Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster "Unifying Systems in Catalysis") zu T.F. und N.B. und vom Bundesministerium für Bildung und Wissenschaft (BMBF-Programm "HSP 2020", TU-WIMIplus-Projekt SynTUBio) an F.-J.S. und T.M.T.T.

Die Autoren legen alle Interessenkonflikte offen.

In der Natur treten typischerweise Manipulationen mit Proteinstrukturen und -funktionen aufgrund von Mutationen auf, dem Phänomen, das zu einem Austausch einer Aminosäureidentität an bestimmten Positionen in der Proteinsequenz führt. Dieser natürliche Mechanismus wird weithin als biotechnologische Methode für das Protein-Engineering in Form von Mutagenese angewendet und stützt sich auf das Repertoire der 20 kanonischen Aminosäuren, die an dem Prozess beteiligt sind. Der Austausch von Prolinresten ist jedoch problematisch. Aufgrund seiner speziellen Backbone-Gruppenarchitektur ist es kaum austauschbar mit den verbleibenden 19 Rückständen für den Ersatz72. Zum Beispiel ist Prolin typischerweise als sekundärer Strukturbrecher in Polypeptidsequenzen bekannt, da es schlecht mit den häufigsten Sekundärstrukturen, d.h. α-Helix und β-Stränge, kompatibel ist. Diese Prolin-Eigenschaft geht leicht verloren, wenn der Rest zu einer anderen Aminosäure aus dem gemeinsamen Repertoire mutiert wird. Der Ersatz von Prolin durch seine chemischen Analoga bietet einen alternativen Ansatz, der es ermöglicht, die grundlegenden Rückgratmerkmale des Elternprolinrests beizubehalten, während er seine spezifischen Konformationsübergänge verzerrt oder Modulationen des molekularen Volumens und der Polarität erzeugt. Beispielsweise ist es möglich, Bakterienkulturen mit analogen Strukturen wie Hydroxy-, Fluor-, Alkyl-, Dehydroprolinen, Strukturen mit variablen Ringgrößen und mehr zu versorgen und so die Produktion eines Proteins zu erleichtern, das spezifische Prolinrestveränderungen enthält.
Die in dieser Studie beschriebene SPI-Methode (Selective Pressure Incorporation) ermöglicht einen globalen, d.h. rückstandsspezifischen Ersatz aller Proline im Zielprotein durch verwandte chemische Analoga. Die Bedeutung der Methode spiegelt sich in der Tatsache wider, dass SPI die Erstellung von Sequenzänderungen ermöglicht, die für gängige Mutagenesetechniken unzugänglich sind. Zum Beispiel ermöglicht es die Produktion eines Zielproteins, das eher kleine strukturelle Veränderungen enthält, die typischerweise einen oder zwei Atomersatz / -deletionen / -zusätze nicht überschreiten können, wie in dieser Studie gezeigt. Solche Proteinmodifikationen werden als "atomare Mutationen" bezeichnet73,74. In einem fluoreszierenden Protein wie GFP kann das Ergebnis dieses molekularen Eindringens in der Faltungsgeschwindigkeit, den lokalen Polaritäten, der Proteinpackung und der Stabilität der beteiligten Strukturmerkmale gesehen werden. Die Veränderungen der Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften werden indirekt durch den Einfluss auf Proteinfaltungs- und Rückstandsmikroumgebungen erzeugt. Die Präzision der molekularen Veränderungen, die von SPI durchgeführt werden, ist typischerweise viel höher als bei Mutationen von Prolinen zu anderen kanonischen Resten, wobei letztere typischerweise schädlich für die Proteinfaltung, -produktion und -isolierung sind.
Als Produktionsmethode nutzt der SPI-Ansatz die Substrattoleranz der Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Tasche gegenüber chemischen Analoga der nativen Aminosäure. Die Synthetase ist für die korrekte Identifizierung der Aminosäurestruktur verantwortlich, während der Einbau in Proteine nachgelagert im Translationsprozess erfolgt. Instrumentell werden die Proteinproduktion, -isolierung und -reinigung in SPI in einer Weise durchgeführt, die für alle anderen rekombinanten Proteinexpressionstechniken typisch ist. Mit einigen Ergänzungen des Protokolls jedoch wie folgt: Prolin, das zum Ersatz bestimmt ist, wird zu Beginn des Fermentationsprozesses bereitgestellt, so dass die Zellen wachsen und ihre intakte Zellmaschinerie entwickeln können. Die Zellkultur darf jedoch nicht die maximale optische Dichte erreichen, um die Zellen in der logarithmischen Phase optimal für die Proteinexpression zu halten. Es gibt zwei Hauptvariationen der SPI-Methode an dieser Stelle. In der ersten wird die Konzentration von Prolin im anfänglichen Wachstumsmedium (einem chemisch definierten Medium) so eingestellt, dass die Erschöpfung von Prolin ohne äußeres Eindringen erfolgt. Die Zellen erschöpfen Prolin im Medium, bevor sie die logarithmische Wachstumsphase verlassen können, und anschließend wird das Analogon hinzugefügt und die Produktion des interessierenden Proteins induziert. In der zweiten Version der Methode werden die Zellen in dem Prolin-haltigen Medium bis zur Mitte ihrer logarithmischen Phase gezüchtet. An dieser Stelle sollten die Zellen herausgenommen und physisch in ein anderes Medium übertragen werden, das nicht mehr Prolin, sondern nur das Analogon enthält, mit anschließender Induktion des interessierenden Proteins. In beiden Versionen werden das analoge und das Proteininduktionsreagenz den vorgezüchteten Zellen zur Verfügung gestellt. Die Isolierung und Aufreinigung des Wildtyp-Proteins erfolgt auf die gleiche Weise wie bei den Varianten. Prinzipiell kann jede verfügbare Pro-auxotrophe Sorte als Ausdruckshost verwendet werden. Dennoch sind Ausdruckstests ratsam, um den am besten geeigneten Host zu identifizieren. Auch Tests verschiedener chemisch definierter Medien können verwendet werden, um die Proteinausbeute zu optimieren.
Es gibt bestimmte Anforderungen an die chemischen Analoga, die für SPI berücksichtigt werden müssen, wie Löslichkeit und Konzentration. Die metabolische Verfügbarkeit und Aufnahme von Aminosäuren hängt von der Anzahl der gelösten Moleküle im Medium ab. Um die Löslichkeit einer bestimmten Verbindung zu erhöhen, können leicht saure oder alkalische Bedingungen gewählt werden. Da die künstlichen Moleküle aufgrund ihrer Zelltoxizität wachstumshemmende Wirkungen hervorrufen können, sollte die Konzentration auf ein Minimum gesenkt werden, um Zellstresszu vermeiden 75.
Eine kleine Schwäche von SPI ist die Abnahme der Inkorporationseffizienz mit einer größeren Anzahl von Positionen, die ausgetauscht werden müssen. Prinzipiell kann eine Reduktion der Aminosäurefrequenz innerhalb des Zielbiomoleküls durch ortsgerichtete Mutagenese dieses Problem lösen. Die strukturellen und funktionellen Eigenschaften eines gewünschten Proteins können jedoch durch die Veränderung der Primärstruktur beeinflusst werden.
Wie bereits erwähnt, ermöglicht SPI einen rückstandsspezifischen Ersatz der kanonischen Aminosäure. Dies bedeutet, dass nicht-kanonische Aminosäuren in jede Position der kanonischen Aminosäure innerhalb des Zielproteins eingefügt werden, einschließlich konservierter Rückstände, die für die Proteinfunktion oder -faltung unerlässlich sind. Alternative Methoden zur standortspezifischen Einbindung sind die einzige Möglichkeit, dieses Problemzu überwinden 3. In den letzten Jahrzehnten wurde die orthogonale Paarmethode entwickelt, die Proteine mit modifizierten Resten an vordefinierten Stellen herstellen kann. Die häufigste Modifikation dieser Methode wird als Stop-Codon-Unterdrückung bezeichnet. Diese Methode basiert auf einem entwickelten orthogonalen Translationssystem für die ortsspezifische Einarbeitung synthetischer Aminosäuren76. Mehr als 200 Aminosäuren mit unterschiedlichen Seitenkettenmodifikationen wurden bisher mit diesem Ansatz in Proteine eingebaut77. Diese Translationssysteme sind jedoch immer noch nicht für die Insertion von Prolinanaloga in Zielproteine geeignet. Darüber hinaus wird die Leistung der Methode bei geringfügigen Aminosäuremodifikationen als gering angesehen, da eine gewisse Hintergrundpromiskuität der Aminoacyl-tRNA-Synthetase typischerweise in den technischen Translationssystemen verbleibt.
Mit SPI produzierten wir eine Reihe von β-Barrel-fluoreszierenden Proteinvarianten und untersuchten die Ergebnisse des Austauschs von Prolin mit seinen unnatürlichen Analoga. Im Falle des Prolinersatzes mit R-Flp und Dfp wurde vom Expressionswirt ein dysfunktionales Protein produziert. Der Effekt wird wahrscheinlich durch eine Fehlfaltung von Proteinen hervorgerufen. Letzteres könnte von der von R-Flp geförderten C4-Exo-Konformation herrühren,die von den Elternproteinstrukturenungünstig ist 27. Bei Dfp wird die Fehlfaltung wahrscheinlich durch die verminderte Geschwindigkeit der Trans-to-cis-Peptidbindungsisomerisierung am Prolinrest27 erzeugt. Letzteres gehört bekanntermaßen zu den begrenzenden Schritten im kinetischen Profil der Proteinfaltung, die die β-Barrel-Bildung und die anschließende Chromophorreifung beeinflusst. Tatsächlich führte die Proteinproduktion für beide Aminosäuren, R-Flp und Dfp, zu einem aggregierten und unlöslichen Protein. Folglich konnte keine Chromophorbildung stattfinden, und die Fluoreszenz ging vollständig verloren. Bei S-Flp und Dhp wurde jedoch die richtige Proteinreifung beobachtet, was zu fluoreszierenden Proteinproben für jede Analog/Protein-Kombination führte. Trotz einiger Modulationen der Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften des Proteins blieben diese weitgehend denen der Wildtypproteine ähnlich. Die Wirkung der Aminosäuresubstitution wurde in den Refolding-Kinetik-Studien aufgedeckt. Letzteres zeigte eine schnellere Umfaltung im Falle eines Ersatzes mit S-Flp. Modellstudien haben gezeigt, dass dieser Rückstand eine gewisse Verbesserung der Trans-to-cis-Amid-Rotationsgeschwindigkeit bewirken und zur Bildung der C4-Endo-Konformation führen kann. Beide Faktoren werden wahrscheinlich zu den positiven kinetischen Effekten dieses Rückstands in EGFP beitragen. Im Gegensatz dazu produzierte Dhp kinetische Faltungsprofile, die dem Mutterprotein maximal ähnlich waren. Die Vielfalt der Ergebnisse, die durch rein atomare Mutationen in den untersuchten fluoreszierenden Proteinen erzeugt werden, veranschaulicht das Potenzial der SPI-Produktionsmethode bei der Veränderung der Zielproteineigenschaften. Die Proteinveränderungen, die durch Prolinersatz mit den Analoga induziert werden, haben weitere Auswirkungen auf das Engineering der Enzyme78,79,80 und der Ionenkanäle81,82 sowie auf das allgemeine Engineering der Proteinstabilität.
Die grundlegende Einschränkung der SPI-Methode ist ihr "Alles-oder-Keine" -Modus beim Austausch von Prolin-Residenzen mit verwandten Analoga. Es wäre von großem Vorteil, genau auswählen zu können, welche Prolinreste durch die Analoga ersetzt werden sollen und welche unverändert bleiben sollen. Derzeit gibt es jedoch keine Technik, die eine so ausgeklügelte Produktion mit einem mikrobiellen Produktionswirt durchführen könnte. Die chemische Synthese der Proteine 83,84 sowie die zellfreie Produktion85,86 sind die beiden alternativen Methoden, die positionsspezifische Prolinmodifikationen erzeugen können. Dennoch sind sie aufgrund ihrer operativen Komplexität und geringen Produktionsausbeute im Vergleich zur Produktion in lebenden Zellen unterlegen. Bis jetzt bleibt SPI der operationell einfachste und robusteste Ansatz für die Herstellung komplexer Proteine mit atomaren Mutationen. Durch die Einführung unnatürlicher Aminosäureersatzstoffe erlaubt die Methode, Proteineigenschaften gezielt zu modifizieren, wie dies hier durch Veränderungen in der Faltung und Lichtabsorption/-emission von fluoreszierenden Proteinen, die durch Prolinersatz erzeugt werden, veranschaulicht wird.

Die klassische ortsgesteuerte Mutagenese ermöglicht die Permutation jeder existierenden genkodierten Proteinsequenz durch Codon-Manipulation auf DNA-Ebene. Um die Proteinfaltung und -stabilität zu untersuchen, ist es oft wünschenswert, ähnliche Aminosäuren durch ähnliche Gegenstücke zu ersetzen. Die traditionelle Proteinmutagenese beschränkt sich jedoch definitiv auf strukturell ähnliche Ersatzstoffe unter kanonischen Aminosäuren wie Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, die im genetischen Standardcode-Repertoire vorhanden sind. Auf der anderen Seite gibt es keine solchen Möglichkeiten für andere kanonische Aminosäuren wie Trp, Met, His oder Pro, die in Proteinen oft eine wesentliche strukturelle und funktionelle Rolle spielen1. Ein idealer Ansatz, um diese Wechselwirkungen im Kontext der hochspezifischen inneren Architektur von Proteinen und ihres Faltungsprozesses zu untersuchen, besteht darin, nicht-disruptive isosterische Modifikationen zu erzeugen. In der Tat, wenn isosterische Aminosäureanaloga dieser kanonischen Aminosäuren, auch bekannt als nicht-kanonische Aminosäuren (ncAAs), in Proteine eingefügt werden, ermöglichen sie subtile Veränderungen sogar auf der Ebene einzelner Atome oder Atomgruppen wie H / F, CH 2 / S / Se / Te, die als "atomare Mutationen" bekannt sind2. Eine solche "molekulare Chirurgie" erzeugt veränderte Proteine, deren Eigenschaften ausschließlich aus dem Austausch einzelner Atome oder Gruppen von Atomen resultieren, die in günstigen Fällen analysiert und die nachgewiesenen Veränderungen rationalisiert werden können. Auf diese Weise wird der Umfang der Proteinsynthese zur Untersuchung der Proteinfaltung und -struktur weit über die klassische DNA-Mutagenese hinaus erweitert. Beachten Sie, dass Proteine, die durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt werden, normalerweise als "Mutanten" bezeichnet werden, während Proteine mit substituierten kanonischen Aminosäuren als "Varianten" 3, "Alloproteine"4 oder "Proteinkongenere"5 bezeichnet werden.
Das grün fluoreszierende Protein (GFP), das erstmals im Meeresorganismus Aequorea victoria identifiziert wurde, zeigt eine hellgrüne Fluoreszenz, wenn es ultraviolettem bis blauem Licht ausgesetztwird 6,7. GFP wird heute häufig als hochempfindliches Markierungswerkzeug zur routinemäßigen Visualisierung der Genexpression und Proteinlokalisation in Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. GFP hat sich auch in verschiedenen biophysikalischen 8,9,10- und biomedizinischen 11,12-Studien sowie im Protein-Engineering 13,14,15 als nützlich erwiesen. Die rigorose Analyse der GFP-Struktur ermöglichte die Erstellung zahlreicher Varianten, die sich durch unterschiedliche Stabilität und Fluoreszenzhöchstwerte16,17 auszeichnen. Die meisten GFP-Varianten, die in der Zell- und Molekularbiologie verwendet werden, sind monomere Proteine sowohl in Lösung als auch im Kristall18. Ihre strukturelle Hauptorganisation ist unabhängig von ihrer phylogenetischen Herkunft typisch für alle Mitglieder der GFP-Familie und besteht aus 11 β-Strängen, die ein sogenanntes β-Fass bilden, während eine geknickte α-Helix durch die Mitte des Fasses verläuft und das Chromophor trägt (Abbildung 1A). Die autokatalytische Reifung des Chromophors (Abbildung 1B) erfordert die präzise Positionierung der ihn umgebenden Seitenketten an der zentralen Stelle des Proteins; Viele dieser Seitenketten sind in anderen GFP-Variantenstark erhalten 19. In den meisten fluoreszierenden Proteinen von Quallen wie Aequorea victoria besteht das grün emittierende Chromophor aus zwei aromatischen Ringen, darunter ein Phenolring von Tyr66 und die fünfgliedrige heterocyclische Struktur von Imidazolinon (Abbildung 1B). Das Chromophor ist, wenn es richtig in die Proteinmatrix eingebettet ist, für die charakteristische Fluoreszenz des gesamten Proteins verantwortlich. Es befindet sich in der Mitte der Struktur, während die Fassstruktur es vom wässrigen Medium20 isoliert. Die Exposition des Chromophors gegenüber dem Massenwasser würde zu einer Fluoreszenzlöschung führen, d. h. zu einem Verlust der Fluoreszenz21.
Die richtige Faltung der tonnenartigen Struktur ist für den Schutz des Chromophors vor Fluoreszenzlöschungunerlässlich 22. Prolin (Pro)-Rückstände spielen eine besondere Rolle bei der strukturellen Organisation von GFP23. Da sie nicht in der Lage sind, einen β-Strang zu unterstützen, bilden sie Verbindungsschleifen, die für die Aufrechterhaltung der Proteinstruktur als Ganzes verantwortlich sind. Es überrascht nicht, dass 10-15 Prolinreste sowohl in Aequorea- als auch in Anthoathecata-abgeleiteten GFPs gefunden werden; Einige von ihnen sind in anderen Arten von fluoreszierenden β-Barrel-Proteinen stark konserviert. Es wird erwartet, dass Proline aufgrund ihrer besonderen geometrischen Eigenschaften die Falteigenschaften entscheidend beeinflussen. Zum Beispiel bilden in Aequorea-abgeleiteten GFPs von den zehn Prolinresten (Abbildung 2A) neun Trans- und nur einer bildet eine cis-Peptidbindung (Pro89). Pro58 ist essentiell, d.h. nicht austauschbar mit dem Rest der 19 kanonischen Aminosäuren. Dieser Rückstand könnte für die korrekte Positionierung des Trp57-Rückstands verantwortlich sein, von dem berichtet wurde, dass er für die Chromophorreifung und die gesamte GFP-Faltungentscheidend ist 24. Das Fragment PVPWP mit drei Prolinresten (Pro54, Pro56, Pro58) und Trp57 ist der wesentliche Teil des "unteren Deckels" in der GFP-Struktur aus Abbildung 1A. Das PVPWP-Strukturmotiv findet sich in mehreren Proteinen wie Cytochromen und eukaryotischen spannungsaktivierten Kaliumkanälen25. Prolin-zu-Alanin-Substitutionen an den Positionen 75 und 89 sind auch schädlich für die Proteinexpression und -faltung und schaffen die Chromophorreifung ab. Pro75 und Pro89 sind Teil des "oberen Deckels", der den Chromophor vergräbt (Abbildung 1A) und sind über 11-strängige β-Barrel-fluoreszierende Proteinekonserviert 23. Diese beiden "Deckel" halten das Chromophor vom wässrigen Lösungsmittel ausgeschlossen, auch wenn die stabile tertiäre Struktur teilweise gebrochen wurde26. Eine solche spezifische molekulare Architektur schützt das Fluorophor vor kollisionaler (dynamischer) Fluoreszenzlöschung, z. B. durch Wasser, Sauerstoff oder andere diffusible Liganden.
Um molekulares Engineering der GFP-Struktur durchzuführen, sollte man Aminosäuresubstitutionen in der Primärstruktur des Proteins einführen. An GFP wurden zahlreiche Mutationen durchgeführt, die Varianten mit erhöhter Stabilität, schneller und zuverlässiger Faltung und variablen Fluoreszenzeigenschaftenverleihen 17. Dennoch wird in den meisten Fällen die Mutation von Prolinresten als riskanter Ansatz angesehen, da keine der verbleibenden 19 kanonischen Aminosäuren das Konformationsprofil des Prolinrests27 ordnungsgemäß wiederherstellen kann. So wurde ein alternativer Ansatz entwickelt, bei dem Prolinreste durch andere Prolin-basierte Strukturen ersetzt werden, die als Prolin-Analoga28 bezeichnet werden. Aufgrund seiner einzigartigen zyklischen chemischen Struktur weist Prolin zwei charakteristische Konformationsübergänge auf (Abbildung 1C): 1) das Prolin-Ring-Puckering, ein schneller Prozess, der die Organisation des Rückgrats mit sich bringt, der in erster Linie den φ Torsionswinkel beeinflusst, und 2) die Peptidbindung cis / trans-Isomerisierung, ein langsamer Prozess, der die Rückgratfaltung über die ω-Torsionswinkel beeinflusst. Aufgrund seiner langsamen Natur ist der letztere Übergang häufig für die geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte im Faltungsprozess des gesamten Proteins verantwortlich. Es wurde bereits gezeigt, dass die Peptidbindung cis/trans-Isomerisierung um einige Prolinreste langsame Schritte bei der Faltung von GFP-Varianten aufweist. Zum Beispiel zeigt die Bildung der cis-Peptid-Bindung bei Pro89 den langsamen Schritt im Prozess der Faltung, da sie auf dem Bindungsübergang von trans zu cis29 beruht. Eine schnellere Rückfaltung kann erreicht werden, nachdem Pro89 durch eine All-Trans-Peptid-Schleife ersetzt wurde, d.h. durch Abschaffung eines cis-zu-trans-Isomerisierungsereignisses30. Zusätzlich zur cis/trans-Isomerisierung können die Pucker-Übergänge aufgrund der Rückgratorganisation und -packung im Proteininneren auch tiefgreifende Veränderungen in der Proteinfaltung hervorrufen 27,31.
Chemische Modifikationen führen zu einer Veränderung der intrinsischen Konformationsübergänge der Prolinreste, wodurch die Faltungsfähigkeit des Proteins beeinträchtigt wird. Bestimmte Prolinanaloga sind besonders attraktive Kandidaten für die Prolinsubstitution in Proteinen, da sie die Manipulation und Untersuchung der Faltungseigenschaften ermöglichen. Zum Beispiel sind (4R)-Fluorprolin (R-Flp), (4S)-Fluorprolin (S-Flp), 4,4-Difluorprolin (Dfp) und 3,4-Dehydroprolin (Dhp) vier Analoga (Abbildung 1D), die sich sowohl in Bezug auf das Molekülvolumen als auch auf die Polarität minimal von Prolin unterscheiden32. Gleichzeitig weist jedes Analogon ein ausgeprägtes Ring-Puckering auf: S-Flp stabilisiert den C-4-Endo-Pucker, R-Flp stabilisiert den C-4-Exo-Pucker, Dfp zeigt keine offensichtliche Pucker-Präferenz, während Dhp das Puckering abschafft (Abbildung 1D)33. Durch die Verwendung dieser Analoga in der Proteinstruktur kann man mit dem Konformationsübergang der Prolinreste manipulieren und damit die Eigenschaften der resultierenden GFP-Varianten beeinflussen.
In dieser Arbeit haben wir uns vorgenommen, den vorgesehenen Satz von Prolinanaloga (Abbildung 1D) mit Hilfe der selektiven Druckeinbaumethode (SPI, Abbildung 3)34 in die Struktur von GFP-Varianten zu integrieren. Der Ersatz von Aminosäureresten durch ihre nächsten isostrukturellen Analoga ist ein angewandtes biotechnologisches Konzept im Proteindesign35,36. Somit veranschaulichen die Wirkungen von Prolinanaloga in einem Modellprotein ihr Potenzial, als Werkzeuge im Protein-Engineeringzu dienen 37. Die Herstellung von Proteinen, die gewünschte Analoga enthalten, wurde in modifizierten E. coli-Stämmen durchgeführt, die nicht in der Lage sind, Prolin zu produzieren (Prolin-Auxotrophie). So könnten sie gezwungen sein, den Ersatz von Substraten im Prozess der Proteinbiosynthesezu akzeptieren 38. Diese globale Substitution von Prolin wird durch die natürliche Substratflexibilität der endogenen Aminoacyl-tRNA-Synthetasen39 ermöglicht, deren Schlüsselenzyme die Veresterung von tRNAs mit geeigneten Aminosäurenkatalysieren 40. Im Allgemeinen, wie in Abbildung 3 dargestellt, wird das Zellwachstum in einem definierten Medium durchgeführt, bis die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht ist. Im nächsten Schritt wird die zu ersetzende Aminosäure während der Fermentation intrazellulär aus dem Expressionssystem abgebaut und anschließend durch das gewünschte Analogon oder ncAA ausgetauscht. Die Zielproteinexpression wird dann für die restspezifische nicht-kanonische Aminosäureinkorporation induziert. Die Substitution der verwandten Aminosäure durch ihr Analogon erfolgt proteomweit. Obwohl sich diese Nebenwirkung negativ auf das Wachstum des Wirtsstamms auswirken kann, wird die Qualität der Zielproteinproduktion meist nicht beeinträchtigt, da bei der rekombinanten Expression die zellulären Ressourcen hauptsächlich auf die Produktion des Zielproteins41,42 gerichtet sind. Daher sind ein streng reguliertes, induzierbares Expressionssystem und starke Promotoren entscheidend für eine hohe Einarbeitungseffizienz43. Unser Ansatz basiert auf der multiplen restspezifischen Einarbeitung von ncAAs als Reaktion auf Sense-Codons (Sense-Codon-Reassignment), wobei innerhalb des Zielgens die Anzahl der Positionen für die Pro-Analog-Insertion über die ortsgerichtete Mutagenese44 manipuliert werden kann. Ein ähnlicher Ansatz wurde in unserem vorherigen Bericht über die Herstellung von rekombinanten Peptiden mit antimikrobiellen Eigenschaften45 angewendet. In dieser Arbeit haben wir die SPI-Methode angewendet, die es ermöglicht, alle Prolinreste durch verwandte Analoga zu ersetzen, um Proteine zu erzeugen, von denen erwartet wird, dass sie unterschiedliche physikalisch-chemische Eigenschaften besitzen, die in Proteinen, die mit dem kanonischen Aminosäurerepertoire synthetisiert werden, nicht vorhanden sind. Durch die Charakterisierung des Faltungs- und Fluoreszenzprofils der resultierenden Varianten wollen wir die Auswirkungen atomarer Substitutionen in Varianten von GFP aufzeigen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

Der Ersatz von Prolin(Pro)-Resten in Proteinen durch die traditionelle ortsgerichtete Mutagenese durch eine der verbleibenden 19 kanonischen Aminosäuren ist oft schädlich für die Proteinfaltung und insbesondere die Chromophorreifung in grün fluoreszierenden Proteinen und verwandten Varianten. Eine vernünftige Alternative besteht darin, die Translation des Proteins so zu manipulieren, dass alle Pro-Reste restspezifisch durch Analoga ersetzt werden, eine Methode, die als selektiver Druckeinbau (SPI) bekannt ist. Die eingebauten chemischen Modifikationen können als eine Art "molekulare Chirurgie" genutzt werden, um messbare Veränderungen fein zu sezieren oder sogar verschiedene Proteineigenschaften rational zu manipulieren. Hier zeigt die Studie die Nützlichkeit der SPI-Methode, um die Rolle von Prolinen bei der Organisation der typischen β-Barrel-Struktur von spektralen Varianten des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) mit 10-15 Prolinen in ihrer Sequenz zu untersuchen: Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), NowGFP und KillerOrange. Pro-Rückstände liegen in Verbindungsabschnitten zwischen einzelnen β-Strängen vor und bilden die Schließdeckel des Fassgerüsts, so dass sie für die Isolierung des Chromophors von Wasser, d.h. die Fluoreszenzeigenschaften, verantwortlich sind. Selektivdruck-Inkorporationsexperimente mit (4 R)-Fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluorprolin (S-Flp), 4,4-Difluorprolin (Dfp) und 3,4-Dehydroprolin (Dhp) wurden unter Verwendung eines Prolin-auxotrophen E. coli-Stammes als Expressionshost durchgeführt. Wir fanden heraus, dass fluoreszierende Proteine mit S-Flp und Dhp aktiv sind (d.h. fluoreszierend), während die anderen beiden Analoga (Dfp und R-Flp) dysfunktionale, fehlgefaltete Proteine produzierten. Die Untersuchung von UV-Vis-Absorptions- und Fluoreszenzemissionsprofilen zeigte nur wenige charakteristische Veränderungen in den Proteinen, die Pro-Analoga enthielten. Die Untersuchung der faltkinetischen Profile in EGFP-Varianten zeigte einen beschleunigten Refaltungsprozess in Gegenwart von S-Flp, während der Prozess dem Wildtyp in dem Protein ähnelte, das Dhp enthielt. Diese Studie zeigt die Fähigkeit der SPI-Methode, subtile Modifikationen von Proteinresten auf atomarer Ebene zu erzeugen ("molekulare Chirurgie"), die für die Untersuchung anderer Proteine von Interesse übernommen werden können. Es veranschaulicht die Ergebnisse des Prolinersatzes mit engen chemischen Analoga auf die faltenden und spektroskopischen Eigenschaften in der Klasse der β-Barrel-fluoreszierenden Proteine.

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Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Um die Einschränkungen der klassischen ortsgesteuerten Mutagenese zu überwinden, wurden Prolinanaloga mit spezifischen Modifikationen in mehrere fluoreszierende Proteine eingebaut. Wir zeigen, wie sich der Ersatz von Wasserstoff durch Fluor oder des Einzelnen durch Doppelbindungen in Prolinresten ("molekulare Chirurgie") auf grundlegende Proteineigenschaften auswirkt, einschließlich ihrer Faltung und Wechselwirkung mit Licht.

Rückstandsspezifischer Austausch von Prolin durch Prolinanaloga in fluoreszierenden Proteinen: Wie die "molekulare Chirurgie" des Rückgrats die Faltung und Stabilität beeinflusst

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

In den meisten Fällen ist die konventionelle ortsgerichtete Mutagenese nicht geeignet, die funktionelle Rolle von Prolinen in Proteinen zu untersuchen. Hier stellen wir eine Methode vor, um Prolinanaloga als nicht-kanonische Aminosäuren in ribosomal synthetisierte Proteine zu integrieren, um die Rolle von Prolinresten auf die Proteinfaltung und -funktion zu untersuchen. Die Substitution von Prolinen durch Standard-Aminosäuren ist ein riskanter Ansatz.Der Einbau von Prolin-Analoga erlaubt eine Art molekulare Chirurgie. Mit anderen Worten, es führt subtile molekulare Veränderungen ein, um Proteineigenschaften rational zu beeinflussen und zu manipulieren. Da Prolinreste eine wesentliche Rolle für die Stabilität von Proteingerüsten spielen, könnte unsere Technologie hilfreich sein, um die Gründe für Proteinfaltungsdefizite zu verstehen, die bestimmten pathologischen Zuständen beim Menschen zugrunde liegen.Die durch Prolinersatz induzierten Proteinveränderungen haben Auswirkungen auf die biotechnologische Entwicklung von Enzymen und bieten Möglichkeiten zur Verbesserung der ribosomalen Proteintranslation oder -faltung. Diese Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und teure Instrumentierung. Besondere Vorsicht ist geboten bei Protokollschritten, bei denen natives Prolin vor der Zugabe von Prolinanaloga aus E.coli-Kulturen erschöpft wird.Um mit der Herstellung der fluoreszierenden Proteine mit nativem Prolin zu beginnen, impfen Sie 200 Milliliter frisches NMM-Medium in einem Zwei-Liter-Erlenmeyerkolben mit zwei Millilitern der Nachtkultur. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalschüttler bei 220 U / min für ca. 3,5 Stunden. Messen Sie während der Inkubation alle 30 Minuten die optische Dichte bei 600 Nanometern in einem Spektralphotometer.Wenn die optische Dichte 0,7 erreicht, drehen Sie die Zellsuspension herunter und dekantieren Sie den Überstand vorsichtig zu Abfall. Waschen Sie dann die Zellen, indem Sie 50 Milliliter eiskaltes NMM ohne Aminosäuren oder NMM ohne Prolin resuspendieren. Drehen Sie die Zellen erneut und dekantieren Sie den Überstand zu Abfall.Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet durch sanftes Pipettieren in 200 Milliliter NMM ohne Prolin und ergänzt mit Ampicillin in einem Zwei-Liter-Erlenmeyerkolben und inkubieren Sie die Zellen in einem Orbitalschüttler für 30 Minuten, um die vollständige Erschöpfung von Prolin zu ermöglichen. Nach der Inkubation fügen Sie ein geeignetes Volumen entweder L-Prolin oder der Prolinanaloga aus den 50-Millimol-Stammlösungen hinzu, um eine einmillimolare Endkonzentration in der Zellsuspension zu erhalten. Als nächstes induzieren Sie die Zielproteinexpression durch Zugabe von 500-mikromolärem IPTG aus einer einmolaren Stammlösung.Drücken Sie das Zielprotein über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalshaker aus und messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte. Sammeln Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation und dekantieren Sie den Überstand zu Abfall. Dann waschen Sie die Zellen durch sorgfältiges Pipettieren in 50 Milliliter Bindungspuffer, der 10% Glycerin enthält.Drehen Sie die Zellen erneut, dekantieren Sie den Überstand und lagern Sie das Zellpellet in einem 50-Milliliter-Röhrchen bei minus 20 oder 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Bevor Sie die Fluoreszenzemission auswerten, führen Sie eine SDS-PAGE durch, um sicherzustellen, dass die Probenreinheit über 95% liegtDann passen Sie die Proben jeder gereinigten Proteinvariante auf eine Konzentration von 0,3 Mikromol an und nehmen Sie den berechneten Absorptionswert bei der entsprechenden Wellenlänge als Referenz. Stellen Sie sicher, dass das ungefähre endgültige Probenvolumen 200 Mikroliter beträgt.Lassen Sie die verdünnten Proben bei Raumtemperatur ausgleichen. Nach einer Stunde geben Sie die Proben in eine einen Zentimeter große Quarzküvette und messen das Fluoreszenzemissionsspektrum der Proben mit einem Fluoreszenzspektrometer. Um eine Denaturierung zu induzieren, verdünnen Sie die Proben jeder Proteinvariante um das Zwanzigfache, indem Sie die zwei Mikroliter 300-Mikromolaren Proben zu 18 Mikrolitern 1,11-fachem PBS-Puffer mit 8,89-molarem Harnstoff und 5,56-Millimolar-DTT hinzufügen.Inkubieren Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Verdünnen Sie dann die Proben um das 100-fache, indem Sie 1.980 Mikroliter PBS mit fünf-millimolärem DVB-t hinzufügen, um eine Renaturierung zu induzieren, und übertragen Sie sofort 200 Mikroliter der Proben in eine einen Zentimeter große Quarzküvette. Setzen Sie die Quarzküvette in ein geeignetes Fluoreszenzspektrometer ein und überwachen Sie die Proteinfaltung, indem Sie alle drei Sekunden über 30 Minuten ein Fluoreszenzspektrum erfassen.Die nachgefalteten Proben in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, dann den Deckel schließen und die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln lagern, um eine vollständige Nachfaltung der EGFP-Varianten zu ermöglichen. Messen Sie nach 24 Stunden die Fluoreszenzemission der gefalteten Proteinproben mit der gleichen Anregungswellenlänge wie zuvor, um den zeitlichen Endpunkt der Fluoreszenzwiederherstellung zu erfassen. Pellets aus Zellen, die natives Protein exprimierten, und Varianten, die S-Fluorprolin und Dehydroprolin enthielten, hatten aufgrund des intakten Chromophors eine typische helle Farbe.Im Gegensatz dazu blieben Varianten, die R-Fluorprolin und Difluorprolin enthielten, farblos, was auf eine Fehlfaltung und Ablagerung von entfaltetem Protein in Einschlusskörpern hinweist. Die SDS-PAGE-Analyse bestätigte das Vorhandensein von unlöslichen R-Fluorprolin-haltigen Proteinen. Im Gegensatz dazu wurden native Proteine und S-Fluorprolin und dehydroprolinhaltige Varianten in den löslichen Fraktionen gefunden.In der Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie-Analyse erzeugte jeder Prolinersatz durch S-Fluorprolin eine positive 18-Dalton-Verschiebung pro Prolinrest, während der Ersatz durch Dehydroprolin eine negative Verschiebung von zwei Dalton pro Rückstand erzeugte. In Lichtabsorptions- und Emissionsspektren wurde die Chromophorabsorption bei 488 Nanometern für EGFP und 493 Nanometern für NowGFP gefunden. In KillerOrange umfasste der Chromophor-Absorptionsbereich zwei Banden, die zwei möglichen Konfigurations- und Ladungszuständen des komplexen Chromophors entsprachen.Darüber hinaus implizierten Fluoreszenzspektren, die bei Anregung bei den entsprechenden maximalen Absorptionswellenlängen aufgezeichnet wurden, dass die Analoga die chemische Umgebung der Chromophore nicht veränderten. In Refolding-Experimenten erholte sich die native EGFP-Chromophorfluoreszenz teilweise, obwohl die Tryptophan-spezifische Fluoreszenz nach der Renaturierung größer war. Ein ähnliches Verhalten wurde für die Variante beobachtet, die Dehydroprolin enthielt.Bei EGFP-haltigem S-Fluorprolin wurde ein ähnliches Ergebnis mit einer 295-Nanometer-Anregung beobachtet, während sich die Fluoreszenz bei 488 Nanometern in viel höherem Maße erholte. Nur die EGFP-Varianten zeigten eine schnelle Refolding-Kinetik, wobei die Tryptophan-Emissionsrückgewinnung im Vergleich zur Chromophoremission doppelt so schnell war. Es müssen frische Bakterienkulturen mit geeigneten Nährmedien verwendet werden.Sterile Techniken und die regelmäßige Überwachung des Kulturwachstums sind ebenfalls wichtige Voraussetzungen für den Erfolg des Experiments. Diese Methode ist auf das Protein-Engineering anwendbar, da sie es ermöglicht, die Rolle anderer kanonischer Aminosäuren zu untersuchen. Hierfür werden geeignete auxotrophe E.coli-Stämme und Aminosäureanaloga benötigt.Die Massenspektrometrie ganzer Proteine ist als analytischer Nachweis erforderlich, um den Einbau von nicht-kanonischen Aminosäureanaloga zu bestätigen. Die SPI-Methode zur Integration von Prolinanaloga ermöglicht es uns, das Proteinrückgrat direkt zu manipulieren, und bietet Vorteile für ein rationales Design und eine erleichterte Produktion von Proteinen durch globale Stabilisierung und Verbesserung der ribosomalen Translation oder Faltung.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Thermodynamik der Membrane Protein Folding durch Fluoreszenz-Spektroskopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Forschung

Biotechnik

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualizing Proteine ​​und Makromolekulare Komplexe von Negative Stain EM: von Grid Vorbereitung auf Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Mikrofluidischen Mischern für ein Studium Proteinfaltung

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

Zusammenführen von Ionenkonzentration Polarisierung zwischen Juxtaposed Ionenaustauschermembranen zu blockieren die Ausbreitung der Polarisations Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...