Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (אשכול מצוינות "איחוד מערכות בקטליזה) ל- T.F. ו- N.B. ועל ידי משרד החינוך והמדע הפדרלי (תוכנית BMBF "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) ל- F.-J.S. וט.מ.ת.ת.

המחברים חושפים את כל ניגודי העניינים.

בטבע, מניפולציות עם מבנים ותפקודים של חלבונים מתרחשות בדרך כלל עקב מוטציות, התופעה שמובילה לחילופי זהות של חומצת אמינו במיקומים מסוימים ברצף החלבונים. מנגנון טבעי זה מיושם באופן נרחב כשיטה ביוטכנולוגית להנדסת חלבונים בצורה של מוטגנזה, והוא מסתמך על הרפרטואר של 20 חומצות האמינו הקאנוניות המעורבות בתהליך. עם זאת, חילופי שאריות פרולין הם בעייתיים. בשל ארכיטקטורת קבוצת עמוד השדרה המיוחדת שלה, היא כמעט ואינה ניתנת להחלפה עם 19 השאריות הנותרות להחלפה72. לדוגמה, פרולין ידוע בדרך כלל כמפסק מבנה משני ברצפי פוליפפטידים בגלל תאימותו הלקויה למבנים המשניים הנפוצים ביותר, כלומר, α-סליל ו-β גדילים. תכונה זו של פרולין הולכת לאיבוד בקלות כאשר השאריות עוברות מוטציה לחומצת אמינו אחרת מהרפרטואר הנפוץ. החלפת הפרולין באנלוגיה הכימית שלה מציעה גישה חלופית, המאפשרת לשמור על תכונות עמוד השדרה הבסיסיות של שאריות הפרולין האב תוך הטלת הטיה על המעברים הקונפורמיים הספציפיים שלה או הפקת אפנון של הנפח המולקולרי והקוטביות. לדוגמה, ניתן לספק תרביות חיידקים עם מבנים אנלוגיים כגון הידרוקסי-, פלואורו-, אלקיל-, דהידרופרולינים, מבנים בעלי גדלי טבעות משתנים ועוד, ובכך להקל על ייצור של חלבון המכיל שינויים ספציפיים בשאריות פרולין.
שיטת שילוב הלחץ הסלקטיבי (SPI) המתוארת במחקר זה מאפשרת החלפה גלובלית, כלומר ספציפית לשאריות, של כל הפרולינים בחלבון המטרה באנלוגיות כימיות קשורות. חשיבות השיטה משתקפת בכך ש-SPI מאפשר יצירת שינויי רצף שאינם נגישים לטכניקות מוטגנזה נפוצות. לדוגמה, הוא מאפשר ייצור של חלבון מטרה המכיל שינויים מבניים קטנים למדי, שבדרך כלל עשויים שלא לעלות על תחליפי אטום אחד או שניים / מחיקות / תוספות, כפי שהודגם במחקר זה. שינויים חלבוניים כאלה מכונים "מוטציות אטומיות"73,74. בחלבון פלואורסצנטי כגון GFP, ניתן לראות את התוצאה של חדירה מולקולרית זו במהירות הקיפול, הקטבים המקומיים, אריזת החלבון, היציבות של התכונות המבניות המעורבות. השינויים בתכונות הספיגה והפלואורסצנציה מופקים בעקיפין בשל ההשפעה על קיפול חלבונים ומיקרו-סביבה של שאריות. הדיוק של השינויים המולקולריים המבוצעים על ידי SPI הוא בדרך כלל גבוה בהרבה, בהשוואה למוטציות של פרולינים לשאריות קנוניות אחרות, כאשר האחרונה בדרך כלל מזיקה לקיפול החלבון, ייצורו ובידודו.
כשיטת ייצור, גישת SPI משתמשת בסובלנות המצע של כיס הסינתאז אמינואציל-tRNA לכיוון אנלוגים כימיים של חומצת האמינו המקומית. הסינתאז אחראי לזיהוי נכון של מבנה חומצות האמינו, בעוד שהשילוב בחלבונים מתרחש במורד הזרם בתהליך התרגום. באופן אינסטרומנטלי, הייצור, הבידוד והטיהור של חלבונים ב-SPI מבוצעים באופן אופייני לכל טכניקות ביטוי אחרות של חלבונים רקומביננטיים; עם זאת, עם כמה תוספות לפרוטוקול כדלקמן: פרולין, אשר מחויב להחלפה, מסופק בתחילת תהליך התסיסה, כך שהתאים יכולים לגדול ולפתח את המנגנון התאי שלם שלהם. עם זאת, תרבית התאים אינה רשאית להגיע לצפיפות האופטית המקסימלית, כדי לשמור על התאים בפאזה הלוגריתמית אופטימלית לביטוי חלבונים. ישנן שתי וריאציות עיקריות של שיטת SPI בשלב זה. בראשון, ריכוז הפרולין מותאם בתווך הצמיחה הראשוני (תווך מוגדר כימית) כך שהתדלדלות של פרולין מתרחשת ללא כל חדירה חיצונית. התאים ממצים את הפרולין בתווך לפני שהם יכולים לצאת משלב הגדילה הלוגריתמית, ואז, לאחר מכן, מוסיפים את האנלוגיה, ומשרים את החלבון של ייצור העניין. בגרסה השנייה של השיטה, התאים גדלים בתווך המכיל פרולין עד אמצע הפאזה הלוגריתמית שלהם. בשלב זה, יש להוציא את התאים ולהעבירם פיזית למדיום אחר, שאינו מכיל עוד פרולין, רק את האנלוגי, עם אינדוקציה עוקבת של החלבון המעניין. בשתי הגרסאות, ריאגנט האינדוקציה האנלוגי והחלבון מסופקים לתאים שגדלו מראש. הבידוד והטיהור של החלבון מסוג בר מבוצעים באותו אופן כמו עבור הווריאנטים. באופן עקרוני, כל זן Pro-auxotrophic זמין יכול לשמש כמארח ביטוי. עם זאת, מומלץ מבחני ביטוי לזיהוי המארח המתאים ביותר. כמו כן, ניתן להשתמש בבדיקות של מדיה שונה המוגדרת כימית כדי לייעל את תפוקת החלבון.
ישנן דרישות מסוימות לגבי האנלוגיות הכימיות שיש לקחת בחשבון עבור SPI, כגון מסיסות וריכוז. הזמינות המטבולית והספיגה של חומצות אמינו תלויות במספר המולקולות המומסות במדיום. כדי להגדיל את המסיסות של תרכובת מסוימת, ניתן לבחור תנאים חומציים או בסיסיים מעט. מאחר שהמולקולות המלאכותיות עלולות לגרום להשפעות מעכבות גדילה בשל רעילות התאים שלהן, יש להוריד את הריכוז למינימום על מנת למנוע עקה75 של התאים.
חולשה קלה של SPI היא ירידה ביעילות ההתאגדות עם מספר גדול יותר של עמדות שיש להחליף. באופן עקרוני, הפחתה של תדירות חומצות האמינו בתוך הביו-מולקולה של המטרה על ידי מוטגנזה מכוונת אתר יכולה לפתור בעיה זו. עם זאת, התכונות המבניות והתפקודיות של חלבון רצוי עשויות להיות מושפעות משינוי המבנה הראשוני.
כאמור, SPI מאפשר החלפה ספציפית לשאריות של חומצת האמינו הקנונית. משמעות הדבר היא שחומצות אמינו שאינן קנוניות מוכנסות לכל מיקום של חומצת האמינו הקנונית בתוך חלבון המטרה, כולל שאריות שמורות החיוניות לתפקוד החלבון או לקיפולו. שיטות חלופיות לשילוב ספציפי לאתר הן האפשרות היחידה להתגבר על בעיה זו3. בעשורים האחרונים פותחה שיטת הזוג האורתוגונלי שיכולה לייצר חלבונים המכילים שאריות מעובדות באתרים מוגדרים מראש. השינוי הנפוץ ביותר בשיטה זו ידוע בשם דיכוי קודון עצירה. שיטה זו מבוססת על מערכת תרגום אורתוגונלית מהונדסת המוקדשת לשילוב ספציפי לאתר של חומצות אמינו סינתטיות76. יותר מ-200 חומצות אמינו עם שינויים שונים בשרשרת הצדדית שולבו בחלבונים עד כה באמצעות גישה זו77. עם זאת, מערכות תרגום אלה עדיין אינן מתאימות להכנסת אנלוגים פרולין לחלבוני מטרה. יתר על כן, ביצועי השיטה נחשבים נמוכים במקרה של שינויים קלים בחומצות אמינו מכיוון שהפקרות מסוימת ברקע של סינתזת אמינואציל-tRNA נשארת בדרך כלל במערכות התרגום המהונדסות.
באמצעות SPI, ייצרנו מספר גרסאות של חלבונים פלואורסצנטיים β חבית וחקרנו את התוצאות של חילופי פרולין עם האנלוגיות הלא טבעיות שלו. במקרה של החלפת פרולין עם R-Flp ו- Dfp, חלבון לא מתפקד הופק על ידי מארח הביטוי. ההשפעה נוצרת ככל הנראה על ידי קיפול שגוי של חלבונים. ייתכן שמקורו של האחרון הוא בקונפורמציה C 4-exo המקודמת על ידי R-Flp, שאינה שלילית על ידי מבני חלבון האב27. עם Dfp, סביר להניח שהקיפול השגוי ייווצר על ידי המהירות המופחתת של איזומריזציה של קשרים פפטידיים טרנס-עד-ציס בשאריות פרולין27. האחרון ידוע כאחד השלבים המגבילים בפרופיל הקינטי של קיפול החלבון המשפיע על היווצרות β-חבית ועל התבגרות הכרומופורים שלאחר מכן. ואכן, עבור שתי חומצות האמינו, R-Flp ו-Dfp, ייצור החלבון הביא לחלבון מצטבר ובלתי מסיס. כתוצאה מכך, היווצרות כרומופור לא יכלה להתרחש, והפלואורסצנציה אבדה לחלוטין. עם זאת, עם S-Flp ו-Dhp נצפתה הבשלה נכונה של חלבונים, וכתוצאה מכך דגימות חלבון פלואורסצנטיות עבור כל שילוב אנלוגי/חלבוני. למרות כמה אפנון בתכונות הספיגה והפלואורסצנציה של החלבון, אלה נשארו במידה רבה דומים לאלה של החלבונים מסוג בר. ההשפעה של תחליפי חומצות האמינו התגלתה במחקרי הקינטיקה המחודשת. זה האחרון הראה שיפוץ מהיר יותר במקרה של החלפה ב- S-Flp. מחקרי מודל הראו כי שאריות אלה עשויות ליצור שיפור מסוים במהירות הסיבוב של טרנס-טו-ציס אמיד ולהוביל להיווצרות הקונפורמציה C 4-endo. שני גורמים אלה עשויים לתרום להשפעות הקינטיות המועילות של שאריות אלה ב- EGFP. לעומת זאת, Dhp ייצר פרופילי קיפול קינטיים הדומים באופן מקסימלי לחלבון האב. מגוון התוצאות המיוצרות על ידי מוטציות אטומיות בלבד בחלבונים הפלואורסצנטיים שנבדקו ממחיש את הפוטנציאל של שיטת ייצור SPI בשינוי תכונות חלבון המטרה. לשינויים בחלבון המושרים על ידי החלפת פרולין באנלוגיות יש השלכות נוספות על הנדסת האנזימים 78,79,80 ותעלות היונים 81,82, כמו גם בהנדסה הכללית של יציבות החלבון.
המגבלה הבסיסית של שיטת SPI היא מצב "הכל או אף אחד" שלה בהחלפת פרוליין שוכן עם אנלוגים קשורים. זה יהיה יתרון גדול להיות מסוגל לבחור במדויק, אילו שאריות פרולין יש להחליף עם אנלוגים, ואילו אלה צריכים להישאר ללא שינוי. עם זאת, נכון לעכשיו, אין טכניקה שיכולה לבצע הפקה מתוחכמת כזו באמצעות מארח ייצור מיקרוביאלי. סינתזה כימית של חלבונים83,84, כמו גם ייצור ללא תאים85,86, הן שתי השיטות החלופיות שיכולות לייצר שינויים פרולין ספציפיים למיקום. עם זאת, המורכבות התפעולית שלהם ותפוקת הייצור הנמוכה שלהם הופכים אותם לנחותים בהשוואה לייצור בתאים חיים. נכון לעכשיו, SPI נותרה הגישה הפשוטה והחזקה ביותר מבחינה תפעולית לייצור חלבונים מורכבים הנושאים מוטציות אטומיות. על ידי החדרת תחליפי חומצות אמינו לא טבעיות, השיטה מאפשרת לשנות את תכונות החלבון באופן ממוקד, כפי שמודגם כאן על ידי שינויים בקיפול ובספיגת אור / פליטה של חלבונים פלואורסצנטיים הנוצרים על ידי תחליפי פרולין.

מוטגנזה קלאסית מכוונת אתר מאפשרת פרמוטציה של כל רצף חלבונים קיים המקודד על ידי גנים על ידי מניפולציה של קודון ברמת הדנ"א. כדי לחקור קיפול חלבונים ויציבותם, לעתים קרובות רצוי להחליף חומצות אמינו דומות עם עמיתים דומים. עם זאת, מוטגנזה של חלבונים מסורתיים בהחלט מוגבלת לתחליפים דומים מבחינה מבנית בין חומצות אמינו קנוניות כגון Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, הנמצאים ברפרטואר הקוד הגנטי הסטנדרטי. מצד שני, אין אפשרויות כאלה עבור חומצות אמינו קנוניות אחרות כגון Trp, Met, His, או Pro, אשר לעתים קרובות ממלאים תפקידים מבניים ותפקודיים חיוניים בחלבונים1. גישה אידיאלית לחקר אינטראקציות אלה בהקשר של הארכיטקטורה הפנימית הספציפית ביותר של חלבונים ותהליך הקיפול שלהם היא ליצור שינויים איזוסטריים שאינם מפריעים. ואכן, כאשר אנלוגים של חומצות אמינו איזוסטריות של חומצות אמינו קנוניות אלה, הידועות גם בשם חומצות אמינו לא קנוניות (ncAAs), מוכנסים לחלבונים, הם מאפשרים שינויים עדינים אפילו ברמה של אטומים בודדים או קבוצות אטומים כגון H/F, CH2/S/Se/Te המכונות "מוטציות אטומיות"2. "ניתוח מולקולרי" כזה מייצר חלבונים משתנים שתכונותיהם נובעות אך ורק מחילופי אטומים בודדים או קבוצות של אטומים, אשר במקרים חיוביים ניתן לנתח, ואת השינויים שזוהו ניתן לתרץ. בדרך זו, היקף הסינתזה של חלבונים לחקר קיפול ומבנה החלבון מורחב הרבה מעבר למוטגנזה הקלאסית של הדנ"א. שים לב שחלבונים הנוצרים על ידי מוטגנזה מכוונת אתר מכונים בדרך כלל "מוטנטים", בעוד שחלבונים עם חומצות אמינו קנוניות מוחלפות מכונים "וריאנטים" 3, "אלופרוטאינים"4, או "חלבונים קונגנים"5.
החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP), שזוהה לראשונה באורגניזם הימי Aequorea victoria, מפגין פלואורסצנציה ירוקה בהירה כאשר הוא נחשף לאור אולטרה סגול לכחול 6,7. כיום, GFP משמש בדרך כלל ככלי תיוג רגיש ביותר להדמיה שגרתית של ביטוי גנים ולוקליזציה של חלבונים בתאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. GFP הוכיח את עצמו כיעיל גם במחקרים ביו-פיזיקליים שוניםשל 8,9,10 ובביו-רפואיים11,12, כמו גם בהנדסת חלבונים 13,14,15. ניתוח קפדני של מבנה ה-GFP איפשר יצירת וריאנטים רבים המאופיינים ביציבות מגוונת ובפלואורסצנטיות מקסימלית16,17. רוב וריאנטים של GFP המשמשים בביולוגיה תאית ומולקולרית הם חלבונים מונומריים הן בתמיסה והן בגביש18. הארגון המבני העיקרי שלהם אופייני לכל בני משפחת GFP, ללא תלות במקורם הפילוגנטי, והוא מורכב מ-11 גדילי β היוצרים מה שמכונה חבית β, בעוד סליל α מקועקם עובר דרך מרכז הקנה ונושא את הכרומופור (איור 1A). ההבשלה האוטוקטליטית של הכרומופור (איור 1B) דורשת מיקום מדויק של השרשראות הצדדיות המקיפות אותו במקום המרכזי של החלבון; רבות מהשרשראות הצדדיות הללו נשמרות מאוד בגרסאות GFP אחרות19. ברוב החלבונים הפלואורסצנטיים ממדוזות כמו Aequorea victoria, הכרומופור הפולט ירוק מורכב משתי טבעות ארומטיות, כולל טבעת פנול של Tyr66 והמבנה ההטרוציקלי בעל חמשת האיברים של אימידזולינון (איור 1B). הכרומופור, כאשר הוא מוטבע כראוי במטריצת החלבון, אחראי על הפלואורסצנציה האופיינית של החלבון השלם. הוא ממוקם במרכז המבנה, בעוד מבנה החבית מבודד אותו מהמדיום מימי20. חשיפת הכרומופור למים בתפזורת תגרום להרוות פלואורסצנטיות, כלומר לאובדן פלואורסצנציה21.
הקיפול הנכון של המבנה דמוי הקנה חיוני להגנה על הכרומופור מפני מרווה פלואורסצנטית22. שאריות פרולין (Pro) ממלאות תפקיד מיוחד בארגון המבני של GFP23. מאחר שהם אינם מסוגלים לתמוך בחוט β, הם מהווים לולאות חיבור האחראיות לשמירה על מבנה החלבון בכללותו. באופן לא מפתיע, 10-15 שאריות פרולין נמצאות הן ב-GFPs שמקורם ב-Aequorea והן ב-Anthoathecata שמקורם ב-GFPs; חלקם שמורים מאוד בסוגים אחרים של חלבונים פלואורסצנטיים β חבית. פרולינים צפויים להשפיע באופן קריטי על תכונות הקיפול בשל תכונותיהם הגיאומטריות הייחודיות. לדוגמה, ב-GFPs שמקורם ב-Aequorea, מתוך עשרת שאריות הפרולין (איור 2A), תשעה יוצרים טרנס-פפטידים ורק אחד יוצר קשר ציס-פפטידי (Pro89). Pro58 הוא חיוני, כלומר, לא ניתן להחלפה עם שאר 19 חומצות האמינו הקאנוניות. שאריות אלה עשויות להיות אחראיות למיקום הנכון של שאריות Trp57, שדווח כי הן חיוניות להבשלת הכרומופור ולקיפול ה-GFP הכולל24. השבר PVPWP עם שלוש שאריות פרולין (Pro54, Pro56, Pro58) ו-Trp57 הוא החלק החיוני של "המכסה התחתון" במבנה ה-GFP מאיור 1A. המוטיב המבני של PVPWP נמצא במספר חלבונים כגון ציטוכרומים ותעלות אשלגן המופעלות על ידי מתח אאוקריוטי25. תחליפי פרולין לאלנין במיקומים 75 ו-89 פוגעים גם הם בביטוי חלבונים ובקיפול ומבטלים את התבגרות הכרומופור. Pro75 ו-Pro89 הם חלק מ"המכסה העליון" שקובר את הכרומופור (איור 1A) ונשמרים על פני חלבונים פלואורסצנטיים β-חבית בעלי 11 גדילים23. שני "מכסים" אלה שומרים על הכרומוזורה לא נכלל בממס מימי, גם כאשר המבנה השלישוני היציב נשבר חלקית26. ארכיטקטורה מולקולרית ספציפית כזו מגנה על הפלואורופור מפני מרווה פלואורסצנטית מתנגשת (דינמית), למשל על ידי מים, חמצן או ליגנדות מתפזרות אחרות.
על מנת לבצע הנדסה מולקולרית של מבנה ה-GFP, יש להכניס תחליפי חומצות אמינו במבנה הראשוני של החלבון. מוטציות רבות בוצעו ב-GFP, וסיפקו לווריאנטים יציבות גבוהה, קיפול מהיר ואמין ותכונות פלואורסצנטיות משתנות17. עם זאת, ברוב המקרים, מוטציה של שאריות פרולין נחשבת לגישה מסוכנת בשל העובדה שאף אחת מ-19 חומצות האמינו הקאנוניות הנותרות אינה יכולה לשחזר כראוי את הפרופיל הקונפורמי של שאריות הפרולין27. כך פותחה גישה חלופית, שבה שאריות פרולין מוחלפות במבנים אחרים המבוססים על פרולין, המכונים אנלוגים פרולין28. בשל המבנה הכימי המחזורי הייחודי שלו, פרולין מציג שני מעברים קונפורמיים אופייניים (איור 1C): 1) נקבת טבעת הפרולין, תהליך מהיר הכרוך בארגון עמוד השדרה, המשפיע בעיקר על זווית הפיתול φ, ו-2) איזומריזציה של קשר פפטידי cis/trans, תהליך איטי המשפיע על קיפול עמוד השדרה דרך זוויות הפיתול של ω. בשל אופיו האיטי, המעבר האחרון אחראי בדרך כלל לשלבים המגבילים את הקצב בתהליך הקיפול של החלבון השלם. הוכח בעבר כי איזומריזציה של קשר פפטידי cis/trans סביב חלק משאריות הפרולין כוללת צעדים איטיים בקיפול גרסאות GFP. לדוגמה, היווצרות הקשר cis-peptide ב- Pro89 כוללת את השלב האיטי בתהליך הקיפול מכיוון שהוא מסתמך על מעבר הקשר מטרנס לציס29. ניתן להשיג שיפוץ מהיר יותר לאחר החלפת Pro89 בלולאה פפטידית של כל-טרנס, כלומר על ידי ביטול אירוע איזומריזציה של ציס-לטרנס 30. בנוסף לאיזומריזציה של ציס/טרנס, מעברי ה-pucker עשויים גם ליצור שינויים עמוקים בקיפול חלבונים עקב ארגון עמוד השדרה והאריזה בתוך פנים החלבון27,31.
שינויים כימיים גורמים לשינוי המעברים הקונפורמיים הפנימיים של שאריות הפרולין, ובכך משפיעים על יכולתו של החלבון להתקפל. אנלוגים פרולין מסוימים הם מועמדים אטרקטיביים במיוחד להחלפת פרולין בחלבונים מכיוון שהם מאפשרים מניפולציה ולימוד של תכונות הקיפול. לדוגמה, (4R)-פלואורופרולין (R-Flp), (4S)-פלואורופרו-פרולין (S-Flp), 4,4-דיפלואורופרולין (Dfp) ו-3,4-דהידרופרולין (Dhp) הם ארבעה אנלוגים (איור 1D) השונים באופן מינימלי מפרולין הן מבחינת הנפח המולקולרי והן מבחינתהקוטביות 32. יחד עם זאת, כל אנלוגי מציג נקבת טבעת מובחנת: S-Flp מייצב את ה-C 4-endo pucker, R-Flp מייצב את ה-C 4-exo pucker, Dfp אינו מפגין העדפת נקבים נראית לעין, בעוד ש-Dhp מבטל את ה-puckering (איור 1D)33. על ידי שימוש באנלוגיות אלה במבנה החלבון, ניתן לתמרן עם המעבר הקונפורמי של שאריות הפרולין, ועם זאת, להשפיע על התכונות של גרסאות ה- GFP המתקבלות.
בעבודה זו, שמנו לנו למטרה לשלב את הקבוצה הייעודית של אנלוגים פרולין (איור 1D) במבנה של וריאנטים של GFP באמצעות שיטת שילוב הלחץ הסלקטיבי (SPI, איור 3)34. החלפת שאריות חומצות אמינו באנלוגיות האיזוסטרוקטורליות הקרובות ביותר אליהן היא מושג ביו-טכנולוגי יישומי בתכנון חלבונים35,36. לפיכך, ההשפעות של אנלוגים פרולין בחלבון מודל ממחישות את הפוטנציאל שלהם לשמש ככלים בהנדסת חלבונים37. ייצור חלבונים המכילים אנלוגים רצויים בוצע בזני E. coli שעברו שינוי שאינם מסוגלים לייצר פרולין (פרולין-אוקסוטרופיה). לפיכך, הם עשויים להיאלץ לקבל החלפת מצעים בתהליך של ביוסינתזה של חלבון38. החלפה גלובלית זו של פרולין מתאפשרת על ידי גמישות המצע הטבעי של סינתזות אמינואציל-tRNA אנדוגניות39, האנזימים המרכזיים המזרזים את האסטריפיקציה של tRNA עם חומצות אמינו מתאימות40. באופן כללי, כפי שמתואר באיור 3, גדילת התאים מתבצעת בתווך מוגדר עד שמגיעים לשלב הצמיחה הלוגריתמית האמצעית. בשלב הבא, חומצת האמינו שתוחלף מתרוקנת תוך תאית ממערכת הביטוי במהלך התסיסה ולאחר מכן מוחלפת על ידי האנלוגי או ה- ncAA הרצויים. לאחר מכן, ביטוי של חלבון מטרה מושרה לצורך שילוב של חומצות אמינו שאינן קנוניות ספציפיות לשאריות. ההחלפה של חומצת האמינו הקוגנטית באנלוגיה שלה מתרחשת באופן רחב פרוטאום. למרות שתופעת לוואי זו עשויה להיות בעלת השפעה שלילית על צמיחת הזן המארח, איכות ייצור חלבון המטרה לרוב אינה מושפעת, שכן, בביטוי רקומביננטי, המשאבים התאיים מופנים בעיקר לייצור חלבון היעד41,42. לכן, מערכת ביטוי מוסדרת היטב, בלתי ניתנת להשראה ומקדמים חזקים הם חיוניים ליעילות התאגדות גבוהה43. הגישה שלנו מבוססת על שילוב ספציפי לשאריות מרובות של ncAAs בתגובה לקודון חושי (הקצאה מחדש של קודון חושי), לפיו בתוך גן המטרה, ניתן לתמרן את מספר המיקומים להחדרה אנלוגית של Pro באמצעות מוטגנזהמכוונת אתר 44. גישה דומה יושמה בדו"ח הקודם שלנו על הכנת פפטידים רקומביננטיים בעלי תכונות אנטי-מיקרוביאליות45. בעבודה זו יישמנו את שיטת SPI, המאפשרת להחליף את כל שאריות הפרולין באנלוגיות קשורות, כדי ליצור חלבונים הצפויים להיות בעלי תכונות פיסיקוכימיות מובהקות שאינן קיימות בחלבונים המסונתזים עם רפרטואר חומצות האמינו הקנוניות. על ידי אפיון הפרופיל המתקפל והפלואורסצנטי של הווריאנטים המתקבלים, אנו שואפים להציג את ההשפעות של תחליפים אטומיים בגרסאות של GFP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

החלפת שאריות פרולין (Pro) בחלבונים על ידי המוטגנזה המסורתית המכוונת לאתר על ידי כל אחת מ-19 חומצות האמינו הקנוניות הנותרות מזיקה לעתים קרובות לקיפול חלבונים, ובמיוחד להבשלת כרומופור בחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ובגרסאות קשורות. חלופה סבירה היא לתפעל את התרגום של החלבון כך שכל שאריות Pro יוחלפו בשאריות - במיוחד על ידי אנלוגים, שיטה המכונה שילוב לחץ סלקטיבי (SPI). השינויים הכימיים המובנים יכולים לשמש כמעין "ניתוח מולקולרי" כדי לנתח בעדינות שינויים הניתנים למדידה או אפילו לתמרן באופן רציונלי תכונות חלבון שונות. כאן, המחקר מדגים את התועלת של שיטת SPI כדי לחקור את תפקידם של פרולינים בארגון המבנה הטיפוסי של חבית β של וריאנטים ספקטרליים של החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) עם 10-15 פרולינים ברצף שלהם: חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), NowGFP ו- KillerOrange. שאריות Pro נמצאות בקטעי חיבור בין גדילי β בודדים ומהוות את המכסים הסוגרים של פיגום החבית, ובכך אחראיות לבידוד הכרומופור ממים, כלומר תכונות פלואורסצנטיות. ניסויי שילוב לחץ סלקטיביים עם (4R)-פלואורופרופרולין (R-Flp), (4S)-פלואורופרולין (S-Flp), 4,4-דיפלואורופרולין (Dfp) ו-3,4-דהידרופרולין (Dhp) בוצעו באמצעות זן E. coli פרולין-אוקסוטרופי כמארח ביטוי. מצאנו שחלבונים פלואורסצנטיים עם S-Flp ו-Dhp הם פעילים (כלומר, פלואורסצנטיים), בעוד ששני האנלוגיים האחרים (Dfp ו-R-Flp) ייצרו חלבונים לא מתפקדים, מקופלים בצורה שגויה. בדיקה של פרופילי ספיגת UV-Vis ופליטת פלואורסצנציה הראתה מעט שינויים אופייניים בחלבונים המכילים אנלוגים של Pro. בדיקה של הפרופילים הקינטיים המתקפלים בגרסאות EGFP הראתה תהליך שיפוץ מואץ בנוכחות S-Flp, בעוד שהתהליך היה דומה לסוג פראי בחלבון המכיל Dhp. מחקר זה מציג את היכולת של שיטת SPI לייצר שינויים עדינים של שאריות חלבון ברמה אטומית ("ניתוח מולקולרי"), אשר ניתן לאמץ למחקר של חלבונים אחרים בעלי עניין. הוא ממחיש את התוצאות של תחליפי פרולין עם אנלוגים כימיים קרובים על התכונות המתקפלות והספקטרוסקופיות בקטגוריה של חלבונים פלואורסצנטיים β חבית.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

כדי להתגבר על המגבלות של מוטגנזה קלאסית מכוונת אתר, אנלוגים פרולין עם שינויים ספציפיים שולבו במספר חלבונים פלואורסצנטיים. אנו מראים כיצד החלפת מימן על ידי פלואור או של היחיד על ידי קשרים כפולים בשאריות פרולין ("ניתוח מולקולרי") משפיעה על תכונות חלבון בסיסיות, כולל קיפולם ואינטראקציה עם אור.

חילופי פרולין ספציפיים לשאריות על ידי אנלוגים פרולין בחלבונים פלואורסצנטיים: כיצד "ניתוח מולקולרי" של עמוד השדרה משפיע על קיפול ויציבות

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

ברוב המקרים, מוטגנזה קונבנציונלית מכוונת אתר אינה מתאימה לחקר התפקיד התפקודי של פרולינים בחלבונים. כאן אנו מציגים שיטה לשילוב אנלוגים פרולין כחומצות אמינו לא קנוניות בחלבונים מסונתזים ריבוזומלית כדי לחקור את תפקידם של שאריות פרולין על קיפול ותפקוד חלבונים. החלפת פרולינה בחומצות אמינו סטנדרטיות היא גישה מסוכנת.שילוב של אנלוגים פרולין מאפשר סוג של ניתוח מולקולרי. במילים אחרות, הוא מכניס שינויים מולקולריים עדינים כדי להשפיע באופן רציונלי על תכונות החלבון ולתפעל אותן. מאחר ששאריות פרולין ממלאות תפקיד חיוני ביציבותם של פיגומי חלבונים, הטכנולוגיה שלנו יכולה לעזור להבין את הסיבות מאחורי ליקויים בקיפול חלבונים, העומדים בבסיסם של מצבים פתולוגיים מסוימים בבני אדם.לשינויי החלבונים המושרים על ידי תחליפי פרולין יש השלכות על ההנדסה הביוטכנולוגית של אנזימים והם מספקים הזדמנויות לשיפור תרגום או קיפול של חלבונים ריבוזומליים. שיטה זו אינה דורשת ציוד מיוחד ומכשור יקר. יש לנקוט בזהירות מיוחדת עם צעדי פרוטוקול, שבהם פרולין מקורי מתרוקן מתרביות E.coli לפני הוספת אנלוגים פרולין.כדי להתחיל בייצור של חלבונים פלואורסצנטיים עם פרולין מקומי, לחסן 200 מיליליטרים של מדיום NMM טרי בבקבוקון Erlenmeyer של שני ליטר עם שני מיליליטרים של תרבית הלילה. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי ב-220 סל"ד למשך כ-3.5 שעות. במהלך הדגירה, יש למדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר בספקטרופוטומטר כל 30 דקות.כאשר הצפיפות האופטית מגיעה ל-0.7, סובבו מטה את תרחיף התא וצימצמו בעדינות את הסופרנטנט לפסולת. לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי החייאה ב-50 מיליליטרים של NMM קר כקרח ללא חומצות אמינו או NMM ללא פרולין. סובבו שוב את התאים ותפרקו את ה-supernatant לפסולת.לאחר מכן, יש לבצע החייאה של גלולת התאים על ידי צנרת עדינה ב-200 מיליליטרים של NMM ללא פרולין ולהשלים עם אמפיצילין בבקבוקון ארלנמאייר בנפח שני ליטרים, ולדגום את התאים בשייקר מסלולי למשך 30 דקות כדי לאפשר דלדול מוחלט של הפרולין. לאחר הדגירה, הוסף נפח מתאים של L-proline או אנלוגים פרולין מתמיסות המלאי של 50 מילימולאר כדי לקבל ריכוז סופי של מילימולר אחד בהשעיית התא. לאחר מכן, לגרום לביטוי חלבון יעד על ידי הוספת IPTG של 500 מיקרומולר מתמיסת מלאי טוחנת אחת.מבטאים את חלבון המטרה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי ומודדים את הצפיפות האופטית למחרת. לאסוף את תאי החיידקים על ידי צנטריפוגה ולפרק את הסופרנטנט לפסולת. לאחר מכן, לשטוף את התאים על ידי צנרת זהירה ב 50 מיליליטרים של מאגר קישור המכיל 10% גליצרול.סובבו שוב את התאים, נקו את הסופרנאטנט, ואחסנו את גלולת התא בצינור של 50 מיליליטר במינוס 20 או 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לפני הערכת פליטת פלואורסצנציה, בצע SDS-PAGE כדי להבטיח שטוהר הדגימה הוא מעל 95% לאחר מכן, התאם את הדגימות של כל וריאנט חלבון מטוהר לריכוז של 0.3 מיקרומולים, תוך לקיחת ערך הספיגה המחושב באורך הגל המתאים כהפניה. ודא שנפח הדגימה הסופי המשוער הוא 200 מיקרוליטרים.תנו לדגימות המדוללות להתיישב בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, העבירו את הדגימות לקובט קוורץ בקוורץ באורך סנטימטר אחד ומדדו את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית של הדגימות באמצעות ספקטרומטר פלואורסצנטי. כדי לגרום לדנטורציה, דיללו את הדגימות של כל וריאנט חלבון פי עשרים על ידי הוספת שני המיקרוליטרים של דגימות 300 מיקרומולריות ל-18 מיקרוליטרים של מאגר PBS 1.11X המכיל אוריאה טוחנות 8.89 ו-5.56 מילימולאר DTT.הדגירה של הדגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, דיללו את הדגימות פי 100 על ידי הוספת 1, 980 מיקרוליטרים של PBS המכילים DTT של חמישה מילימולרים כדי לגרום לרנטורציה ולהעביר מיד 200 מיקרוליטרים של הדגימות לקובט קוורץ של סנטימטר אחד. מכניסים את הקובט קוורץ לספקטרומטר פלואורסצנטי מתאים ועוקבים אחר שיפוץ חלבונים על ידי רכישת ספקטרום פלואורסצנטי כל שלוש שניות במשך 30 דקות.מעבירים את דגימות השיפוץ לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ואז סוגרים את המכסה ומאחסנים את הדגימות בטמפרטורת החדר בחושך כדי לאפשר שיפוץ מלא של גרסאות EGFP. לאחר 24 שעות, מדוד את פליטת הפלואורסצנציה של דגימות החלבון המחודשות באמצעות אותו אורך גל של עירור כמו קודם לכן כדי ללכוד את נקודת הקצה הטמפורלית של התאוששות פלואורסצנטית. לכדורים מתאים המבטאים חלבונים מקומיים ולגרסאות שנשאו S-פלואורופרולין ודהידרופרולין היה צבע בהיר אופייני בשל הכרומופור השלם.לעומת זאת, וריאנטים המכילים R-פלואורופרולין ודיפלואורופרופרולין נותרו חסרי צבע, מה שמעיד על קיפול שגוי ושקיעה של חלבון נפרש בגופי הכללה. ניתוח SDS-PAGE אימת את נוכחותם של חלבונים המכילים R-fluoroproline בלתי מסיסים. לעומת זאת, חלבונים מקומיים וריאנטים נושאי S-fluoroproline ו-dehydroproline נמצאו בשברים המסיסים.באנליזה של כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסות, כל החלפת פרולין ב-S-fluoroproline יצרה תזוזה חיובית של 18 דלטון לכל שאריות פרולין, בעוד שהחלפה בדהידרופרולין יצרה תזוזה שלילית של שני דלטונים לכל שאריות. בספקטרום בליעת אור ופליטה, ספיגת כרומופור נמצאה ב-488 ננומטר עבור EGFP ו-493 ננומטר עבור NowGFP. ב-KillerOrange, אזור ספיגת הכרומופורים כלל שני פסים המתאימים לשני מצבי תצורה ומטען אפשריים של הכרומופור המרוכב.יתר על כן, ספקטרום פלואורסצנטי שנרשם עם עירור באורכי הגל המתאימים לספיגה מקסימלית רמז כי האנלוגיות לא שינו את הסביבה הכימית של הכרומופורים. בניסויים חוזרים, הפלואורסצנציה הטבעית של כרומופור EGFP התאוששה חלקית, אם כי הפלואורסצנציה הספציפית לטריפטופן הייתה גדולה יותר לאחר רנטורציה. התנהגות דומה נצפתה עבור הווריאנט המכיל דהידרופרולין.ב-S-fluoroproline המכיל EGFP, נצפתה תוצאה דומה עם עירור של 295 ננומטר, בעוד שהפלואורסצנציה התאוששה במידה גבוהה בהרבה ועמדה על 488 ננומטר. רק גרסאות ה-EGFP הראו קינטיקה מהירה של שיפוץ מחדש, כאשר התאוששות פליטת טריפטופן הייתה מהירה פי שניים בהשוואה לפליטת הכרומופורים. יש להשתמש בתרביות חיידקים טריות עם אמצעי גדילה מתאימים.טכניקות סטריליות וניטור קבוע של צמיחת התרבית הם גם תנאים מוקדמים חשובים להצלחת הניסוי. שיטה זו ישימה להנדסת חלבונים, שכן היא מאפשרת לחקור את תפקידן של חומצות אמינו קנוניות אחרות. לשם כך, יש צורך בזני E.coli auxotrophic מתאימים ואנלוגים של חומצות אמינו.ספקטרומטריית מסה של חלבונים מלאים נדרשת כראיה אנליטית כדי לאשר את שילובם של אנלוגים של חומצות אמינו שאינן קנוניות. שיטת SPI לשילוב אנלוגים פרולין מאפשרת לנו לתפעל את עמוד השדרה של החלבון ישירות, ומציעה יתרונות לתכנון רציונלי ולהקלה על ייצור חלבונים באמצעות ייצוב גלובלי ושיפור של תרגום או קיפול ריבוזומליים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

תרמודינמיקה של קיפול חלבונים ממברנה נמדד על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

מיזוג קיטוב ריכוז יון בין חופפי Ion Exchange ממברנות כדי לחסום את ההתפשטות של אזור הקיטוב

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...