Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

이 연구는 독일 연구 재단 (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis")이 T.F. 및 N.B.에 지원하고 연방 교육 과학부 (BMBF 프로그램 "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio)가 F.-J.S.에 지원했습니다. 및 T.M.T.T.

저자는 모든 이해 상충을 공개합니다.

자연에서, 단백질 구조 및 기능을 이용한 조작은 전형적으로 돌연변이, 단백질 서열의 특정 위치에서 아미노산 동일성의 교환으로 이어지는 현상으로 인해 발생한다. 이 천연 메카니즘은 돌연변이 유발의 형태로 단백질 공학을위한 생명 공학 방법으로 널리 적용되며, 과정에 관련된 20 개의 표준 아미노산의 레퍼토리에 의존합니다. 그러나 프롤린 잔기의 교환은 문제가 있습니다. 그것의 특별한 백본 그룹 구조로 인해, 그것은 대체72를 위해 나머지 19 개의 잔류 물과 거의 교환 할 수 없다. 예를 들어, 프롤린은 전형적으로 가장 일반적인 이차 구조, 즉 α나선 및 β-가닥과의 불량한 상용성 때문에 폴리펩티드 서열에서 이차 구조 차단기로 알려져 있다. 이러한 프롤린 특징은 잔기가 공통 레퍼토리로부터 다른 아미노산으로 돌연변이될 때 쉽게 소실된다. 프롤린을 화학적 유사체로 대체하는 것은 부모 프롤린 잔기의 기본 골격 특징을 유지하면서 특정 형태 전이에 편향을 가하거나 분자 부피 및 극성의 변조를 생성 할 수있는 대안적인 접근법을 제공합니다. 예를 들어, 박테리아 배양물에 히드록시-, 플루오로-, 알킬-, 데하이드로프롤린, 가변 고리 크기를 갖는 구조 등과 같은 유사체 구조를 공급할 수 있고, 따라서 특정 프롤린 잔기 변경을 함유하는 단백질의 생산을 용이하게 할 수 있다.
본 연구에 기술된 선택적 압력 혼입 (SPI) 방법은 글로벌, 즉 표적 단백질 내의 모든 프롤린을 관련 화학적 유사체로 잔기 특이적 대체를 허용한다. 이 방법의 중요성은 SPI가 일반적인 돌연변이 유발 기술에 접근 할 수없는 서열 변화를 생성 할 수 있다는 사실에 의해 반영됩니다. 예를 들어, 본 연구에서 입증된 바와 같이, 전형적으로 하나 또는 두 개의 원자 대체/결실/추가를 초과하지 않을 수 있는 다소 작은 구조적 변화를 함유하는 표적 단백질의 생산을 허용한다. 이러한 단백질 변형은 "원자 돌연변이"73,74라고 불린다. GFP와 같은 형광 단백질에서, 이러한 분자 침입의 결과는 폴딩 속도, 국소 극성, 단백질 패킹, 관련된 구조적 특징의 안정성에서 알 수 있다. 흡광도 및 형광 특성의 변화는 단백질 폴딩 및 잔류 미세 환경에 미치는 영향으로 인해 간접적으로 생성됩니다. SPI에 의해 수행되는 분자 변화의 정밀도는 일반적으로 다른 정준 잔기에 대한 프롤린의 돌연변이와 비교하여 훨씬 높으며, 후자는 일반적으로 단백질 폴딩, 생산 및 단리에 해롭다.
생산 방법으로서, SPI 접근법은 천연 아미노산의 화학적 유사체에 대한 아미노아실-tRNA 신테타제 포켓의 기질 내성을 이용한다. 신테타제는 아미노산 구조의 정확한 식별을 담당하며, 단백질로의 혼입은 번역 과정에서 하류에서 발생합니다. 도구적으로, SPI에서의 단백질 생산, 단리 및 정제는 임의의 다른 재조합 단백질 발현 기술에 전형적인 방식으로 수행되고; 그러나 다음과 같이 프로토콜에 몇 가지 추가 사항이 있습니다 : 대체를 위해 묶여있는 프롤린은 발효 과정의 시작 부분에 제공되어 세포가 성장하고 손상되지 않은 세포 기계를 개발할 수 있도록합니다. 그러나, 세포 배양물은 최대 광학 밀도에 도달하는 것이 허용되지 않으며, 세포 단백질을 발현에 최적으로 대수 단계로 유지한다. 이 시점에서 SPI 방법에는 두 가지 주요 변형이 있습니다. 첫 번째로, 프롤린의 농도는 초기 성장 배지 (화학적으로 정의 된 배지)에서 조정되어 프롤린의 고갈이 외부 침입없이 발생합니다. 세포는 대수 성장 단계를 종료하기 전에 배지에서 프롤린을 배출한 다음, 이어서 아날로그가 첨가되고, 관심있는 단백질 생산이 유도된다. 상기 방법의 두 번째 버전에서, 세포는 그들의 대수 단계의 중간까지 프롤린을 함유하는 배지에서 성장한다. 이 시점에서, 세포는 꺼내어 더 이상 프롤린을 함유하지 않는 다른 배지로 물리적으로 옮겨져야하며, 관심있는 단백질의 후속 유도와 함께 유사체 만 함유해야합니다. 두 버전 모두에서, 유사체 및 단백질 유도 시약은 미리 성장된 세포에 제공된다. 야생형 단백질의 단리 및 정제는 변이체에 대한 것과 동일한 방식으로 수행된다. 원칙적으로, 모든 이용가능한 프로영양영양 균주가 발현 숙주로서 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고 가장 적합한 호스트를 식별하기위한 표현식 테스트가 권장됩니다. 또한, 화학적으로 정의된 상이한 배지의 시험은 단백질 수율을 최적화하는데 사용될 수 있다.
용해도 및 농도와 같이 SPI에 대해 고려해야 할 화학 유사체에 관한 특정 요구 사항이 있습니다. 아미노산의 대사 가용성 및 흡수는 배지 내의 용해된 분자의 수에 의존한다. 특정 화합물의 용해도를 증가시키기 위해, 약산성 또는 알칼리성 조건이 선택될 수 있다. 인공 분자는 세포 독성으로 인해 성장 억제 효과를 일으킬 수 있기 때문에, 세포 스트레스(75)를 피하기 위해 농도를 최소한으로 낮추어야 한다.
SPI의 사소한 약점은 교환해야 할 포지션 수가 많을수록 통합 효율성이 떨어진다는 것입니다. 원칙적으로, 부위 지향적 돌연변이유발에 의한 표적 생체분자 내 아미노산 주파수의 감소는 이러한 문제를 해결할 수 있다. 그러나, 원하는 단백질의 구조적 및 기능적 특성은 일차 구조를 변경함으로써 영향을 받을 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, SPI는 정준 아미노산의 잔기-특이적 치환을 허용한다. 이는 비-정준 아미노산이 단백질 기능 또는 폴딩에 필수적으로 필수적인 보존된 잔기를 포함하여 표적 단백질 내의 정준 아미노산의 모든 위치에 삽입된다는 것을 의미한다. 사이트 별 통합을위한 대안적인 방법은이 문제를 극복 할 수있는 유일한 가능성입니다3. 지난 수십 년 동안, 미리 정의된 부위에서 변형된 잔기를 함유하는 단백질을 생산할 수 있는 직교 쌍 방법이 개발되었다. 이 방법의 가장 일반적인 변형은 정지 코돈 억제로 알려져 있다. 이 방법은 합성 아미노산(76)의 부위-특이적 혼입을 위해 전용된 조작된 직교 번역 시스템에 기초한다. 상이한 측쇄 변형을 갖는 200개 이상의 아미노산이 이 접근법77을 사용하여 현재까지 단백질에 혼입되었다. 그러나, 이들 번역 시스템은 여전히 표적 단백질 내로의 프롤린 유사체의 삽입에 적합하지 않다. 더욱이, 아미노아실-tRNA 신테타제의 일부 배경 난잡함이 전형적으로 조작된 번역 시스템에 남아 있기 때문에 이 방법의 성능은 경미한 아미노산 변형의 경우에 낮은 것으로 간주된다.
SPI를 사용하여 우리는 많은 β 배럴 형광 단백질 변이체를 생산하고 프롤린과 비천연 유사체의 교환 결과를 연구했습니다. 프롤린을 R-Flp 및 Dfp로 대체하는 경우, 발현 숙주에 의해 기능장애 단백질이 생성되었다. 이 효과는 단백질 미스폴딩에 의해 생성 될 가능성이 큽니다. 후자는 R-Flp에 의해 촉진된C4-엑소오스 입체형태로부터 기원할 수 있으며, 이는 모 단백질 구조(27)에 의해 바람직하지 않다. Dfp의 경우, 미스폴딩은 프롤린 잔기27에서의 트랜스-시스 펩티드 결합 이성체화의 감소된 속도에 의해 생성될 가능성이 있다. 후자는 β-배럴 형성 및 후속 발색단 성숙에 영향을 미치는 단백질 폴딩의 동역학적 프로파일에서 제한 단계 중 하나로 알려져 있다. 실제로, 두 아미노산, R-Flp 및 Dfp 모두에 대해, 단백질 생산은 응집되고 불용성인 단백질을 초래했다. 결과적으로, 발색단 형성은 일어날 수 없었고, 형광은 완전히 소실되었다. 그러나 S-Flp 및 Dhp에서는 적절한 단백질 성숙이 관찰되어 각 유사체 / 단백질 조합에 대한 형광 단백질 샘플이 생성되었습니다. 단백질의 흡광도 및 형광 특징에서 약간의 조절에도 불구하고, 이들은 대체로 야생형 단백질의 그것과 유사하게 남아있었다. 아미노산 치환의 효과는 리폴딩 동역학 연구에서 밝혀졌다. 후자는 S-Flp로 대체하는 경우에 더 빠른 리폴딩을 나타냈다. 모델 연구는 이 잔기가 트랜스-시스티아미드 회전 속도에서 약간의 개선을 발생시키고C4-엔도입체형성의 형성을 유도할 수 있음을 보여주었다. 이 두 인자 모두 EGFP에서 이 잔기의 유익한 동역학적 효과에 기여할 가능성이 높다. 대조적으로, DHP는 모 단백질과 최대로 유사한 운동 폴딩 프로파일을 생성하였다. 조사된 형광 단백질에서 단순한 원자 돌연변이에 의해 생성된 결과의 다양성은 표적 단백질 특성을 변화시키는 SPI 생산 방법의 잠재력을 보여준다. 프롤린을 유사체로 대체함으로써 유도되는 단백질 변경은 효소78,79,80 및 이온 채널 81,82의 엔지니어링뿐만 아니라 단백질 안정성의 일반적인 엔지니어링에도 추가적인 영향을 미칩니다.
SPI 방법의 기본 한계는 프롤린을 교환하는 데있어 "모두 또는 없음"모드가 관련 아날로그와 상주한다는 것입니다. 어떤 프롤린 잔기를 유사체로 대체해야 하는지, 어떤 프롤린 잔기가 변형되지 않은 상태로 유지되어야 하는지를 정확하게 선택할 수 있다는 것이 큰 이점일 것이다. 그러나, 현재, 미생물 생산 숙주를 이용하여 이러한 정교한 생산을 수행할 수 있는 기술은 없다. 단백질 83,84의 화학적 합성과 무세포 생산85,86은 위치 특이적 프롤린 변형을 생산할 수 있는 두 가지 대안적인 방법이다. 그럼에도 불구하고, 그들의 운영 복잡성과 낮은 생산 수율은 살아있는 세포에서의 생산에 비해 열등하게 만듭니다. 현재 SPI는 원자 돌연변이를 지닌 복잡한 단백질을 생산하기 위한 가장 조작적으로 간단하고 강력한 접근 방식으로 남아 있습니다. 비천연 아미노산 대체물을 도입함으로써, 이 방법은 프롤린 치환에 의해 생성된 형광 단백질의 폴딩 및 광 흡수/방출의 변경에 의해 여기에서 예시된 바와 같이 표적화된 방식으로 단백질 특징을 변형시킬 수 있다.

고전적 부위-지시된 돌연변이유발은 DNA 수준에서 코돈 조작에 의해 임의의 기존 유전자-코딩된 단백질 서열의 순열을 허용한다. 단백질 폴딩 및 안정성을 연구하기 위해, 유사한 아미노산을 유사한 대응물로 대체하는 것이 종종 바람직하다. 그러나 전통적인 단백질 돌연변이 유발은 Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe와 같은 표준 유전자 코드 레퍼토리에 존재하는 정식 아미노산 간의 구조적으로 유사한 대체로 확실히 제한됩니다. 한편, Trp, Met, His, 또는 Pro와 같은 다른 정준 아미노산에 대해서는 그러한 가능성이 없으며, 이는 종종 단백질1에서 필수적인 구조적 및 기능적 역할을 한다. 단백질의 고도로 특정한 내부 구조 및 이들의 폴딩 과정의 맥락에서 이러한 상호작용을 연구하는 이상적인 접근법은 비파괴적 등염색 변형을 생성하는 것이다. 실제로, 비정준 아미노산(ncAAs)이라고도 알려진 이러한 정준 아미노산의 등멸균 아미노산 유사체가 단백질에 삽입될 때, 이들은 "원자 돌연변이"2로 알려진 H/F, CH2/S/Se/Te와 같은 단일 원자 또는 원자 그룹의 수준에서도 미묘한 변화를 허용한다. 이러한 "분자 수술"은 단일 원자 또는 원자 그룹의 교환만으로 인한 성질을 가진 변경된 단백질을 생산하며, 유리한 경우에는 분석 할 수 있으며 검출 된 변화를 합리화 할 수 있습니다. 이런 식으로, 단백질 폴딩 및 구조를 연구하기 위한 단백질 합성의 범위는 고전적인 DNA 돌연변이유발을 훨씬 넘어서 확장된다. 부위 지향 돌연변이 유발에 의해 생성된 단백질은 일반적으로 "돌연변이"로 지칭되는 반면, 치환된 정준 아미노산을 갖는 단백질은 "변이체" 3, "동종 단백질"4 또는 "단백질 동족체"5로 지칭된다.
해양 생물 Aequorea victoria에서 처음 확인 된 녹색 형광 단백질 (GFP)은 자외선에서 청색광까지 노출 될 때 밝은 녹색 형광을 나타냅니다 6,7. 오늘날 GFP는 형광 현미경을 통해 세포에서 유전자 발현 및 단백질 국소화의 일상적인 시각화를위한 매우 민감한 표지 도구로 일반적으로 사용됩니다. GFP는 또한 다양한 생물 물리학 8,9,10 및 생물 의학 11,12 연구뿐만 아니라 단백질 공학 13,14,15에서 유용하다는 것이 입증되었습니다. GFP 구조의 엄격한 분석은 다양한 안정성 및 형광 최대16,17을 특징으로 하는 수많은 변이체의 생성을 가능하게 하였다. 세포 및 분자 생물학에 사용되는 GFP 변이체의 대부분은 용액 및 결정18 내의 단량체 단백질이다. 그들의 주요 구조 조직은 계통 발생 기원과 관계없이 GFP 패밀리의 모든 구성원에게 전형적이며 소위 β 배럴을 형성하는 11 개의 β 가닥으로 구성되며 꼬인 α나선은 배럴의 중심을 통과하여 발색단을 지니고 있습니다 (그림 1A). 발색단의 자가 촉매 성숙 (그림 1B)은 단백질의 중앙 위치에서 그것을 둘러싼 측쇄의 정확한 위치를 필요로합니다. 이들 측쇄 중 다수는 다른 GFP 변이체(19)에서 고도로 보존된다. Aequorea victoria와 같은 해파리의 대부분의 형광 단백질에서 녹색 방출 발색단은 Tyr66의 페놀 고리와 이미다졸리논의 다섯 원 헤테로 고리 구조를 포함한 두 개의 방향족 고리로 구성됩니다 (그림 1B). 발색단은 단백질 매트릭스에 적절하게 매립 될 때 전체 단백질의 특징적인 형광을 담당합니다. 이는 구조물의 중앙에 위치하는 반면, 배럴 구조는 그것을 수성 매질(20)로부터 절연시킨다. 벌크 물에 발색단의 노출은 형광 담금질, 즉 형광21의 손실을 초래할 것이다.
배럴형 구조의 적절한 폴딩은 형광 담금질(22)으로부터 발색단을 보호하는 데 필수적이다. 프롤린(Pro) 잔기는 GFP23의 구조 조직에서 특별한 역할을 한다. β 가닥을 지원할 수 없기 때문에, 그들은 전체적으로 단백질 구조를 유지하는 책임이있는 연결 루프를 구성합니다. 놀랍지 않게도, 10-15개의 프롤린 잔기는 Aequorea- 및 Anthoathecata-유래 GFP 둘 다에서 발견된다; 그들 중 일부는 다른 유형의 형광 β 배럴 단백질에서 고도로 보존됩니다. 프롤린은 독특한 기하학적 특성으로 인해 접이식 특성에 중대한 영향을 줄 것으로 예상됩니다. 예를 들어, 아에쿠레아 유래 GFPs에서, 열 개의 프롤린 잔기 (도 2A) 중에서, 아홉 개의 형태는 트랜스-펩티드 결합 (Pro89)을 형성하고, 오직 하나만이 시스-펩티드 결합을 형성 한다 (Pro89). Pro58은 필수적이며, 즉, 나머지 19개의 표준 아미노산과 교환할 수 없습니다. 이 잔기는 Trp57 잔기의 정확한 포지셔닝을 담당할 수 있으며, 이는 발색단 성숙 및 전체 GFP 폴딩24에 결정적이라고 보고되었다. 세 개의 프롤린 잔기 (Pro54, Pro56, Pro58) 및 Trp57을 갖는 PVPWP 단편은 도 1A로부터의 GFP 구조에서 "하부 뚜껑"의 필수적인 부분이다. PVPWP 구조 모티프는 시토크롬 및 진핵 전압-활성화된 칼륨 채널(25)과 같은 몇몇 단백질에서 발견된다. 위치 75 및 89에서의 프롤린-알라닌 치환은 또한 단백질 발현 및 폴딩 및 발색단 성숙을 폐지하는데 해롭다. Pro75 및 Pro89는 발색단을 매장하는 "상부 뚜껑"의 일부이며(도 1A), 11가닥 β-배럴 형광 단백질(23)에 걸쳐 보존된다. 이들 두 개의 "뚜껑"은 안정한 삼차 구조가 부분적으로 파손된 경우에도 수성 용매로부터 발색단을 배제하도록 유지한다(26). 이러한 특정 분자 구조는 예를 들어, 물, 산소, 또는 다른 확산성 리간드에 의해, 충돌(dynamic) 형광 소광으로부터 형광단을 보호한다.
GFP 구조의 분자 공학을 수행하기 위해서는 단백질의 일차 구조에 아미노산 치환을 도입해야합니다. GFP에서 수많은 돌연변이가 수행되어 높은 안정성, 빠르고 신뢰할 수 있는 폴딩 및 가변 형광 특성을 갖는 변이체를 제공하였다17. 그럼에도 불구하고, 대부분의 경우, 프롤린 잔기의 돌연변이는 나머지 19개의 정준 아미노산 중 어느 것도 프롤린 잔기27의 형태적 프로파일을 적절하게 복원할 수 없다는 사실 때문에 위험한 접근법으로 간주된다. 따라서, 프롤린 잔기가 프롤린 유사체28로 불리는 다른 프롤린-기반 구조로 대체되는 대안적인 접근법이 개발되었다. 독특한 순환 화학 구조로 인해 프롤린은 두 가지 특징적인 형태 전이를 나타냅니다 (그림 1C) 프롤린 링 퍼커링, 주로 φ 비틀림 각도에 영향을 미치는 백본의 조직을 수반하는 빠른 공정 및 2) 펩티드 결합 시스 / 트랜스 이성체화, ω 비틀림 각도를 통해 백본 폴딩에 영향을 미치는 느린 프로세스. 느린 특성으로 인해, 후자의 전이는 일반적으로 전체 단백질의 폴딩 과정에서 속도 제한 단계를 담당합니다. 일부 프롤린 잔기 주위의 펩티드 결합 시스/트랜스 이성체화는 GFP 변이체의 폴딩에서 느린 단계를 특징으로 한다는 것이 이전에 입증되었다. 예를 들어, Pro89에서 시스-펩티드 결합의 형성은 트랜스에서 시스29로의 결합 전이에 의존하기 때문에 폴딩 과정에서 느린 단계를 특징으로 한다. Pro89를 모든 트랜스 펩티드 루프로 대체한 후, 즉 시스-트랜스 이성체화 이벤트(30)를 폐지함으로써 더 빠른 재폴딩이 달성될 수 있다. 시스/트랜스 이성체화 이외에도, 퍼커 전이는 또한 백본 조직 및 단백질 내부27,31 내의 패킹으로 인해 단백질 폴딩에 심오한 변화를 일으킬 수 있다.
화학적 변형은 프롤린 잔기의 본질적인 형태적 전이의 변화를 초래하여, 단백질의 접는 능력에 영향을 미친다. 특정 프롤린 유사체는 폴딩 특성의 조작 및 연구를 허용하기 때문에 단백질에서 프롤린 치환에 특히 매력적인 후보이다. 예를 들어, (4R)-플루오로프롤린 (R-Flp), (4S)-플루오로프롤린 (S-Flp), 4,4-디플루오로프롤린 (Dfp), 및 3,4-데히드로프롤린 (Dhp)은 분자 부피 및 극성32 모두에서 프롤린과 최소한으로 상이한 4개의 유사체 (도 1D)이다. 동시에, 각 아날로그는 뚜렷한 고리 퍼커링을 나타낸다: S-Flp는 C4-엔도퍼커를 안정화시키고, R-Flp는C4-엑소퍼커를 안정화시키고, Dfp는 명백한 퍼커 선호도를 나타내지 않으며, Dhp는 퍼커링을 폐지한다(도 1D)33). 단백질 구조에서 이들 유사체를 사용함으로써, 프롤린 잔기의 형태적 전이와 함께 조작할 수 있고, 이것으로 생성된 GFP 변이체의 특성에 영향을 미친다.
이 작업에서, 우리는 선택적 압력 혼입 방법 (SPI, 그림 3)34를 사용하여 GFP 변이체의 구조에 지정된 프롤린 유사체 세트 (그림 1D)를 통합하기 시작했습니다. 아미노산 잔기를 가장 가까운 등구조 유사체로 대체하는 것은 단백질 설계35,36에 적용된 생명공학적 개념이다. 따라서, 모델 단백질에서 프롤린 유사체의 효과는 단백질 공학37에서 도구로서 기능할 수 있는 그들의 잠재력을 예시한다. 목적하는 유사체를 함유하는 단백질의 생산은 프롤린(proline-auxotrophy)을 생산할 수 없는 변형된 대장균 균주에서 수행되었다. 따라서, 그들은 단백질 생합성(38)의 과정에서 기질의 대체를 수용하도록 강요될 수 있다. 프롤린의 이러한 글로벌 치환은 내인성 아미노아실-tRNA 신테타제39의 천연 기질 유연성에 의해 활성화되며, 이는 tRNA와 적절한 아미노산(40)의 에스테르화를 촉매하는 핵심 효소이다. 일반적으로, 도 3에 요약된 바와 같이, 세포 성장은 중간 대수 성장 단계에 도달할 때까지 정의된 배지에서 수행된다. 다음 단계에서, 대체될 아미노산은 발효 동안 발현 시스템으로부터 세포내 고갈되고, 이어서 원하는 유사체 또는 ncAA에 의해 교환된다. 표적 단백질 발현은 이어서 잔기 특이적 비-정준 아미노산 혼입을 유도한다. 동족 아미노산을 그의 유사체로 치환하는 것은 프로테옴 넓은 방식으로 일어난다. 이러한 부작용이 숙주 균주의 성장에 부정적인 영향을 미칠 수 있지만, 표적 단백질 생산의 질은 대부분 영향을 받지 않는데, 이는 재조합 발현에서, 세포 자원이 주로 표적 단백질41,42의 생산에 지시되기 때문이다. 따라서, 엄격하게 조절된, 유도성 발현 시스템 및 강력한 프로모터는 높은 혼입 효율(43)에 결정적이다. 우리의 접근법은 센스 코돈 (센스 코돈 재할당)에 응답하여 ncAAs의 다중 잔기 특이적 혼입에 기초하며, 이에 의해 표적 유전자 내에서, 프로 아날로그 삽입을 위한 위치의 수는 부위-지향 돌연변이유발44를 통해 조작될 수 있다. 항균 특성을 갖는 재조합 펩티드의 제조에 관한 우리의 이전 보고서(45)에도 유사한 접근법이 적용되었다. 이 작업에서는 모든 프롤린 잔기를 관련 유사체로 대체 할 수있는 SPI 방법을 적용하여 정준 아미노산 레퍼토리로 합성 된 단백질에 존재하지 않는 뚜렷한 물리 화학적 특성을 가질 것으로 예상되는 단백질을 생성합니다. 결과 변이체의 폴딩 및 형광 프로파일을 특성화함으로써, 우리는 GFP의 변이체에서 원자 치환의 효과를 보여주는 것을 목표로합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

나머지 19개의 정준 아미노산 중 어느 하나에 의한 전통적인 부위 지향 돌연변이유발에 의한 단백질 내의 프롤린(Pro) 잔기의 대체는 종종 단백질 폴딩 및 특히 녹색 형광 단백질 및 관련 변이체에서의 발색단 성숙에 해롭다. 합리적인 대안은 모든 Pro 잔기가 유사체에 의해 특이적으로 잔기 로 대체되도록 단백질의 번역을 조작하는 것인데, 이는 선택적 압력 혼입 (SPI)으로 알려진 방법이다. 내장 된 화학적 변형은 측정 가능한 변화를 미세하게 해부하거나 다른 단백질 특성을 합리적으로 조작하는 일종의 "분자 수술"로 사용될 수 있습니다. 여기에서이 연구는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 스펙트럼 변이체의 전형적인 β 배럴 구조의 조직에서 프롤린의 역할을 연구하는 SPI 방법의 유용성을 보여줍니다 : 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP), NowGFP 및 KillerOrange. 프로 잔기는 개별 β-가닥 사이의 연결 섹션에 존재하며 배럴 스캐폴드의 폐쇄 뚜껑을 구성하며, 따라서 물로부터의 발색단의 절연, 즉 형광 특성을 담당한다. 선택적 압력 혼입 실험은 (4R)-플루오로프롤린 (R-Flp), (4S)-플루오로프롤린 (S-Flp), 4,4-디플루오로프롤린 (Dfp), 및 3,4-데하이드로프롤린 (Dhp)을 발현 숙주로서 프롤린-영양영양 대장균 균주를 사용하여 수행하였다. 우리는 S-Flp 및 Dhip를 가진 형광 단백질이 활성 (즉, 형광)인 반면, 다른 두 유사체 (Dfp 및 R-Flp)는 기능 장애, 잘못 접힌 단백질을 생성한다는 것을 발견했습니다. UV-Vis 흡수 및 형광 방출 프로파일의 검사는 Pro 유사체를 함유하는 단백질에서 거의 특징적인 변화를 보이지 않았다. EGFP 변이체에서 폴딩 동역학 프로파일의 조사는 S-Flp의 존재하에 가속화된 리폴딩 과정을 보인 반면, 그 과정은 Dhp를 함유하는 단백질에서 야생형과 유사하였다. 이 연구는 관심있는 다른 단백질의 연구에 채택 될 수있는 원자 수준에서 단백질 잔기의 미묘한 변형을 생성하는 SPI 방법 ( "분자 수술")의 능력을 보여줍니다. 이는 β-배럴 형광 단백질의 부류에서 폴딩 및 분광학적 특성에 대한 근접한 화학적 유사체를 사용한 프롤린 대체의 결과를 예시한다.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

고전적 부위-지시된 돌연변이유발의 한계를 극복하기 위해, 특이적 변형을 갖는 프롤린 유사체를 몇몇 형광 단백질에 혼입시켰다. 우리는 수소를 불소로 대체하거나 프롤린 잔기의 이중 결합에 의한 단일 ( "분자 수술")이 접힘 및 빛과의 상호 작용을 포함한 근본적인 단백질 특성에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다.

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

대부분의 경우, 통상적인 부위-지시된 돌연변이유발은 단백질에서 프롤린의 기능적 역할을 연구하기에 적절하지 않다. 여기에서, 우리는 단백질 폴딩 및 기능에 대한 프롤린 잔기의 역할을 조사하기 위해 비정준 아미노산으로서 프롤린 유사체를 리보솜으로 합성된 단백질에 통합하는 방법을 제시한다. 프롤린을 표준 아미노산으로 대체하는 것은 위험한 접근법입니다.프롤린 유사체의 혼입은 일종의 분자 수술을 허용합니다. 즉, 단백질 특성에 합리적으로 영향을 미치고 조작하기 위해 미묘한 분자 변화를 도입합니다. 프롤린 잔기는 단백질 스캐폴드의 안정성에 필수적인 역할을하기 때문에 우리의 기술은 인간의 특정 병리학 적 상태의 기초가되는 단백질 폴딩 결핍의 원인을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.프롤린 대체에 의해 유도되는 단백질 변경은 효소의 생명 공학 공학에 영향을 미치고 리보솜 단백질 번역 또는 폴딩의 향상을위한 기회를 제공합니다. 이 방법은 특별한 장비와 값 비싼 계측이 필요하지 않습니다. 프롤린 유사체를 첨가하기 전에 천연 프롤린이 E.coli 배양물에서 고갈되는 프로토콜 단계에 특별한주의를 기울여야합니다.천연 프롤린을 사용한 형광 단백질의 생산을 시작하기 위해, 200 밀리리터의 신선한 NMM 배지를 2리터 삼각 플라스크에 2밀리리터의 밤새 배양물로 접종한다. 세포를 섭씨 37도에서 약 3.5시간 동안 220RPM의 오비탈 진탕기에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 동안, 30분마다 분광광도계에서 600나노미터에서 광학 밀도를 측정한다.광학 밀도가 0.7에 도달하면 세포 현탁액을 스핀 다운하고 상층액을 폐기물로 부드럽게 떨어 뜨립니다. 이어서, 프롤린 없이 아미노산 또는 NMM이 없는 50밀리리터의 빙냉 NMM에 재현탁시켜 세포를 세척한다. 세포를 다시 회전시키고 상청액을 폐기물로 분해하십시오.다음에, 프롤린이 없는 NMM의 200 밀리리터에 온화한 피펫팅에 의해 세포 펠릿을 재현탁시키고, 2리터 삼각 플라스크에서 암피실린으로 보충하고, 프롤린의 완전한 고갈을 허용하도록 30분 동안 오비탈 진탕기에서 세포를 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 50-밀리몰 스톡 용액으로부터 적절한 부피의 L-프롤린 또는 프롤린 유사체를 첨가하여 세포 현탁액 중의 일밀리몰 최종 농도를 얻었다. 다음으로, 일몰 원액으로부터 500-마이크로몰 IPTG를 첨가하여 표적 단백질 발현을 유도한다.표적 단백질을 오비탈 쉐이커에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 발현시키고 다음날 광학 밀도를 측정한다. 원심분리를 통해 박테리아 세포를 수집하고 상층액을 폐기물로 데칸트하십시오. 이어서, 10% 글리세롤을 함유하는 결합 완충액 50 밀리리터에 조심스럽게 피펫팅함으로써 세포를 세척한다.세포를 다시 회전시키고, 상청액을 데칸트하고, 추가로 사용할 때까지 영하 20 또는 80도에서 50밀리리터 튜브에 세포 펠릿을 저장한다. 형광 방출을 평가하기 전에 SDS-PAGE를 수행하여 샘플 순도가 95% 이상인지 확인한 다음 정제된 각 단백질 변이체의 샘플을 0.3 마이크로몰의 농도로 조정하고 적절한 파장에서 계산된 흡광도 값을 기준으로 취합니다. 대략적인 최종 샘플 부피가 200 마이크로리터인지 확인하십시오.희석된 샘플이 실온에서 평형화되게 한다. 한 시간 후, 샘플을 일센티미터 석영 큐벳으로 옮기고 형광 분광계를 사용하여 샘플의 형광 방출 스펙트럼을 측정하였다. 변성을 유도하기 위해, 8.89몰 우레아 및 5.56-밀리몰 DTT를 함유하는 1.11X PBS 완충액의 18 마이크로리터에 300-마이크로몰 샘플의 두 마이크로리터를 첨가함으로써 각 단백질 변이체의 샘플을 20배 희석한다.샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 5밀리몰 DTT를 함유하는 PBS 1,980 마이크로리터를 첨가하여 샘플을 100배 희석하여 렌처레이션을 유도하고, 즉시 200 마이크로리터의 샘플을 1센티미터 석영 큐벳으로 옮긴다. 석영 큐벳을 적절한 형광 분광계에 삽입하고 30분에 걸쳐 3초마다 형광 스펙트럼을 획득하여 단백질 재접힘을 모니터링합니다.재접힘 샘플을 1.5밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴 다음, 뚜껑을 닫고 샘플을 어둠 속에서 실온에서 보관하여 EGFP 변이체의 완전한 재접힘을 허용한다. 24시간 후, 형광 회수의 시간적 종점을 포착하기 위해 이전과 동일한 여기 파장을 사용하여 리폴딩된 단백질 샘플의 형광 방출을 측정하였다. 천연 단백질을 발현하는 세포로부터의 펠릿 및 S-플루오로프롤린 및 데하이드로프롤린을 지닌 변이체는 무손상 발색단으로 인해 전형적인 밝은 색을 가졌다.대조적으로, R-플루오로프롤린 및 디플루오로프롤린을 함유하는 변이체는 무색으로 남아있었고, 이는 봉입체에서 펼쳐진 단백질의 미스폴딩 및 침착을 나타낸다. SDS-PAGE 분석은 불용성 R-플루오로프롤린 함유 단백질의 존재를 검증하였다. 대조적으로, 천연 단백질 및 S-플루오로프롤린 및 데히드로프롤린-함유 변이체는 가용성 분획에서 발견되었다.액체 크로마토그래피/질량 분광법 분석에서, S-플루오로프롤린을 사용한 각각의 프롤린 대체는 프롤린 잔기 당 양의 18-달톤 시프트를 생성하고, 데하이드로프롤린으로 대체하면 잔류물 당 두 달톤의 음의 이동이 생성되었다. 광 흡수 및 방출 스펙트럼에서, 발색단 흡광도는 EGFP의 경우 488 나노미터, NowGFP의 경우 493 나노미터에서 발견되었다. KillerOrange에서 발색단 흡광도 영역은 복합 발색단의 두 가지 가능한 구성 및 전하 상태에 해당하는 두 개의 밴드로 구성되었습니다.또한, 상응하는 최대 흡광도 파장에서 여기시 기록된 형광 스펙트럼은 유사체가 발색단의 화학적 환경을 변화시키지 않았다는 것을 암시한다. 리폴딩 실험에서, 천연 EGFP 발색단 형광은 부분적으로 회복되었지만, 트립토판 특이적 형광은 재생 후 더 컸다. 데하이드로프롤린을 함유하는 변이체에 대해 유사한 거동이 관찰되었다.EGFP 함유 S-플루오로프롤린에서, 295 나노미터 여기로 유사한 결과가 관찰된 반면, 형광은 488 나노미터에서 훨씬 더 높은 정도로 회복되었다. EGFP 변이체만이 트립토판 방출 회수가 발색단 방출에 비해 두 배 빠른 빠른 재접힘 동역학을 보여주었다. 적절한 성장 배지를 갖는 신선한 박테리아 배양물이 사용되어야 한다.멸균 기술과 배양 성장의 정기적 인 모니터링은 또한 실험의 성공을위한 중요한 전제 조건입니다. 이 방법은 다른 표준 아미노산의 역할을 연구 할 수 있기 때문에 단백질 공학에 적용 할 수 있습니다. 이를 위해, 적합한 영양영양 E.coli 균주 및 아미노산 유사체가 필요하다.전체 단백질의 질량 분광법은 비표준 아미노산 유사체의 혼입을 확인하기 위한 분석적 증거로서 요구된다. 프롤린 유사체를 통합하기 위한 SPI 방법은 단백질 백본을 직접 조작할 수 있게 해주며, 리보솜 번역 또는 폴딩의 글로벌 안정화 및 개선을 통해 합리적인 설계 및 단백질 생산 촉진에 이점을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

연구

생체공학

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

생물 학적 시스템에서 이온 농도의 측정을위한 형광 Nanoparticles

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

부정적 얼룩 EM에 의해 단백질과 Macromolecular의 단지를 떠올리 : 그리드 준비에서 이미지 수집

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

단백질 접기 유학을위한 Microfluidic 믹서

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

나란히 이온 교환 멤브레인 사이의 이온 농도 분극을 병합하면 편광 영역의 전파를 차단하는

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...