Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (Cluster of Excellence « Unifying Systems in Catalysis ») à T.F. et N.B. et par le ministère fédéral de l’Éducation et des Sciences (BMBF Program « HSP 2020 », TU-WIMIplus Project SynTUBio) à F.-J.S. et T.M.T.T.

Les auteurs divulguent tous les conflits d’intérêts.

Dans la nature, les manipulations avec les structures et les fonctions des protéines se produisent généralement en raison de mutations, le phénomène qui conduit à un échange d’une identité d’acide aminé à certaines positions de la séquence protéique. Ce mécanisme naturel est largement appliqué en tant que méthode biotechnologique pour l’ingénierie des protéines sous forme de mutagénèse, et il repose sur le répertoire des 20 acides aminés canoniques impliqués dans le processus. L’échange de résidus de proline est cependant problématique. En raison de son architecture de groupe dorsal spéciale, il est difficilement interchangeable avec les 19 résidus restants pour le remplacementde 72. Par exemple, la proline est généralement connue comme un briseur de structure secondaire dans les séquences polypeptidiques en raison de sa faible compatibilité avec les structures secondaires les plus courantes, c’est-à-dire α hélice et β brin. Cette caractéristique de la proline est facilement perdue lorsque le résidu est muté en un autre acide aminé du répertoire commun. Le remplacement de la proline par ses analogues chimiques offre une approche alternative, qui permet de conserver les caractéristiques de base du résidu de proline parent tout en imposant un biais sur ses transitions conformationnelles spécifiques ou en produisant des modulations du volume moléculaire et de la polarité. Par exemple, il est possible de fournir des cultures bactériennes avec des structures analogiques telles que l’hydroxy-, fluoro-, alkyl-, les déshydroprolines, des structures ayant des tailles d’anneaux variables et plus encore, facilitant ainsi la production d’une protéine contenant des altérations spécifiques des résidus de proline.
La méthode d’incorporation sélective sous pression (SPI) décrite dans cette étude permet un remplacement global, c’est-à-dire spécifique aux résidus, de toutes les prolines de la protéine cible par des analogues chimiques apparentés. L’importance de la méthode se reflète dans le fait que SPI permet de créer des changements de séquence inaccessibles aux techniques de mutagénèse courantes. Par exemple, il permet la production d’une protéine cible contenant des changements structurels plutôt faibles qui ne peuvent généralement pas dépasser un ou deux remplacements/délétions/ajouts d’atomes, comme l’a démontré cette étude. De telles modifications protéiques sont appelées « mutations atomiques »73,74. Dans une protéine fluorescente telle que la GFP, le résultat de cette intrusion moléculaire peut être vu dans la vitesse de repliement, les polarités locales, l’emballage des protéines, la stabilité des caractéristiques structurelles impliquées. Les changements dans les propriétés d’absorbance et de fluorescence sont produits indirectement en raison de l’impact sur le repliement des protéines et les microenvironnements résiduels. La précision des changements moléculaires effectués par SPI est généralement beaucoup plus élevée, par rapport aux mutations des prolines à d’autres résidus canoniques, ces derniers étant généralement préjudiciables au repliement, à la production et à l’isolement des protéines.
En tant que méthode de production, l’approche SPI utilise la tolérance du substrat de la poche aminoacyl-ARNt synthétase vis-à-vis des analogues chimiques de l’acide aminé natif. La synthétase est responsable de l’identification correcte de la structure des acides aminés, tandis que l’incorporation dans les protéines se produit en aval dans le processus de traduction. Instrumentalement, la production, l’isolement et la purification des protéines dans SPI sont effectués d’une manière typique de toute autre technique d’expression des protéines recombinantes; cependant, avec quelques ajouts au protocole comme suit: Proline, qui est destiné au remplacement, est fourni au début du processus de fermentation, de sorte que les cellules peuvent croître et développer leur machinerie cellulaire intacte. Cependant, la culture cellulaire n’est pas autorisée à atteindre la densité optique maximale, pour maintenir les cellules dans la phase logarithmique optimale pour l’expression des protéines. Il existe deux variantes majeures de la méthode SPI à ce stade. Dans le premier, la concentration de proline est ajustée dans le milieu de croissance initial (un milieu chimiquement défini) de sorte que l’épuisement de la proline se produit sans aucune intrusion externe. Les cellules épuisent la proline dans le milieu avant de pouvoir sortir de la phase de croissance logarithmique, puis, par la suite, l’analogue est ajouté et la protéine d’intérêt est induite. Dans la deuxième version de la méthode, les cellules sont cultivées dans le milieu contenant de la proline jusqu’au milieu de leur phase logarithmique. À ce stade, les cellules doivent être retirées et physiquement transférées dans un autre milieu, qui ne contient plus de proline, seulement l’analogue, avec induction ultérieure de la protéine d’intérêt. Dans les deux versions, l’analogue et le réactif d’induction des protéines sont fournis aux cellules pré-cultivées. L’isolement et la purification de la protéine de type sauvage sont effectués de la même manière que pour les variantes. En principe, chaque souche pro-auxotrophique disponible peut être utilisée comme hôte d’expression. Néanmoins, des tests d’expression pour identifier l’hôte le plus approprié sont conseillés. En outre, des tests de différents milieux chimiquement définis peuvent être utilisés pour optimiser le rendement en protéines.
Certaines exigences concernant les analogues chimiques doivent être prises en compte pour l’IPS, telles que la solubilité et la concentration. La disponibilité métabolique et l’absorption des acides aminés dépendent du nombre de molécules dissoutes dans le milieu. Pour augmenter la solubilité d’un composé particulier, des conditions légèrement acides ou alcalines peuvent être choisies. Étant donné que les molécules artificielles peuvent provoquer des effets inhibiteurs de croissance en raison de leur toxicité cellulaire, la concentration doit être réduite au minimum afin d’éviter le stress cellulaire75.
Une faiblesse mineure de SPI est la diminution de l’efficacité de l’incorporation avec un plus grand nombre de positions qui doivent être échangées. En principe, une réduction de la fréquence des acides aminés dans la biomolécule cible par mutagénèse dirigée par le site peut résoudre ce problème. Cependant, les propriétés structurelles et fonctionnelles d’une protéine désirée peuvent être affectées par la modification de la structure primaire.
Comme mentionné précédemment, SPI permet le remplacement spécifique des résidus de l’acide aminé canonique. Cela implique que les acides aminés non canoniques sont insérés dans toutes les positions de l’acide aminé canonique dans la protéine cible, y compris les résidus conservés qui sont indispensables au fonctionnement ou au repliement des protéines. D’autres méthodes d’incorporation spécifique au site sont la seule possibilité de surmonter ce problème3. Au cours des dernières décennies, la méthode des paires orthogonales a été développée pour produire des protéines contenant des résidus modifiés sur des sites prédéfinis. La modification la plus courante de cette méthode est connue sous le nom de suppression du codon stop. Cette méthode est basée sur un système de traduction orthogonale conçu dédié à l’incorporation spécifique au site d’acides aminés synthétiques76. Plus de 200 acides aminés avec différentes modifications de la chaîne latérale ont été incorporés dans les protéines à ce jour en utilisant cette approche77. Cependant, ces systèmes de traduction ne conviennent toujours pas aux insertions d’analogues de la proline dans les protéines cibles. En outre, les performances de la méthode sont considérées comme faibles dans le cas de modifications mineures des acides aminés, car une certaine promiscuité de fond de l’aminoacyl-ARNt synthétase reste généralement dans les systèmes de traduction modifiés.
En utilisant SPI, nous avons produit un certain nombre de variantes de protéines fluorescentes à baril β et étudié les résultats de l’échange de proline avec ses analogues non naturels. Dans le cas du remplacement de la proline par R-Flp et Dfp, une protéine dysfonctionnelle a été produite par l’hôte d’expression. L’effet est probablement produit par un mauvais repliement des protéines. Ce dernier peut provenir de la conformationC4-exo favorisée par R-Flp, qui est défavorable aux structures protéiquesmères 27. Avec Dfp, le mauvais repliement est susceptible d’être produit par la diminution de la vitesse de l’isomérisation de la liaison peptidique trans-cis au niveau du résidu de proline27. Ce dernier est connu pour être parmi les étapes limitantes dans le profil cinétique du repliement des protéines qui affecte la formation de β-baril et la maturation ultérieure du chromophore. En effet, pour les deux acides aminés, R-Flp et Dfp, la production de protéines a abouti à une protéine agrégée et insoluble. Par conséquent, la formation de chromophores n’a pas pu se produire et la fluorescence a été entièrement perdue. Avec S-Flp et Dhp, cependant, une maturation appropriée des protéines a été observée, ce qui a donné des échantillons de protéines fluorescentes pour chaque combinaison analogique/ protéine. Malgré certaines modulations dans les caractéristiques d’absorbance et de fluorescence de la protéine, celles-ci sont restées en grande partie similaires à celles des protéines de type sauvage. L’effet de la substitution des acides aminés a été révélé dans les études cinétiques de repliement. Ce dernier a montré un repliement plus rapide en cas de remplacement par S-Flp. Des études sur des modèles ont montré que ce résidu peut générer une certaine amélioration de la vitesse de rotation de l’amide trans-à-cis et conduire à la formation de la conformationC4-endo. Ces deux facteurs sont susceptibles de contribuer aux effets cinétiques bénéfiques de ce résidu dans l’EGFP. En revanche, Dhp a produit des profils de repliement cinétiques au maximum similaires à la protéine mère. La diversité des résultats produits par de simples mutations atomiques dans les protéines fluorescentes examinées illustre le potentiel de la méthode de production SPI dans la modification des propriétés des protéines cibles. Les altérations protéiques induites par le remplacement de la proline par les analogues ont d’autres implications dans l’ingénierie des enzymes 78,79,80 et des canaux ioniques 81,82, ainsi que dans l’ingénierie générale de la stabilité des protéines.
La limitation de base de la méthode SPI est son mode « tout ou rien » dans l’échange de proline réside avec des analogues connexes. Il serait très avantageux de pouvoir sélectionner avec précision quels résidus de proline devraient être remplacés par les analogues et lesquels devraient rester inchangés. Cependant, à l’heure actuelle, il n’existe aucune technique qui pourrait effectuer une production aussi sophistiquée en utilisant un hôte de production microbien. La synthèse chimique des protéines83,84, ainsi que la production sans cellules85,86, sont les deux méthodes alternatives qui peuvent produire des modifications de proline spécifiques à la position. Néanmoins, leur complexité opérationnelle et leurs faibles rendements de production les rendent inférieurs à la production dans les cellules vivantes. À l’heure actuelle, SPI reste l’approche la plus simple et la plus robuste sur le plan opérationnel pour la production de protéines complexes porteuses de mutations atomiques. En introduisant des substituts d’acides aminés non naturels, la méthode permet de modifier les caractéristiques des protéines de manière ciblée, comme en témoignent les altérations du repliement et de l’absorption / émission de lumière des protéines fluorescentes générées par les substituts de la proline.

La mutagénèse classique dirigée par site permet la permutation de toute séquence protéique codée par un gène existante par manipulation du codon au niveau de l’ADN. Pour étudier le repliement et la stabilité des protéines, il est souvent souhaitable de remplacer des acides aminés similaires par des homologues similaires. Cependant, la mutagenèse protéique traditionnelle est définitivement limitée à des remplacements structurellement similaires parmi les acides aminés canoniques tels que Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, qui sont présents dans le répertoire de code génétique standard. D’autre part, il n’existe pas de telles possibilités pour d’autres acides aminés canoniques tels que Trp, Met, His ou Pro, qui jouent souvent des rôles structurels et fonctionnels essentiels dans les protéines1. Une approche idéale pour étudier ces interactions dans le contexte de l’architecture interne très spécifique des protéines et de leur processus de repliement consiste à générer des modifications isostériques non perturbatrices. En effet, lorsque des analogues d’acides aminés isostériques de ces acides aminés canoniques, également connus sous le nom d’acides aminés non canoniques (ncAA), sont insérés dans les protéines, ils permettent des changements subtils même au niveau d’atomes simples ou de groupes d’atomes tels que H/F, CH2/S/Se/Te connus sous le nom de « mutations atomiques »2. Une telle « chirurgie moléculaire » produit des protéines altérées dont les propriétés résultent uniquement de l’échange d’atomes uniques ou de groupes d’atomes, qui dans des cas favorables peuvent être analysés et les changements détectés peuvent être rationalisés. De cette façon, la portée de la synthèse des protéines pour étudier le repliement et la structure des protéines est étendue bien au-delà de la mutagénèse classique de l’ADN. Notez que les protéines générées par la mutagénèse dirigée par le site sont généralement appelées « mutants », tandis que les protéines avec des acides aminés canoniques substitués sont appelées « variantes » 3, « alloprotéines»4 ou « congénères protéiques»5.
La protéine fluorescente verte (GFP), identifiée pour la première fois dans l’organisme marin Aequorea victoria, présente une fluorescence vert vif lorsqu’elle est exposée à une lumière ultraviolette à bleue 6,7. Aujourd’hui, la GFP est couramment utilisée comme outil de marquage très sensible pour la visualisation de routine de l’expression des gènes et de la localisation des protéines dans les cellules par microscopie fluorescente. Le GFP s’est également avéré utile dans diverses études biophysiques 8,9,10 et biomédicales 11,12, ainsi que dans l’ingénierie des protéines 13,14,15. Une analyse rigoureuse de la structure GFP a permis la création de nombreuses variantes caractérisées par une stabilité variée et des maximade fluorescence 16,17. La plupart des variantes de GFP utilisées en biologie cellulaire et moléculaire sont des protéines monomères à la fois en solution et dans le cristal18. Leur organisation structurelle principale est typique de tous les membres de la famille GFP, indépendamment de leur origine phylogénétique, et se compose de 11 brins β formant un baril β, tandis qu’une hélice α plissée traverse le centre du canon et porte le chromophore (Figure 1A). La maturation autocatalytique du chromophore (Figure 1B) nécessite le positionnement précis des chaînes latérales qui l’entourent à la place centrale de la protéine ; beaucoup de ces chaînes latérales sont hautement conservées dans d’autres variantes GFP19. Dans la plupart des protéines fluorescentes de méduses telles que Aequorea victoria, le chromophore émetteur de vert se compose de deux cycles aromatiques, dont un cycle phénolique de Tyr66 et la structure hétérocyclique à cinq membres de l’imidazolinone (Figure 1B). Le chromophore, lorsqu’il est correctement intégré dans la matrice protéique, est responsable de la fluorescence caractéristique de la protéine entière. Il est situé au centre de la structure, tandis que la structure du tonneau l’isole du milieu aqueux20. L’exposition du chromophore à l’eau en vrac entraînerait une trempe par fluorescence, c’est-à-dire une perte de fluorescence21.
Le pliage approprié de la structure en forme de tonneau est essentiel pour protéger le chromophore contre la trempe par fluorescence22. Les résidus de proline (Pro) jouent un rôle particulier dans l’organisation structurelle du GFP23. Étant incapables de supporter un β brins, ils constituent des boucles de connexion responsables du maintien de la structure protéique dans son ensemble. Sans surprise, 10 à 15 résidus de proline se trouvent dans les GFP dérivés d’Aequorea et d’Anthoathecata; certains d’entre eux sont hautement conservés dans d’autres types de protéines fluorescentes β barils. On s’attend à ce que les prolines influencent de manière critique les propriétés de pliage en raison de leurs caractéristiques géométriques particulières. Par exemple, dans les GFPs dérivés d’Aequorea, sur les dix résidus de proline (Figure 2A), neuf forment des trans- et un seul forme une liaison cis-peptide (Pro89). Pro58 est essentiel, c’est-à-dire non interchangeable avec le reste des 19 acides aminés canoniques. Ce résidu peut être responsable du positionnement correct du résidu Trp57, qui a été signalé comme étant crucial pour la maturation du chromophore et le repliement global du GFP24. Le fragment PVPWP avec trois résidus de proline (Pro54, Pro56, Pro58) et Trp57 est la partie essentielle de la « paupière inférieure » dans la structure GFP de la figure 1A. Le motif structurel du PVPWP se trouve dans plusieurs protéines telles que les cytochromes et les canaux potassiques eucaryotes activés par la tension25. Les substitutions de proline à alanine aux positions 75 et 89 sont également préjudiciables à l’expression et au repliement des protéines et abolissent la maturation des chromophores. Pro75 et Pro89 font partie de la « paupière supérieure » enfouissant le chromophore (Figure 1A) et sont conservés dans les protéines fluorescentes à 11 brins β baril23. Ces deux « couvercles » maintiennent le chromophore exclu du solvant aqueux, même lorsque la structure tertiaire stable a été partiellement brisée26. Une telle architecture moléculaire spécifique protège le fluorophore de la trempe par fluorescence collisionnelle (dynamique), par exemple par l’eau, l’oxygène ou d’autres ligands diffusibles.
Afin d’effectuer l’ingénierie moléculaire de la structure GFP, il faut introduire des substitutions d’acides aminés dans la structure primaire de la protéine. De nombreuses mutations ont été réalisées sur GFP, fournissant des variantes avec une stabilité élevée, un repliement rapide et fiable et des propriétés de fluorescence variables17. Néanmoins, dans la plupart des cas, la mutation des résidus de proline est considérée comme une approche risquée en raison du fait qu’aucun des 19 acides aminés canoniques restants ne peut restaurer correctement le profil conformationnel du résidu de proline27. Ainsi, une approche alternative a été développée, dans laquelle les résidus de proline sont remplacés par d’autres structures à base de proline, surnommées analogues de la proline28. En raison de sa structure chimique cyclique unique, la proline présente deux transitions conformationnelles caractéristiques (Figure 1C) : 1) le pliage de l’anneau de proline, un processus rapide impliquant l’organisation de l’épine dorsale, qui affecte principalement l’angle de torsion φ, et 2) l’isomérisation de la liaison peptidique cis/trans, un processus lent impactant le repliement de l’épine dorsale via les angles de torsion ω. En raison de sa nature lente, cette dernière transition est généralement responsable des étapes limitant le taux dans le processus de repliement de la protéine entière. Il a été démontré précédemment que l’isomérisation cis/trans de la liaison peptidique autour de certains résidus de proline comporte des étapes lentes dans le repliement des variantes GFP. Par exemple, la formation de la liaison cis-peptide à Pro89 présente l’étape lente du processus de repliement car elle repose sur la transition de la liaison de trans à cis29. Un repliement plus rapide peut être obtenu après avoir remplacé Pro89 par une boucle peptidique entièrement trans, c’est-à-dire en abolissant un événement d’isomérisation cis-à-trans 30. En plus de l’isomérisation cis/trans, les transitions de pucker peuvent également générer de profonds changements dans le repliement des protéines en raison de l’organisation de l’épine dorsale et de l’emballage dans l’intérieur de la protéine27,31.
Les modifications chimiques entraînent une altération des transitions conformationnelles intrinsèques des résidus de proline, affectant ainsi la capacité de la protéine à se replier. Certains analogues de la proline sont des candidats particulièrement attrayants pour la substitution de la proline dans les protéines car ils permettent la manipulation et l’étude des propriétés de repliement. Par exemple, (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp) et 3,4-déshydroproline (Dhp) sont quatre analogues (Figure 1D) qui diffèrent peu de la proline en termes de volume moléculaire et de polarité32. Dans le même temps, chaque analogue présente une rondelle annulaire distincte : S-Flp stabilise la rondelle C4-endo, R-Flp stabilise la rondelle C4-exo, Dfp ne présente aucune préférence apparente pour la rondelle, tandis que Dhp abolit la rondelle (Figure 1D)33. En utilisant ces analogues dans la structure protéique, on peut manipuler avec la transition conformationnelle des résidus de proline, et avec cela, affecter les propriétés des variantes GFP résultantes.
Dans ce travail, nous avons entrepris d’incorporer l’ensemble désigné d’analogues de la proline (figure 1D) dans la structure des variantes GFP en utilisant la méthode d’incorporation sélective de la pression (SPI, Figure 3)34. Le remplacement des résidus d’acides aminés par leurs analogues isostructuraux les plus proches est un concept biotechnologique appliqué dans la conception des protéines35,36. Ainsi, les effets des analogues de la proline dans une protéine modèle illustrent leur potentiel à servir d’outils dans l’ingénierie des protéines37. La production de protéines contenant les analogues souhaités a été réalisée dans des souches modifiées d’E. coli qui ne sont pas capables de produire de la proline (auxotrophie de la proline). Ainsi, ils pourraient être contraints d’accepter le remplacement des substrats dans le processus de biosynthèse des protéines38. Cette substitution globale de la proline est rendue possible par la flexibilité naturelle du substrat des aminoacyl-ARNt endogènes synthétases39, les enzymes clés catalysant l’estérification des ARNt avec les acides aminés appropriés40. En général, comme le montre la figure 3, la croissance cellulaire est effectuée dans un milieu défini jusqu’à ce que la phase de croissance mi-logarithmique soit atteinte. Dans l’étape suivante, l’acide aminé à remplacer est appauvri intracellulairement du système d’expression pendant la fermentation et ensuite échangé par l’analogue souhaité ou ncAA. L’expression de la protéine cible est ensuite induite pour l’incorporation d’acides aminés non canoniques spécifiques aux résidus. La substitution de l’acide aminé apparenté par son analogue se produit à l’échelle du protéome. Bien que cet effet secondaire puisse avoir un impact négatif sur la croissance de la souche hôte, la qualité de la production de protéines cibles n’est généralement pas affectée, car, dans l’expression recombinante, les ressources cellulaires sont principalement dirigées vers la production de la protéine cible41,42. Par conséquent, un système d’expression inductible étroitement réglementé et de puissants promoteurs sont essentiels pour une efficacité d’incorporation élevée43. Notre approche est basée sur l’incorporation multiple de ncAA spécifiques aux résidus en réponse à des codons de sens (réaffectation de codon de sens), par laquelle dans le gène cible, le nombre de positions pour l’insertion analogique Pro peut être manipulé via la mutagénèse dirigée par le site44. Une approche similaire a été appliquée dans notre rapport précédent sur la préparation de peptides recombinants ayant des propriétés antimicrobiennes45. Dans ce travail, nous avons appliqué la méthode SPI, qui permet de remplacer tous les résidus de proline par des analogues apparentés, pour générer des protéines censées posséder des propriétés physicochimiques distinctes non présentes dans les protéines synthétisées avec le répertoire canonique d’acides aminés. En caractérisant le profil de pliage et de fluorescence des variantes résultantes, nous visons à mettre en évidence les effets des substitutions atomiques dans les variantes de GFP.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

Le remplacement des résidus de proline (Pro) dans les protéines par la mutagénèse traditionnelle dirigée par le site par l’un des 19 acides aminés canoniques restants est souvent préjudiciable au repliement des protéines et, en particulier, à la maturation des chromophores dans les protéines fluorescentes vertes et les variantes connexes. Une alternative raisonnable consiste à manipuler la traduction de la protéine afin que tous les résidus Pro soient remplacés spécifiquement par des analogues, une méthode connue sous le nom d’incorporation sélective sous pression (SPI). Les modifications chimiques intégrées peuvent être utilisées comme une sorte de « chirurgie moléculaire » pour disséquer finement les changements mesurables ou même manipuler rationnellement différentes propriétés des protéines. Ici, l’étude démontre l’utilité de la méthode SPI pour étudier le rôle des prolines dans l’organisation de la structure typique β baril des variantes spectrales de la protéine fluorescente verte (GFP) avec 10-15 prolines dans leur séquence: protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), NowGFP et KillerOrange. Les résidus Pro sont présents dans les sections de connexion entre les différents brins de β et constituent les couvercles de fermeture de l’échafaudage du baril, étant ainsi responsables de l’isolation du chromophore de l’eau, c’est-à-dire des propriétés de fluorescence. Des expériences d’incorporation sélective sous pression avec (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp) et 3,4-déshydroproline (Dhp) ont été réalisées en utilisant une souche d’E. coli proline-auxotrophe comme hôte d’expression. Nous avons constaté que les protéines fluorescentes avec S-Flp et Dhp sont actives (c’est-à-dire fluorescentes), tandis que les deux autres analogues (Dfp et R-Flp) produisent des protéines dysfonctionnelles et mal repliées. L’inspection des profils d’absorption ET d’émission de fluorescence UV-Vis a montré peu d’altérations caractéristiques dans les protéines contenant des analogues Pro. L’examen des profils cinétiques de repliement dans les variantes EGFP a montré un processus de repliement accéléré en présence de S-Flp, alors que le processus était similaire au type sauvage dans la protéine contenant du Dhp. Cette étude met en valeur la capacité de la méthode SPI à produire des modifications subtiles des résidus de protéines au niveau atomique (« chirurgie moléculaire »), qui peuvent être adoptées pour l’étude d’autres protéines d’intérêt. Il illustre les résultats des remplacements de proline avec des analogues chimiques proches sur les propriétés de repliement et spectroscopiques dans la classe des protéines fluorescentes à baril β.

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Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Pour surmonter les limites de la mutagénèse classique dirigée par site, des analogues de la proline avec des modifications spécifiques ont été incorporés dans plusieurs protéines fluorescentes. Nous montrons comment le remplacement de l’hydrogène par le fluor ou du simple par des liaisons doubles dans les résidus de proline (« chirurgie moléculaire ») affecte les propriétés fondamentales des protéines, y compris leur repliement et leur interaction avec la lumière.

Échange spécifique de résidus de proline par des analogues de proline dans des protéines fluorescentes: comment la « chirurgie moléculaire » de l’épine dorsale affecte le repliement et la stabilité

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

Dans la plupart des cas, la mutagénèse conventionnelle dirigée par site n’est pas appropriée pour étudier le rôle fonctionnel des prolines dans les protéines. Ici, nous présentons une méthode pour incorporer des analogues de la proline en tant qu’acides aminés non canoniques dans des protéines synthétisées ribosomiquement afin d’étudier le rôle des résidus de proline sur le repliement et la fonction des protéines. La substitution des prolines par des acides aminés standard est une approche risquée.L’incorporation d’analogues de la proline permet une sorte de chirurgie moléculaire. En d’autres termes, il introduit des changements moléculaires subtils pour influencer rationnellement et manipuler les propriétés des protéines. Étant donné que les résidus de proline jouent un rôle essentiel dans la stabilité des échafaudages protéiques, notre technologie pourrait être utile pour comprendre les raisons des déficits de repliement des protéines, qui sous-tendent certains états pathologiques chez l’homme.Les altérations protéiques induites par les remplacements de proline ont des implications pour l’ingénierie biotechnologique des enzymes et offrent des possibilités d’amélioration de la traduction ou du repliement des protéines ribosomiques. Cette méthode ne nécessite pas d’équipement spécial et d’instrumentation coûteuse. Des précautions particulières doivent être prises avec les étapes du protocole, dans lesquelles la proline native est épuisée à partir de cultures d’E. coli avant l’ajout d’analogues de la proline.Pour commencer la production des protéines fluorescentes avec de la proline native, inoculez 200 millilitres de milieu NMM frais dans une fiole d’Erlenmeyer de deux litres avec deux millilitres de la culture de nuit. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital à 220 tr / min pendant environ 3,5 heures. Pendant l’incubation, mesurez la densité optique à 600 nanomètres dans un spectrophotomètre toutes les 30 minutes.Lorsque la densité optique atteint 0,7, faites tourner la suspension de la cellule et décantez doucement le surnageant dans les déchets. Ensuite, lavez les cellules en les resusmettant dans 50 millilitres de NMM glacé sans aucun acide aminé ou de NMM sans proline. Faites tourner à nouveau les cellules et décantez le surnageant en déchets.Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule par pipetage doux dans 200 millilitres de NMM sans proline et complétée par de l’ampicilline dans une fiole d’Erlenmeyer de deux litres, et incuber les cellules dans un agitateur orbital pendant 30 minutes pour permettre l’épuisement complet de la proline. Après l’incubation, ajouter un volume approprié de L-proline ou des analogues de la proline à partir des solutions mères de 50 millimolaires pour obtenir une concentration finale d’un millimolaire dans la suspension cellulaire. Ensuite, induire l’expression de la protéine cible en ajoutant de l’IPTG 500 micromolaires à partir d’une solution mère à une molaire.Exprimez la protéine cible pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital et mesurez la densité optique le lendemain. Recueillir les cellules bactériennes par centrifugation et décanter le surnageant dans les déchets. Ensuite, lavez les cellules en pipetant soigneusement dans 50 millilitres de tampon de liaison contenant 10% de glycérol.Faites tourner à nouveau les cellules, décantez le surnageant et stockez la pastille cellulaire dans un tube de 50 millilitres à moins 20 ou 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Avant d’évaluer l’émission de fluorescence, effectuez une SDS-PAGE pour vous assurer que la pureté de l’échantillon est supérieure à 95 %Ensuite, ajustez les échantillons de chaque variante de protéine purifiée à une concentration de 0,3 micromoles, en prenant la valeur d’absorbance calculée à la longueur d’onde appropriée comme référence. Assurez-vous que le volume final approximatif de l’échantillon est de 200 microlitres.Laisser les échantillons dilués s’équilibrer à température ambiante. Après une heure, transférez les échantillons dans une cuvette de quartz d’un centimètre et mesurez le spectre d’émission de fluorescence des échantillons à l’aide d’un spectromètre de fluorescence. Pour induire la dénaturation, diluer vingt fois les échantillons de chaque variante de protéine en ajoutant les deux microlitres d’échantillons de 300 micromolaires à 18 microlitres de tampon PBS 1,11X contenant de l’urée 8,89 molaires et une TNT 5,56 millimolaires.Incuber les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, diluez les échantillons 100 fois en ajoutant 1 980 microlitres de PBS contenant une TNT de cinq millimolaires pour induire la renaturation et transférez immédiatement 200 microlitres des échantillons dans une cuvette de quartz d’un centimètre. Insérez la cuvette de quartz dans un spectromètre de fluorescence approprié et surveillez le repliement des protéines en acquérant un spectre de fluorescence toutes les trois secondes pendant 30 minutes.Transférez les échantillons de repli dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, puis fermez le couvercle et stockez les échantillons à température ambiante dans l’obscurité pour permettre un repliement complet des variantes EGFP. Après 24 heures, mesurez l’émission de fluorescence des échantillons de protéines repliés en utilisant la même longueur d’onde d’excitation qu’auparavant pour capturer le point final temporel de la récupération de fluorescence. Les granulés de cellules exprimant des protéines natives et de variantes contenant de la S-fluoroproline et de la déshydroproline avaient une couleur vive typique en raison du chromophore intact.En revanche, les variantes contenant de la R-fluoroproline et de la difluoroproline sont restées incolores, indiquant un mauvais repliement et un dépôt de protéines dépliées dans les corps d’inclusion. L’analyse SDS-PAGE a vérifié la présence de protéines insolubles contenant de la R-fluoroproline. En revanche, des protéines natives et des variantes contenant de la S-fluoroproline et de la déshydroproline ont été trouvées dans les fractions solubles.Dans l’analyse par chromatographie liquide/spectrométrie de masse, chaque remplacement de la proline par la S-fluoroproline a produit un décalage positif de 18 dalton par résidu de proline, tandis que le remplacement par la déshydroproline a produit un décalage négatif de deux daltons par résidu. Dans les spectres d’absorption et d’émission de lumière, l’absorbance des chromophores a été trouvée à 488 nanomètres pour EGFP et à 493 nanomètres pour NowGFP. Dans KillerOrange, la région d’absorbance du chromophore comprenait deux bandes correspondant à deux états de configuration et de charge possibles du chromophore complexe.En outre, les spectres de fluorescence enregistrés lors de l’excitation aux longueurs d’onde d’absorbance maximale correspondantes impliquaient que les analogues ne modifiaient pas l’environnement chimique des chromophores. Dans les expériences de repliement, la fluorescence native du chromophore EGFP s’est partiellement rétablie, bien que la fluorescence spécifique au tryptophane ait été plus grande après la renaturation. Un comportement similaire a été observé pour la variante contenant de la déshydroproline.Dans la S-fluoroproline contenant de l’EGFP, un résultat similaire a été observé avec une excitation de 295 nanomètres, tandis que la fluorescence s’est rétablie dans une mesure beaucoup plus élevée à 488 nanomètres. Seules les variantes egFP ont montré une cinétique de repliement rapide, la récupération de l’émission de tryptophane étant deux fois plus rapide que l’émission de chromophore. Des cultures bactériennes fraîches avec des milieux de croissance appropriés doivent être utilisées.Les techniques stériles et le suivi régulier de la croissance de la culture sont également des conditions préalables importantes au succès de l’expérience. Cette méthode est applicable à l’ingénierie des protéines, car elle permet d’étudier le rôle d’autres acides aminés canoniques. Pour cela, des souches d’E. coli auxotrophes appropriées et des analogues d’acides aminés sont nécessaires.La spectrométrie de masse de protéines entières est nécessaire comme preuve analytique pour confirmer l’incorporation d’analogues d’acides aminés non canoniques. La méthode SPI pour incorporer des analogues de la proline nous permet de manipuler directement l’épine dorsale des protéines et offre des avantages pour une conception rationnelle et une production facilitée de protéines grâce à la stabilisation globale et à l’amélioration de la traduction ou du repliement ribosomique.

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