Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (उत्कृष्टता का क्लस्टर "उत्प्रेरण में एकीकृत प्रणाली) द्वारा टीएफ और एनबी और संघीय शिक्षा और विज्ञान मंत्रालय (बीएमबीएफ कार्यक्रम "एचएसपी 2020", टीयू-डब्ल्यूएमआईएमआईपीस प्रोजेक्ट सिंटीयूबायो) द्वारा एफ-जेएस के लिए समर्थित किया गया था। और T.M.T.T.

लेखकों ने सभी और हितों के किसी भी संघर्ष का खुलासा किया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

शेष 19 विहित अमीनो एसिड में से किसी एक द्वारा पारंपरिक साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा प्रोटीन में प्रोलाइन (प्रो) अवशेषों का प्रतिस्थापन अक्सर प्रोटीन तह के लिए हानिकारक होता है और विशेष रूप से, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और संबंधित वेरिएंट में क्रोमोफोर परिपक्वता। एक उचित विकल्प प्रोटीन के अनुवाद में हेरफेर करना है ताकि सभी प्रो अवशेषों को अवशेषों को विशेष रूप से एनालॉग्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सके, एक विधि जिसे चयनात्मक दबाव निगमन (एसपीआई) के रूप में जाना जाता है। अंतर्निहित रासायनिक संशोधनों का उपयोग एक प्रकार की "आणविक सर्जरी" के रूप में किया जा सकता है ताकि औसत दर्जे के परिवर्तनों को बारीकी से विच्छेदित किया जा सके या यहां तक कि तर्कसंगत रूप से विभिन्न प्रोटीन गुणों में हेरफेर किया जा सके। यहां, अध्ययन अपने अनुक्रम में 10-15 प्रोलाइनों के साथ हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के वर्णक्रमीय वेरिएंट के विशिष्ट β-बैरल संरचना के संगठन में प्रोलाइन्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एसपीआई विधि की उपयोगिता को दर्शाता है: बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी), NowGFP, और KillerOrange। प्रो अवशेष व्यक्तिगत β-स्ट्रैंड के बीच वर्गों को जोड़ने में मौजूद होते हैं और बैरल पाड़ के समापन ढक्कन का गठन करते हैं, इस प्रकार पानी से क्रोमोफोर के इन्सुलेशन के लिए जिम्मेदार होते हैं, यानी, प्रतिदीप्ति गुण। (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4 S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), और 3,4-dehydroproline (Dhp) के साथ चयनात्मक दबाव निगमन प्रयोगों को अभिव्यक्ति मेजबान के रूप में एक proline-auxotrophic E. coli तनाव का उपयोग करके किया गया था। हमने पाया कि एस-एफएलपी और डीएचपी के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन सक्रिय हैं (यानी, फ्लोरोसेंट), जबकि अन्य दो एनालॉग्स (डीएफपी और आर-एफएलपी) ने बेकार, मिसफोल्डेड प्रोटीन का उत्पादन किया। यूवी-विस अवशोषण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन प्रोफाइल के निरीक्षण ने प्रो एनालॉग्स वाले प्रोटीन में कुछ विशिष्ट परिवर्तन दिखाए। ईजीएफपी वेरिएंट में तह गतिज प्रोफाइल की परीक्षा ने एस-एफएलपी की उपस्थिति में एक त्वरित रीफोल्डिंग प्रक्रिया दिखाई, जबकि प्रक्रिया डीएचपी युक्त प्रोटीन में जंगली-प्रकार के समान थी। यह अध्ययन परमाणु स्तर ("आणविक सर्जरी") पर प्रोटीन अवशेषों के सूक्ष्म संशोधनों का उत्पादन करने के लिए एसपीआई विधि की क्षमता को दर्शाता है, जिसे ब्याज के अन्य प्रोटीनों के अध्ययन के लिए अपनाया जा सकता है। यह β-बैरल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के वर्ग में तह और स्पेक्ट्रोस्कोपिक गुणों पर करीबी रासायनिक एनालॉग्स के साथ प्रोलाइन प्रतिस्थापन के परिणामों को दर्शाता है।

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Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

शास्त्रीय साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस की सीमाओं को दूर करने के लिए, विशिष्ट संशोधनों के साथ प्रोलाइन एनालॉग्स को कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन में शामिल किया गया था। हम दिखाते हैं कि फ्लोरीन द्वारा हाइड्रोजन का प्रतिस्थापन या प्रोलाइन अवशेषों ("आणविक सर्जरी") में डबल बॉन्ड द्वारा एकल का प्रतिस्थापन मौलिक प्रोटीन गुणों को कैसे प्रभावित करता है, जिसमें प्रकाश के साथ उनकी तह और बातचीत शामिल है।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन में प्रोलाइन एनालॉग्स द्वारा प्रोलाइन के अवशेष-विशिष्ट विनिमय: बैकबोन की "आणविक सर्जरी" तह और स्थिरता को कैसे प्रभावित करती है

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

ज्यादातर मामलों में, पारंपरिक साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस प्रोटीन में प्रोलाइन्स की कार्यात्मक भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं है। यहां, हम प्रोटीन तह और कार्य पर प्रोलाइन अवशेषों की भूमिका की जांच करने के लिए राइबोसोमली-संश्लेषित प्रोटीन में गैर-विहित अमीनो एसिड के रूप में प्रोलाइन एनालॉग्स को शामिल करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। मानक अमीनो एसिड द्वारा प्रोलाइन्स का प्रतिस्थापन एक जोखिम भरा दृष्टिकोण है।प्रोलाइन एनालॉग्स का निगमन एक प्रकार की आणविक सर्जरी की अनुमति देता है। दूसरे शब्दों में, यह प्रोटीन गुणों को तर्कसंगत रूप से प्रभावित करने और हेरफेर करने के लिए सूक्ष्म आणविक परिवर्तनों का परिचय देता है। चूंकि प्रोलाइन अवशेष प्रोटीन मचानों की स्थिरता में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, इसलिए हमारी तकनीक प्रोटीन तह घाटे के पीछे के कारणों को समझने में सहायक हो सकती है, जो मनुष्यों में कुछ पैथोलॉजिकल राज्यों को रेखांकित करती है।प्रोलाइन प्रतिस्थापन द्वारा प्रेरित प्रोटीन परिवर्तन एंजाइमों के जैव-तकनीकी इंजीनियरिंग के लिए निहितार्थ हैं और राइबोसोमल प्रोटीन अनुवाद या तह की वृद्धि के लिए अवसर प्रदान करते हैं। इस विधि को विशेष उपकरण और महंगे इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है। प्रोटोकॉल चरणों के साथ विशेष देखभाल की जानी चाहिए, जिसमें प्रोलाइन एनालॉग्स के अलावा से पहले ई.कोलाई संस्कृतियों से देशी प्रोलाइन समाप्त हो जाती है।देशी प्रोलाइन के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन शुरू करने के लिए, रात भर की संस्कृति के दो मिलीलीटर के साथ दो लीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में ताजा एनएमएम माध्यम के 200 मिलीलीटर का टीकाकरण करें। लगभग 3.5 घंटे के लिए 220 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान, हर 30 मिनट में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें।जब ऑप्टिकल घनत्व 0.7 तक पहुंच जाता है, तो सेल निलंबन को नीचे स्पिन करें और धीरे-धीरे सुपरनेटेंट को कचरे में डिकेंट करें। फिर, प्रोलाइन के बिना किसी भी अमीनो एसिड या एनएमएम के बिना 50 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे एनएमएम में फिर से निलंबित करके कोशिकाओं को धोएं। कोशिकाओं को फिर से स्पिन करें और supernatant को कचरे में decant करें।इसके बाद, प्रोलाइन के बिना एनएमएम के 200 मिलीलीटर में कोमल पिपेटिंग द्वारा सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और दो लीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में एम्पिसिलिन के साथ पूरक करें, और प्रोलाइन की पूरी कमी के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेकर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, सेल निलंबन में एक-मिलीमोलर अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 50-मिलीमोलर स्टॉक समाधानों से या तो एल-प्रोलाइन या प्रोलाइन एनालॉग्स की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें। अगला, एक-दाढ़ स्टॉक समाधान से 500-माइक्रोमोलर आईपीटीजी जोड़कर लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें।एक कक्षीय शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त करें और अगले दिन ऑप्टिकल घनत्व को मापें। centrifugation द्वारा जीवाणु कोशिकाओं ले लीजिए और अपशिष्ट में supernatant decant. फिर, 10% ग्लिसरॉल युक्त बाध्यकारी बफर के 50 मिलीलीटर में सावधानीपूर्वक पिपेटिंग करके कोशिकाओं को धोएं।कोशिकाओं को फिर से स्पिन करें, supernatant decant, और आगे के उपयोग तक माइनस 20 या 80 डिग्री सेल्सियस पर एक 50-मिलीलीटर ट्यूब में सेल पैलेट स्टोर करें। प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का मूल्यांकन करने से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए एक एसडीएस-पेज करें कि नमूना शुद्धता 95% से ऊपर है, फिर, प्रत्येक शुद्ध प्रोटीन संस्करण के नमूनों को 0.3 माइक्रोमोल्स की एकाग्रता में समायोजित करें, एक संदर्भ के रूप में उपयुक्त तरंग दैर्ध्य पर परिकलित अवशोषण मूल्य लेते हुए। सुनिश्चित करें कि अनुमानित अंतिम नमूना मात्रा 200 माइक्रोलीटर है।पतले नमूनों को कमरे के तापमान पर संतुलित होने दें। एक घंटे के बाद, नमूनों को एक सेंटीमीटर क्वार्ट्ज क्यूवेट में स्थानांतरित करें और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके नमूनों के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को मापें। विकृतीकरण को प्रेरित करने के लिए, 300-माइक्रोमोलर नमूनों के दो माइक्रोलीटर को 1.11X PBS बफर के 18 माइक्रोलीटर में जोड़कर प्रत्येक प्रोटीन वेरिएंट के नमूनों को बीस गुना पतला करें जिसमें 8.89-दाढ़ यूरिया और 5.56-मिलीमोलर डीटीटी होता है।नमूनों को पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, नमूनों को 100-गुना पतला करें पीबीएस के 1, 980 माइक्रोलीटर जोड़कर पांच-मिलीमोलर डीटीटी युक्त होते हैं ताकि पुनः संतृप्ति को प्रेरित किया जा सके और तुरंत एक सेंटीमीटर क्वार्ट्ज क्यूवेट में नमूनों के 200 माइक्रोलीटर को स्थानांतरित किया जा सके। क्वार्ट्ज क्यूवेट को एक उपयुक्त प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर में डालें और 30 मिनट में हर तीन सेकंड में एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम प्राप्त करके प्रोटीन रीफोल्डिंग की निगरानी करें।1.5-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में रीफोल्डिंग नमूनों को स्थानांतरित करें, फिर ढक्कन को बंद करें और ईजीएफपी वेरिएंट के पूर्ण रीफोल्डिंग की अनुमति देने के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर नमूनों को स्टोर करें। 24 घंटों के बाद, प्रतिदीप्ति वसूली के अस्थायी समापन बिंदु पर कब्जा करने के लिए पहले के रूप में एक ही उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके refolded प्रोटीन नमूनों के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को मापने। देशी प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं से छर्रों और एस-फ्लोरोप्रोलाइन और डिहाइड्रोप्रोलाइन वाले वेरिएंट में बरकरार क्रोमोफोर के कारण एक विशिष्ट उज्ज्वल रंग था।इसके विपरीत, आर-फ्लोरोप्रोलिन और डाइफ्लोरोप्रोलाइन वाले वेरिएंट रंगहीन रहे, जो शामिल निकायों में सामने आए प्रोटीन के मिसफोल्डिंग और जमाव को दर्शाता है। एसडीएस-पेज विश्लेषण ने अघुलनशील आर-फ्लोरोप्रोलाइन युक्त प्रोटीन की उपस्थिति को सत्यापित किया। इसके विपरीत, देशी प्रोटीन और एस-फ्लोरोप्रोलाइन और डिहाइड्रोप्रोलाइन-असर वेरिएंट घुलनशील अंशों में पाए गए थे।तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में, एस-फ्लोरोप्रोलाइन के साथ प्रत्येक प्रोलाइन प्रतिस्थापन ने प्रोलाइन अवशेषों के प्रति सकारात्मक 18-डाल्टन शिफ्ट का उत्पादन किया, जबकि डिहाइड्रोप्रोलाइन के साथ प्रतिस्थापन ने प्रति अवशेष दो डाल्टन के नकारात्मक बदलाव का उत्पादन किया। प्रकाश अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में, क्रोमोफोर अवशोषण ईजीएफपी के लिए 488 नैनोमीटर और नोजीएफपी के लिए 493 नैनोमीटर पर पाया गया था। KillerOrange में, क्रोमोफोर अवशोषण क्षेत्र में जटिल क्रोमोफोर के दो संभावित कॉन्फ़िगरेशनल और चार्ज राज्यों के अनुरूप दो बैंड शामिल थे।इसके अलावा, प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा इसी अधिकतम absorbance तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजना पर दर्ज किया गया निहित है कि analogues क्रोमोफोर के रासायनिक वातावरण को नहीं बदला. Refolding प्रयोगों में, देशी EGFP क्रोमोफोर प्रतिदीप्ति आंशिक रूप से ठीक हो गया, हालांकि ट्रिप्टोफैन-विशिष्ट प्रतिदीप्ति renaturation के बाद बड़ा था। इसी तरह का व्यवहार डिहाइड्रोप्रोलाइन युक्त संस्करण के लिए देखा गया था।ईजीएफपी युक्त एस-फ्लोरोप्रोलिन में, 295-नैनोमीटर उत्तेजना के साथ एक समान परिणाम देखा गया था, जबकि प्रतिदीप्ति 488 नैनोमीटर पर बहुत अधिक हद तक ठीक हो गई थी। केवल ईजीएफपी वेरिएंट ने क्रोमोफोर उत्सर्जन की तुलना में ट्रिप्टोफैन उत्सर्जन वसूली के साथ तेजी से रीफोल्डिंग कैनेटीक्स दिखाया। उपयुक्त विकास मीडिया के साथ ताजा जीवाणु संस्कृतियों का उपयोग किया जाना चाहिए।बाँझ तकनीकों और संस्कृति के विकास की नियमित निगरानी भी प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण शर्तें हैं। यह विधि प्रोटीन इंजीनियरिंग पर लागू होती है, क्योंकि यह अन्य विहित अमीनो एसिड की भूमिका का अध्ययन करने की अनुमति देती है। इसके लिए, उपयुक्त auxotrophic ई.कोलाई उपभेदों और अमीनो एसिड analogues की आवश्यकता होती है।पूरे प्रोटीन के मास स्पेक्ट्रोमेट्री को गैर-विहित अमीनो एसिड एनालॉग्स के निगमन की पुष्टि करने के लिए विश्लेषणात्मक साक्ष्य के रूप में आवश्यक है। प्रोलाइन एनालॉग्स को शामिल करने के लिए एसपीआई विधि हमें सीधे प्रोटीन बैकबोन में हेरफेर करने की अनुमति देती है, और तर्कसंगत डिजाइन के लिए लाभ प्रदान करती है और वैश्विक स्थिरीकरण और राइबोसोमल अनुवाद या तह के सुधार के माध्यम से प्रोटीन के उत्पादन की सुविधा प्रदान करती है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

बायोलॉजिकल सिस्टम में आयन एकाग्रता के मापन के लिए प्रतिदीप्त नैनोकणों

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

विद्युत रासायनिक डीएनए Biosensors के न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन और छोटे अणुओं के Reagentless पता लगाने के लिए निर्माण कार्य

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

नकारात्मक दाग EM द्वारा प्रोटीन और macromolecular परिसर Visualizing: ग्रिड तैयारी से छवि अधिग्रहण के लिए

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

तह प्रोटीन के अध्ययन के लिए microfluidic Mixers

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Parametrized डायस्टोलिक भरने रीतिवाद के माध्यम से Transmitral फ्लो की विज्ञान सम्बन्धी मॉडलिंग आधारित विश्लेषण द्वारा ग्लोबल डायस्टोलिक समारोह की मात्रा

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Endosomolytic अभिकर्मक dfTAT साथ ऊष्मायन द्वारा जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, पेप्टाइड या सेल अभेद्य छोटे अणुओं की डिलिवरी

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

विलय juxtaposed आयन एक्सचेंज झिल्ली के बीच आयन एकाग्रता ध्रुवीकरण ध्रुवीकरण जोन का प्रचार करने के लिए ब्लॉक

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; अंग संस्कृति म्यूरीन intervertebral डिस्क के मॉडल

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

उपास्थि और त्वचा ऊतक Bioink Precellularization के लिए एक उपंयास निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक के उपयोग के अनुरूप का मुद्रण

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...