnen veroorzaken vanwege hun celtoxiciteit, moet de concentratie tot een minimum worden verlaagd om celstress te voorkomen75.
Een kleine zwakte van SPI is de afname van de integratie-efficiëntie met grotere aantallen posities die moeten worden uitgewisseld. In principe kan een vermindering van de aminozuurfrequentie in het doelbiomolecuul door plaatsgerichte mutagenese dit probleem oplossen. De structurele en functionele eigenschappen van een gewenst eiwit kunnen echter worden beïnvloed door het veranderen van de primaire structuur.
Zoals eerder vermeld, maakt SPI residu-specifieke vervanging van het canonieke aminozuur mogelijk. Dit houdt in dat niet-canonieke aminozuren in elke positie van het canonieke aminozuur in het doeleiwit worden ingebracht, inclusief geconserveerde residuen die onmisbaar zijn voor de eiwitfunctie of -vouwing. Alternatieve methoden voor locatiespecifieke integratie zijn de enige mogelijkheid om dit probleem op telossen 3. In de afgelopen decennia is de orthogonale paarmethode ontwikkeld die eiwitten kan produceren die gemodificeerde residuen bevatten op vooraf gedefinieerde locaties. De meest voorkomende wijziging van deze methode staat bekend als stopcodononderdrukking. Deze methode is gebaseerd op een technisch orthogonaal vertaalsysteem dat is bedoeld voor locatiespecifieke opname van synthetische aminozuren76. Meer dan 200 aminozuren met verschillende zijketenmodificaties zijn tot nu toe met behulp van deze aanpak in eiwitten opgenomen77. Deze translatiesystemen zijn echter nog steeds niet geschikt voor het inbrengen van proline-analogen in doeleiwitten. Bovendien worden de prestaties van de methode als laag beschouwd in het geval van kleine aminozuurmodificaties omdat enige achtergrondpromiscuïteit van het aminoacyl-tRNA-synthetase meestal in de gemanipuleerde translatiesystemen achterblijft.
Met behulp van SPI produceerden we een aantal β-barrel fluorescerende eiwitvarianten en bestudeerden we de uitkomsten van de uitwisseling van proline met zijn onnatuurlijke analogen. In het geval van proline-vervanging door R-Flp en Dfp werd een disfunctioneel eiwit geproduceerd door de expressiegastheer. Het effect wordt waarschijnlijk veroorzaakt door het verkeerd vouwen van eiwitten. Dit laatste kan afkomstig zijn van de C 4-exo conformatie bevorderd door R-Flp, die niet wordt gewaardeerd door de moeder-eiwitstructuren27. Met Dfp wordt de misplooiing waarschijnlijk geproduceerd door de verminderde snelheid van de trans-to-cis peptidebindingsisomerisatie bij het prolineresidu 27. Van dit laatste is bekend dat het een van de beperkende stappen is in het kinetische profiel van de eiwitvouwing die β-vatvorming en daaropvolgende chromofoorrijping beïnvloedt. Inderdaad, voor beide aminozuren, R-Flp en Dfp, resulteerde de eiwitproductie in een geaggregeerd en onoplosbaar eiwit. Bijgevolg kon chromofoorvorming niet plaatsvinden en ging de fluorescentie volledig verloren. Met S-Flp en Dhp werd echter een goede eiwitrijping waargenomen, wat resulteerde in fluorescerende eiwitmonsters voor elke analoge / eiwitcombinatie. Ondanks enkele modulaties in de absorptie- en fluorescentiekenmerken van het eiwit, bleven deze grotendeels vergelijkbaar met die van de wild-type eiwitten. Het effect van de aminozuursubstitutie werd onthuld in de hervouwkinetiekstudies. Deze laatste toonde een snellere hervouwing in het geval van vervanging door S-Flp. Modelstudies hebben aangetoond dat dit residu enige verbetering van de trans-naar-cis amiderotatiesnelheid kan veroorzaken en kan leiden tot de vorming van de C 4-endo-conformatie. Beide factoren zullen waarschijnlijk bijdragen aan de gunstige kinetische effecten van dit residu in EGFP. Dhp daarentegen produceerde kinetische vouwprofielen die maximaal vergelijkbaar waren met het moedereiwit. De diversiteit van de uitkomsten geproduceerd door louter atomaire mutaties in de onderzochte fluorescerende eiwitten illustreert het potentieel van de SPI-productiemethode bij het veranderen van doeleiwiteigenschappen. De eiwitveranderingen geïnduceerd door proline-vervanging door de analogen hebben verdere implicaties in de engineering van enzymen 78,79,80 en ionkanalen81,82, evenals in de algemene engineering van eiwitstabiliteit.
De basisbeperking van de SPI-methode is de "alles-of-geen" -modus bij het uitwisselen van proline bevindt zich met gerelateerde analogen. Het zou van groot voordeel zijn om precies te kunnen selecteren, welke prolineresiduen moeten worden vervangen door de analogen en welke ongewijzigd moeten blijven. Op dit moment is er echter geen techniek die zo'n geavanceerde productie zou kunnen uitvoeren met behulp van een microbiële productiegastheer. Chemische synthese van eiwitten83,84, evenals celvrije productie85,86, zijn de twee alternatieve methoden die positiespecifieke proline-modificaties kunnen produceren. Niettemin maken hun operationele complexiteit en lage productieopbrengsten ze inferieur in vergelijking met de productie in levende cellen. Vanaf nu blijft SPI de meest operationeel eenvoudige en robuuste aanpak voor de productie van complexe eiwitten met atomaire mutaties. Door onnatuurlijke aminozuurvervangers te introduceren, maakt de methode het mogelijk om eiwitkenmerken op een gerichte manier te wijzigen, zoals hier geïllustreerd door veranderingen in vouwing en lichtabsorptie / emissie van fluorescerende eiwitten gegenereerd door proline-vervangingen.

Klassieke site-directed mutagenese maakt permutatie van elke bestaande gen-gecodeerde eiwitsequentie mogelijk door codonmanipulatie op DNA-niveau. Om eiwitvouwing en stabiliteit te bestuderen, is het vaak wenselijk om vergelijkbare aminozuren te vervangen door vergelijkbare tegenhangers. Traditionele eiwitmutagenese is echter zeker beperkt tot structureel vergelijkbare vervangingen onder canonieke aminozuren zoals Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, die aanwezig zijn in het standaard genetische coderepertoire. Aan de andere kant zijn er geen dergelijke mogelijkheden voor andere canonieke aminozuren zoals Trp, Met, His of Pro, die vaak essentiële structurele en functionele rollen spelen in eiwitten1. Een ideale benadering om deze interacties te bestuderen in de context van de zeer specifieke interne architectuur van eiwitten en hun vouwproces is het genereren van niet-verstorende isosterische modificaties. Inderdaad, wanneer isosterische aminozuuranalogen van deze canonieke aminozuren, ook bekend als niet-canonieke aminozuren (NCA's), in eiwitten worden ingebracht, zorgen ze voor subtiele veranderingen, zelfs op het niveau van enkele atomen of atoomgroepen zoals H / F, CH2 / S / Se / Te bekend als "atomaire mutaties"2. Een dergelijke "moleculaire chirurgie" produceert veranderde eiwitten waarvan de eigenschappen uitsluitend het gevolg zijn van de uitwisseling van enkele atomen of groepen atomen, die in gunstige gevallen kunnen worden geanalyseerd en de gedetecteerde veranderingen kunnen worden gerationaliseerd. Op deze manier wordt de reikwijdte van eiwitsynthese om eiwitvouwing en -structuur te bestuderen veel verder uitgebreid dan klassieke DNA-mutagenese. Merk op dat eiwitten die worden gegenereerd door plaatsgerichte mutagenese meestal worden aangeduid als "mutanten", terwijl eiwitten met gesubstitueerde canonieke aminozuren worden aangeduid als "varianten" 3, "alloproteïnen"4 of "eiwitcongeneren"5.
Het groene fluorescerende eiwit (GFP), voor het eerst geïdentificeerd in het mariene organisme Aequorea victoria, vertoont felgroene fluorescentie bij blootstelling aan ultraviolet tot blauw licht 6,7. Tegenwoordig wordt GFP vaak gebruikt als een zeer gevoelig etiketteringsinstrument voor routinematige visualisatie van genexpressie en eiwitlokalisatie in cellen via fluorescerende microscopie. GFP is ook nuttig gebleken in verschillende biofysische 8,9,10 en biomedische 11,12 studies, evenals in eiwittechnologie 13,14,15. Een grondige analyse van de GFP-structuur maakte het mogelijk om talrijke varianten te creëren die worden gekenmerkt door gevarieerde stabiliteits- en fluorescentiemaxima16,17. De meeste GFP-varianten die in de cel- en moleculaire biologie worden gebruikt, zijn monomere eiwitten, zowel in oplossing als in het kristal18. Hun belangrijkste structurele organisatie is typerend voor alle leden van de GFP-familie, onafhankelijk van hun fylogenetische oorsprong, en bestaat uit 11 β-strengen die een zogenaamde β-barrel vormen, terwijl een geknikte α-helix door het midden van de loop loopt en de chromofoor draagt (figuur 1A). De autokatalytische rijping van de chromofoor (figuur 1B) vereist de precieze positionering van de zijketens eromheen op de centrale plaats van het eiwit; veel van deze zijkettingen zijn sterk geconserveerd in andere GFP-varianten19. In de meeste fluorescerende eiwitten van kwallen zoals Aequorea victoria bestaat de groenuitstotende chromofoor uit twee aromatische ringen, waaronder een fenolring van Tyr66 en de vijfkoppige heterocyclische structuur van imidazolinon (figuur 1B). De chromofoor is, wanneer goed ingebed in de eiwitmatrix, verantwoordelijk voor de karakteristieke fluorescentie van het hele eiwit. Het bevindt zich in het midden van de structuur, terwijl de vatstructuur het isoleert van het waterige medium20. Blootstelling van de chromofoor aan het bulkwater zou resulteren in fluorescentie-doven, d.w.z. verlies van fluorescentie21.
Het goed vouwen van de vatachtige structuur is essentieel voor het beschermen van de chromofoor tegen fluorescentie doven22. Proline (Pro) residuen spelen een bijzondere rol in de structurele organisatie van GFP23. Omdat ze niet in staat zijn om een β-streng te ondersteunen, vormen ze verbindingslussen die verantwoordelijk zijn voor het behoud van de eiwitstructuur als geheel. Het is niet verrassend dat 10-15 prolineresiduen worden aangetroffen in zowel Aequorea- als Anthoathecata-afgeleide GFP's; sommigen van hen zijn zeer geconserveerd in andere soorten fluorescerende β-barrel eiwitten. Van prolines wordt verwacht dat ze de vouweigenschappen kritisch beïnvloeden vanwege hun eigenaardige geometrische kenmerken. Bijvoorbeeld, in Aequorea-afgeleide GFP's, van de tien proline residuen (Figuur 2A), vormen negen trans- en slechts één vormt een cis-peptide binding (Pro89). Pro58 is essentieel, d.w.z. niet uitwisselbaar met de rest van de 19 canonieke aminozuren. Dit residu kan verantwoordelijk zijn voor de juiste positionering van het Trp57-residu, waarvan is gemeld dat het cruciaal is voor de rijping van chromofoor en de algeheleGFP-vouwing 24. Het fragment PVPWP met drie proline residuen (Pro54, Pro56, Pro58) en Trp57 is het essentiële onderdeel van het "onderste deksel" in de GFP-structuur uit figuur 1A. Het PVPWP structurele motief wordt gevonden in verschillende eiwitten zoals cytochromen en eukaryote spanningsgeactiveerde kaliumkanalen25. Proline-naar-alanine substituties op posities 75 en 89 zijn ook schadelijk voor eiwitexpressie en vouwing en chromofoorrijping elimineren. Pro75 en Pro89 maken deel uit van het "bovenste deksel" dat de chromofoor begraaft (figuur 1A) en worden bewaard over 11-gestrande β-vat fluorescerende eiwitten23. Deze twee "deksels" houden de chromofoor uitgesloten van het waterige oplosmiddel, zelfs wanneer de stabiele tertiaire structuur gedeeltelijk is gebroken26. Zo'n specifieke moleculaire architectuur beschermt de fluorofoor tegen botsingen (dynamische) fluorescentie-uitschakeling, bijvoorbeeld door water, zuurstof of andere diffuusibele liganden.
Om moleculaire engineering van de GFP-structuur uit te voeren, moet men aminozuursubstituties introduceren in de primaire structuur van het eiwit. Er zijn talrijke mutaties uitgevoerd op GFP, die varianten bieden met verhoogde stabiliteit, snelle en betrouwbare vouwing en variabele fluorescentie-eigenschappen17. Niettemin wordt in de meeste gevallen mutatie van prolineresiduen als een riskante aanpak beschouwd vanwege het feit dat geen van de resterende 19 canonieke aminozuren het conformatieprofiel van het prolineresidu27 goed kan herstellen. Daarom is een alternatieve benadering ontwikkeld, waarbij prolineresiduen worden vervangen door andere proline-gebaseerde structuren, genaamd proline-analogen28. Vanwege zijn unieke cyclische chemische structuur vertoont proline twee karakteristieke conformatieovergangen (figuur 1C): 1) de proline ring puckering, een snel proces dat de organisatie van de ruggengraat met zich meebrengt, wat voornamelijk de φ torsiehoek beïnvloedt, en 2) de peptidebinding cis / trans isomerisatie, een langzaam proces dat de ruggengraat vouwt via de ω torsiehoeken. Vanwege zijn langzame aard is de laatste overgang algemeen verantwoordelijk voor de snelheidsbeperkende stappen in het vouwproces van het hele eiwit. Het is eerder aangetoond dat peptidebinding cis / trans isomerisatie rond sommige proline residuen langzame stappen heeft in het vouwen van GFP-varianten. De vorming van de cis-peptidebinding bij Pro89 heeft bijvoorbeeld de langzame stap in het vouwproces omdat het afhankelijk is van de bindingsovergang van trans naar cis29. Een snellere hervouwing kan worden bereikt na het vervangen van Pro89 door een all-trans peptidelus, d.w.z. door een cis-naar-trans isomerisatiegebeurtenis30 af te schaffen. Naast de cis/trans isomerisatie kunnen de pucker-overgangen ook diepgaande veranderingen in eiwitvouwing veroorzaken als gevolg van de ruggengraatorganisatie en verpakking in het eiwitinterieur27,31.
Chemische modificaties resulteren in verandering van de intrinsieke conformatieovergangen van de prolineresiduen, waardoor het vermogen van het eiwit om te vouwen wordt beïnvloed. Bepaalde proline-analogen zijn bijzonder aantrekkelijke kandidaten voor proline-substitutie in eiwitten omdat ze de manipulatie en studie van de vouweigenschappen mogelijk maken. Bijvoorbeeld, (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp) en 3,4-dehydroproline (Dhp) zijn vier analogen (Figuur 1D) die minimaal verschillen van proline in termen van zowel moleculair volume als polariteit32. Tegelijkertijd vertoont elk analoog een duidelijke ringpuckering: S-Flp stabiliseert de C 4-endo pucker, R-Flp stabiliseert de C 4-exo pucker, Dfp vertoont geen duidelijke puckervoorkeur, terwijl Dhp het puckering afschaft (figuur 1D)33. Door deze analogen in de eiwitstructuur te gebruiken, kan men manipuleren met de conformatieovergang van de prolineresiduen en daarmee de eigenschappen van de resulterende GFP-varianten beïnvloeden.
In dit werk hebben we geprobeerd de aangewezen set proline-analogen (figuur 1D) op te nemen in de structuur van GFP-varianten met behulp van de selectieve drukincorporatiemethode (SPI, figuur 3)34. Vervanging van aminozuurresiduen door hun dichtstbijzijnde isostructurele analogen is een toegepast biotechnologisch concept in eiwitontwerp35,36. De effecten van proline-analogen in een modeleiwit illustreren dus hun potentieel om te dienen als hulpmiddelen in eiwittechnologie37. De productie van eiwitten die gewenste analogen bevatten, werd uitgevoerd in gemodificeerde E. coli-stammen die niet in staat zijn om proline (proline-auxotrofie) te produceren. Zo zouden ze gedwongen kunnen worden om vervanging van substraten te accepteren in het proces van eiwitbiosynthese38. Deze globale substitutie van proline wordt mogelijk gemaakt door de natuurlijke substraatflexibiliteit van endogene aminoacyl-tRNA-synthetasen39, de belangrijkste enzymen die de verestering van tRNA's katalyseren met geschikte aminozuren40. In het algemeen, zoals beschreven in figuur 3, wordt cellulaire groei uitgevoerd in een gedefinieerd medium totdat de mid-logaritmische groeifase is bereikt. In de volgende stap wordt het te vervangen aminozuur tijdens de fermentatie intracellulair uit het expressiesysteem afgevoerd en vervolgens uitgewisseld door het gewenste analoge of ncAA. Doeleiwitexpressie wordt vervolgens geïnduceerd voor residu-specifieke niet-canonieke aminozuurabsorptie. De substitutie van het verwante aminozuur door zijn analoog vindt plaats op een proteoombrede manier. Hoewel deze bijwerking een negatieve invloed kan hebben op de groei van de gastheerstam, wordt de kwaliteit van de productie van doeleiwitten meestal niet beïnvloed, omdat bij recombinante expressie de cellulaire bronnen voornamelijk gericht zijn op de productie van het doeleiwit41,42. Daarom zijn een strak gereguleerd, induceerbaar expressiesysteem en sterke promotors cruciaal voor een hoge integratie-efficiëntie43. Onze aanpak is gebaseerd op meerdere residu-specifieke integratie van NCA's in reactie op sense codons (sense codon reassignment), waarbij binnen het doelgen het aantal posities voor Pro analoge insertie kan worden gemanipuleerd via site-directed mutagenese44. Een vergelijkbare benadering werd toegepast in ons vorige rapport over de bereiding van recombinante peptiden met antimicrobiële eigenschappen45. In dit werk hebben we de SPI-methode toegepast, waarmee alle prolineresiduen kunnen worden vervangen door verwante analogen, om eiwitten te genereren waarvan wordt verwacht dat ze verschillende fysisch-chemische eigenschappen bezitten die niet aanwezig zijn in eiwitten die zijn gesynthetiseerd met het canonieke aminozuurrepertoire. Door het vouw- en fluorescentieprofiel van de resulterende varianten te karakteriseren, willen we de effecten van atomaire substituties in varianten van GFP laten zien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

Vervanging van proline (Pro) residuen in eiwitten door de traditionele plaatsgerichte mutagenese door een van de resterende 19 canonieke aminozuren is vaak schadelijk voor eiwitvouwing en, in het bijzonder, chromofoorrijping in groene fluorescerende eiwitten en aanverwante varianten. Een redelijk alternatief is om de translatie van het eiwit zo te manipuleren dat alle Pro-residuen residu-specifiek worden vervangen door analogen, een methode die bekend staat als selectieve drukincorporatie (SPI). De ingebouwde chemische modificaties kunnen worden gebruikt als een soort "moleculaire chirurgie" om meetbare veranderingen fijn te ontleden of zelfs rationeel verschillende eiwiteigenschappen te manipuleren. Hier toont de studie het nut aan van de SPI-methode om de rol van prolines te bestuderen in de organisatie van de typische β-barrel structuur van spectrale varianten van het groene fluorescerende eiwit (GFP) met 10-15 prolines in hun sequentie: verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP), NowGFP en KillerOrange. Pro-residuen zijn aanwezig in verbindingssecties tussen individuele β-strengen en vormen de sluitdeksels van de vatsteiger, waardoor ze verantwoordelijk zijn voor de isolatie van de chromofoor uit water, d.w.z. fluorescentie-eigenschappen. Selectieve drukincorporatie-experimenten met (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp) en 3,4-dehydroproline (Dhp) werden uitgevoerd met behulp van een proline-auxotrofe E. coli-stam als expressiegastheer. We ontdekten dat fluorescerende eiwitten met S-Flp en Dhp actief zijn (d.w.z. fluorescerend), terwijl de andere twee analogen (Dfp en R-Flp) disfunctionele, verkeerd gevouwen eiwitten produceerden. Inspectie van UV-Vis absorptie- en fluorescentie-emissieprofielen toonde weinig karakteristieke veranderingen in de eiwitten die Pro-analogen bevatten. Onderzoek van de vouwkinetische profielen in EGFP-varianten toonde een versneld hervouwproces in aanwezigheid van S-Flp, terwijl het proces vergelijkbaar was met wild-type in het eiwit dat Dhp bevat. Deze studie toont het vermogen van de SPI-methode om subtiele modificaties van eiwitresiduen op atomair niveau ("moleculaire chirurgie") te produceren, die kunnen worden gebruikt voor de studie van andere eiwitten van belang. Het illustreert de resultaten van proline-vervangingen met nauwe chemische analogen op de vouwende en spectroscopische eigenschappen in de klasse van β-vat fluorescerende eiwitten.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Om de beperkingen van klassieke site-directed mutagenese te overwinnen, werden proline analogen met specifieke modificaties opgenomen in verschillende fluorescerende eiwitten. We laten zien hoe de vervanging van waterstof door fluor of van de enkele door dubbele bindingen in prolineresiduen ("moleculaire chirurgie") fundamentele eiwiteigenschappen beïnvloedt, inclusief hun vouwing en interactie met licht.

Residu-specifieke uitwisseling van Proline door Proline-analogen in fluorescerende eiwitten: hoe "moleculaire chirurgie" van de ruggengraat de vouwing en stabiliteit beïnvloedt

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

In de meeste gevallen is conventionele plaatsgerichte mutagenese niet geschikt om de functionele rol van prolines in eiwitten te bestuderen. Hier presenteren we een methode om proline-analogen als niet-canonieke aminozuren op te nemen in ribosomaal gesynthetiseerde eiwitten om de rol van prolineresiduen op eiwitvouwing en -functie te onderzoeken. De vervanging van prolines door standaard aminozuren is een riskante aanpak.Integratie van proline analogen maakt een soort moleculaire chirurgie mogelijk. Met andere woorden, het introduceert subtiele moleculaire veranderingen om eiwiteigenschappen rationeel te beïnvloeden en te manipuleren. Aangezien prolineresiduen een essentiële rol spelen in de stabiliteit van eiwitsteigers, kan onze technologie nuttig zijn om de redenen achter eiwitvouwtekorten te begrijpen, die ten grondslag liggen aan bepaalde pathologische toestanden bij mensen.De eiwitveranderingen geïnduceerd door proline-vervangingen hebben implicaties voor de biotechnologische engineering van enzymen en bieden mogelijkheden voor verbetering van ribosomale eiwitomzetting of -vouwing. Deze methode vereist geen speciale apparatuur en dure instrumentatie. Speciale zorg moet worden besteed aan protocolstappen, waarbij inheemse proline wordt uitgeput van E.coli-culturen voorafgaand aan de toevoeging van proline-analogen.Om te beginnen met de productie van de fluorescerende eiwitten met inheemse proline, ent u 200 milliliter vers NMM-medium in een Erlenmeyer van twee liter met twee milliliter van de nachtcultuur. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een orbitale shaker bij 220 RPM gedurende ongeveer 3,5 uur. Meet tijdens de incubatie elke 30 minuten de optische dichtheid op 600 nanometer in een spectrofotometer.Wanneer de optische dichtheid 0,7 bereikt, draai je de celsuspensie naar beneden en decanteer je het supernatant voorzichtig in afval. Was vervolgens de cellen door opnieuw uit te geven in 50 milliliter ijskoude NMM zonder aminozuren of NMM zonder proline. Draai de cellen opnieuw en decanteer het supernatant in afval.Vervolgens resuspendeert u de celkorrel door zachtjes te pipetteren in 200 milliliter NMM zonder proline en aangevuld met ampicilline in een Erlenmeyer van twee liter, en incubeer de cellen gedurende 30 minuten in een orbitale shaker om de volledige uitputting van proline mogelijk te maken. Voeg na incubatie een geschikt volume L-proline of de proline-analogen uit de 50-millimolar stock-oplossingen toe om een eindconcentratie van één millimol in de celsuspensie te verkrijgen. Induceer vervolgens doeleiwitexpressie door 500-micromolaire IPTG toe te voegen uit een één-molaire stamoplossing.Druk het doeleiwit 's nachts uit bij 37 graden Celsius in een orbitale shaker en meet de optische dichtheid de volgende dag. Verzamel de bacteriële cellen door centrifugering en decanteer het supernatant in afval. Was vervolgens de cellen door voorzichtig te pipetteren in 50 milliliter bindingsbuffer met 10% glycerol.Draai de cellen opnieuw, decanteer het supernatant en bewaar de celkorrel in een buis van 50 milliliter bij min 20 of 80 graden Celsius tot verder gebruik. Voordat u de fluorescentie-emissie evalueert, voert u een SDS-PAGE uit om ervoor te zorgen dat de zuiverheid van het monster hoger is dan 95%, pas vervolgens de monsters van elke gezuiverde eiwitvariant aan tot een concentratie van 0,3 micromol, waarbij u de berekende absorptiewaarde op de juiste golflengte als referentie neemt. Zorg ervoor dat het uiteindelijke monstervolume bij benadering 200 microliter bedraagt.Laat de verdunde monsters bij kamertemperatuur in evenwicht brengen. Breng de monsters na een uur over in een kwartscuvet van één centimeter en meet het fluorescentie-emissiespectrum van de monsters met behulp van een fluorescentiespectrometer. Om denaturatie te induceren, verdunt u de monsters van elke eiwitvariant twintigvoudig door de twee microliter van 300 micromolaire monsters toe te voegen aan 18 microliter 1,11x PBS-buffer met 8,89-molair ureum en 5,56-millimolar DTT.Incubeer de monsters bij 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Verdun vervolgens de monsters 100-voudig door 1.980 microliter PBS toe te voegen die vijf millimolaire DTT bevat om renaturatie te induceren en breng onmiddellijk 200 microliter van de monsters over in een kwartscuvet van één centimeter. Plaats het kwartscuvet in een geschikte fluorescentiespectrometer en controleer het opnieuw vouwen van eiwitten door elke drie seconden gedurende 30 minuten een fluorescentiespectrum te verkrijgen.Breng de hervouwmonsters over in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter, sluit vervolgens het deksel en bewaar de monsters bij kamertemperatuur in het donker om een volledige hervouwing van EGFP-varianten mogelijk te maken. Meet na 24 uur de fluorescentie-emissie van de opnieuw gevouwen eiwitmonsters met dezelfde excitatiegolflengte als voorheen om het temporele eindpunt van fluorescentieherstel vast te leggen. Pellets van cellen die inheemse eiwitten tot expressie brengen en varianten met S-fluoroproline en dehydroproline hadden een typische heldere kleur vanwege de intacte chromofoor.Daarentegen bleven varianten die R-fluoroproline en difluoroproline bevatten kleurloos, wat wijst op verkeerd vouwen en afzetting van ongevouwen eiwit in inclusielichamen. SDS-PAGE-analyse verifieerde de aanwezigheid van onoplosbare R-fluoroproline-bevattende eiwitten. Daarentegen werden inheemse eiwitten en S-fluoroproline- en dehydroproline-dragende varianten gevonden in de oplosbare fracties.In vloeistofchromatografie/massaspectrometrie-analyse produceerde elke prolinevervanging door S-fluoroproline een positieve 18-daltonverschuiving per prolineresidu, terwijl vervanging door dehydroproline een negatieve verschuiving van twee dalton per residu opleverde. In lichtabsorptie- en emissiespectra werd chromofoorabsorptie gevonden bij 488 nanometer voor EGFP en 493 nanometer voor NowGFP. In KillerOrange bestond het chromofoorabsorptiegebied uit twee banden die overeenkomen met twee mogelijke configuratie- en ladingstoestanden van de complexe chromofoor.Verder impliceerden fluorescentiespectra geregistreerd bij excitatie op de overeenkomstige maximale absorptiegolflengten dat de analogen de chemische omgeving van de chromoforen niet veranderden. In hervouwexperimenten herstelde de inheemse EGFP-chromofoorfluorescentie gedeeltelijk, hoewel de tryptofaanspecifieke fluorescentie groter was na renaturatie. Vergelijkbaar gedrag werd waargenomen voor de variant die dehydroproline bevat.In EGFP-bevattende S-fluoroproline werd een vergelijkbaar resultaat waargenomen met een excitatie van 295 nanometer, terwijl fluorescentie in veel hogere mate herstelde bij 488 nanometer. Alleen de EGFP-varianten vertoonden een snelle hervouwkinetiek waarbij tryptofaanemissieterugwinning twee keer zo snel was in vergelijking met de chromofooremissie. Er moeten verse bacterieculturen met geschikte groeimedia worden gebruikt.Steriele technieken en regelmatige monitoring van de cultuurgroei zijn ook belangrijke voorwaarden voor het succes van het experiment. Deze methode is van toepassing op eiwittechnologie, omdat het de rol van andere canonieke aminozuren kan bestuderen. Hiervoor zijn geschikte auxotrofische E.coli-stammen en aminozuuranalogen nodig.Massaspectrometrie van hele eiwitten is vereist als analytisch bewijs om de opname van niet-canonieke aminozuuranalogen te bevestigen. De SPI-methode voor het opnemen van proline-analogen stelt ons in staat om de eiwitbackbone direct te manipuleren en biedt voordelen voor rationeel ontwerp en vergemakkelijkte productie van eiwitten door wereldwijde stabilisatie en verbetering van ribosomale translatie of vouwing.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Thermodynamica van membraaneiwit Folding Gemeten door fluorescentiespectroscopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Fluorescerende Nanodeeltjes voor het meten van Ion Concentratie in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Het visualiseren van Eiwitten en macromoleculaire complexen door Negative Stain EM: van Grid Voorbereiding op Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kwantificering van Global diastolische functie door Kinematisch Modeling-gebaseerde analyse van transmitraal Flow via de Geparameteriseerde diastolische Vullen formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

Het samenvoegen van Ion Concentratie polarisatie tussen Naast elkaar Ion Exchange membranen aan de voortplanting van de Polarisatie Zone blokkeren

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting van kraakbeen en huid weefsel analogen met behulp van een roman passief mengen eenheid techniek voor Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...