Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Dette arbeidet ble støttet av Den tyske forskningsstiftelsen (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) til T.F. og N.B. og av Federal Ministry of Education and Science (BMBF Program "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) til F.-J.S. og T.M.T.T.

1. Innføring av uttrykksplasmider i kompetente Pro-auxotrofiske E. coli-celler
<ol><li>Bland 1 ng av hver prøveplasmid, pQE-80L H 6-EGFP, pQE-80L H6-NowGFP, og pQE-80L H6-KillerOrange, med 50 μL kjemisk kompetente eller elektrokompetente celler i pro-auxotrofisk E. coli K12-avledet stamme JM83 (Addgene #50348, eller ATCC #35607) for transformasjon ved varmesjokkmetoden eller elektroporasjon i henhold til protokollene som er tilgjengelige46, 47. MERK: Uttrykksvektoren pQE-80L EGFP-H6 koder et C-terminalt 6xHis-merket forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), uttrykksvektorene pQE-80L H 6-NowGFP og pQE-80L H6-KillerOrange koder en N-terminalt 6xHis-merket NowGFP48 eller en N-terminally 6xHis-tagget KillerOrange49, henholdsvis, hver i en pQE-80L plasmid ryggrad. Alle målgener er under kontroll av en bakteriell T5-promotor regulert av laktoperatøren. Ampicillin motstand ble brukt som en utvalgsmarkør og kolE1 som opprinnelsen til replikasjon. Se materialtabellen for mer informasjon om pQE-80L plasmid. Alternativ Pro-auxotrophic E. coli som stammer fra stammer K-12 og B kan også brukes til uttrykk og bør gi lignende resultater. Den beregnede molekylære massen av H6-merket singly protonated ([M +H]+) wild-type proteiner (etter kromofor modning) er 27,745.33 Da (EGFP- H6), 27,931.50 Da (H 6-NowGFP), og 27,606.09 Da (H6-Killero). De primære strukturene til målproteinene er gitt i tabell 1 (His-tag understreket). Glutaminet (Q) innenfor His-tag-sekvensen til NowGFP ble identifisert ved DNA-sekvensering etter subkloning av NowGFP cDNA mottatt fra Pletnev et al.51 til pQE-80L plasmid. Det hindrer ikke proteinrensing eller egenskapene til det fluorescerende proteinet.</li>
	<li>Gjenopprett cellene i 950 μL SOC medium ved 37 °C i 1 time.</li>
	<li>Spred 50 μL av de gjenvunne cellene på Luria Agar (LA) middels plater (se Tilleggsmateriale) som inneholder glukose (10 g/L) og ampicillin (100 μg/ml).</li>
	<li>Inkuber LA mediumplatene ved 37 °C over natten eller 30 °C i 24 timer.</li>
</ol>2. Produksjon av rekombinante fluorescerende proteiner av vill type (med kanonisk prolin) og prosedyre for selektiv trykkinkorporering (SPI) for å produsere fluorescerende proteiner med prolineanaloger (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)
<ol><li>Nattkultur av Pro-auxotrofisk E. coli K12-avledet stamme JM83 som huser pQE-80L EGFP- H6, pQE-80L H 6-NowGFP og pQE-80L H 6-KillerOrange<ol>
<li>Bruk en steril pipettespiss eller inokulasjonssløyfe for å velge en enkelt koloni fra en LA-mediumplate og resuspender cellene i 5 ml Lysogeny Broth (LB) medium (se Tilleggsmateriale; inneholder 10 g/L glukose, 100 μg/ml ampicillin) i et sterilt 14 ml polystyrenkulturrør. MERK: Ny transformerte kolonier anbefales for inokulering. Celler på LA-middels plater (fra trinn 2.2.) lagret ved 4 °C skal brukes i løpet av få dager.</li>
		<li>Vokse cellekulturen over natten ved 37 °C i en orbital shaker ved 200-250 o/min.</li>
	</ol></li>
	<li>Produksjon av rekombinant EGFP- H6, H6-NowGFP og H6-KillerOrange med innfødt prolin og tilsvarende proteinvarianter med prolinanaloger<ol><li>Inokuler 200 ml ferskt NMM-medium (7,5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 og 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glukose, 1 μg/ml FeCl2, 1 μg/ml CaCl2, 10 μg/ml tiamin, 10 μg/ml biotin, 0,01 μg/ml sporstoffer (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~7,2) med alle kanoniske l-aminosyrer (50 mg/l); se Tilleggsmateriale) supplert med 100 μg/ml ampicillin med 2 ml av nattkulturen i en 2-L Erlenmeyer-kolbe. MERK: Avhengig av type protein, kan alternative dyrkingsmedier som MOPS medium52, glukose-mineralsalter medium53, Davis minimal medium54, M9 minimal medium55 eller GMML56 testes for å optimalisere proteinutbyttet.</li>
		<li>Inkuber cellene ved 37 °C i en orbital shaker ved 220 o/min i ~3 t 30 min.</li>
		<li>Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) i et spektrofotometer hvert 30. MERK: For OD600-bestemmelse i et spektrofotometer, bør cuvette ha en banelengde på 1 cm. Det tilsvarende dyrkingsmediet brukes til referansemålingen ("null"). Inkubasjonstiden til en OD600-verdi på ~ 0,7 er nådd, kan avhenge av kulturvolumet. 3 t 30 min er en omtrentlig verdi. I en variant av protokolldeltrinnene 2.2.1-2.2.3., kulturen fra deltrinn 2.1.2. brukes til å inokulere ferskt NMMΔPro medium (se Tilleggsmateriale) supplert med en begrenset konsentrasjon av prolin (f.eks. 5 mg/l i stedet for 50 mg/l), og cellene dyrkes over natten ved 37 °C i en orbital shaker ved 220 o/min. Neste dag utføres OD600-bestemmelsen hvert 30. Den maksimale OD600-verdien må være rundt 1 (± 0,3). Den første, begrensede prolinekonsentrasjonen kan justeres avhengig av uttrykksstammen og dyrkingsmediet (se Diskusjon).</li>
		<li>Snurr ned cellefjæringen i 10 min ved 3000 x g og 4 °C.</li>
		<li>Dekanter supernatanten forsiktig i avfall.</li>
		<li>Vasketrinn: Resuspend cellene i 50 ml iskald NMMΔAA (uten aminosyre, se Tilleggsmateriale) eller NMMΔPro (uten prolin, se Tilleggsmateriale) medium ved forsiktig pipettering. MERK: For dette vasketrinnet kan en av de to oppgitte bufferne brukes, siden det bare er viktig å kvitte seg med gjenværende proline i inkubasjonsmediet.</li>
		<li>Skill cellene fra mediet ved sedimentering ved 4 °C i en sentrifuge ved 3000 x g i 10 minutter.</li>
		<li>Dekanter supernatanten forsiktig i avfall.</li>
		<li>Pipette forsiktig opp og ned for å resuspendere cellepellet i 200 ml NMMΔPro medium supplert med 100 μg / ml ampicillin i en 2-L Erlenmeyer kolbe. MERK: Den resulterende cellefjæringen kan deles inn i flere prøver med likt volum for å oppnå identiske startkulturer for å sammenligne proteinuttrykk i nærvær av Pro- eller proline-analoger (f.eks. separasjon i 4 x 50 ml i 100 ml Erlenmeyer-kolber).</li>
		<li>Inkuber i 30 min ved 37 °C i en orbital shaker ved 220 o/min for fullstendig uttømming av Pro. MERK: Dette trinnet er avgjørende for å tømme Pro helt fra celler.</li>
		<li>Legg til et passende volum av enten L-proline eller R-Flp, S-Flp, Dfp og Dhp fra 50 mM lagerløsning for å justere 1 mM endelig konsentrasjon i cellefjæringen. MERK: Som hovedregel bør det alltid utarbeides ferske 50 mM lagerløsninger av Pro- eller prolinederivater før bruk. Bare hvis hydrolyse av den spesielle kanoniske eller ikke-kanoniske aminosyren i en vandig løsning ikke er en bekymring, kan frosne lagre også brukes.</li>
		<li>Tilsett 0,5 mM IPTG fra en 1 M lagerløsning for å indusere målproteinuttrykk.</li>
		<li>Uttrykk målproteinet over natten (12 timer) ved 37 °C i en orbital shaker ved 220 o/min.</li>
		<li>Mål OD600 neste dag. MERK: OD600-bestemmelse gjøres for å kvantifisere mengden celler etter proteinuttrykk. En lavere OD600-verdi sammenlignet med verdien målt før vasketrinnet 2.2.3 indikerer cytotoksisitet av den medfølgende aminosyren. I dette tilfellet bør prosedyren gjentas med konsentrasjonen av den medfølgende aminosyren minimert (ned til 0,1 mM).</li>
		<li>Sentrifuger og samle bakteriecellene ved 5000 x g og 4 °C i 10 minutter og dekanter supernatanten i avfall.</li>
		<li>Vasketrinn: Resuspend cellene ved forsiktig pipettering i 50 ml bindingsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) som inneholder 10% glyserol og overfører cellefjæringen til et 50 ml konisk polystyrenrør.</li>
		<li>Sentrifuger og samle bakteriecellene ved 5000 x g og 4 °C i 10 minutter og dekanter supernatanten i avfall.</li>
		<li>Oppbevar cellepellet i et konisk polystyrenrør på 50 ml ved -20 °C eller -80 °C til videre bruk (proteinrensing, se nedenfor).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Renseprosedyre av proteinprøver ved immobilisert metallionaffinitetskromatografi (IMAC)
<ol><li>Bakteriell cellelys MERK: Utfør alle trinnene i cellelysene på is eller ved 4 °C for å forhindre nedbrytning av målproteinet.<ol>
<li>Tine bakteriecellepellet på is eller ved 4 °C i et konisk polystyrenrør på 50 ml i 10-20 minutter.</li>
		<li>Tilsett 10 ml iskald bindingsbuffer (se Tilleggsmateriale) og rør forsiktig opp og ned for å resuspendere cellepelleten.</li>
		<li>Tilsett 100 μL 50 mg/ml lysozym, 100 μL 1 mg/ml DNase I, 100 μL 1 mg/ml RNase A, 30 μL av 1 M MgCl2. Snu cellefjæringen forsiktig fem ganger, og hold det lukkede røret på is eller ved 4 °C i 60 minutter. MERK: Lysozyme induserer kjemisk cellelys ved å forstyrre bakteriecelleveggen.</li>
		<li>Soniker prøven for celleforstyrrelser ved hjelp av en ultralyd homogenisator (f.eks. 3 ganger i 3 minutter i et 50 ml polystyrenrør på en isvannsblanding, puls 2 s/pause 4 s, 45% amplitude). MERK: Alternativt kan andre celleavbruddsmetoder brukes, for eksempel høytrykkshomogenisering i 20 sykluser ved 14 000 psi. Fortynn om nødvendig ved hjelp av en bindingsbuffer (se Tilleggsmateriale) for å nå minimalt instrumentvolum. Videre kan proteinutvinningsreagenser brukes til celleforstyrrelser. Se materiallisten hvis du vil ha eksempler.</li>
		<li>Sentrifuge i 60 min ved 18 000 x g, 4 °C.</li>
		<li>Legg merke til væskevolumet for substep 3.1.9. og hell supernatanten i et friskt 50 ml polystyrenrør.</li>
		<li>Fjern supernatanten ved hjelp av et membranfilter med 0,45 μm porediameter.</li>
		<li>Ta et utvalg av "lysate" for SDS-PAGE (se avsnitt 4. nedenfor); Dette tilsvarer "løselig proteinfraksjon", supernatanten fra substep 3,1,6.</li>
		<li>Legg til et likt volum av ddH2O som bestemt i deltrinn 3.1.6. for å resuspendere celleavfallet for å opprettholde samme fortynning av prøvene for etterfølgende SDS-PAGE-analyse.</li>
		<li>Ta et utvalg av "pellet" for SDS-PAGE (se avsnitt 4. nedenfor); Dette tilsvarer "uoppløselig proteinfraksjon", celleavfallssuspensjonen fra substep 3.1.9.</li>
	</ol></li>
	<li>Immobilisert metallaffinitet kromatografi (IMAC) rensing MERK: Rensing av målet fluorescerende protein kan utføres ved 4 °C eller ved romtemperatur (RT). For sistnevnte alternativ, vent på at lysate, kolonne og alle buffere skal likevektere ved RT for å forhindre luftbobledannelse på grunn av fordampning av luft fanget i kald løsning ved plassering i en varm kolonne.<ol>
<li>Rens prøven ved hjelp av en 1 ml forhåndspakket eller selvpakket IMAC FPLC-kolonne (hurtigprotein [eller ytelse] flytende kromatografi) i henhold til produsentens instruksjoner; sett maksimalt kolonnetrykk til 0,3 MPa, og strømningshastigheten til 1 ml/min; bruke bindingsbuffer (se Tilleggsmateriale) for kolonnelikevekt, vaskebuffer (se Tilleggsmateriale) for vasketrinnet og elutionbuffer (se Tilleggsmateriale) for målproteinutnyttelse. MERK: Alternativt kan et automatisert FPLC-system påføres for å unngå målproteinet med elutionbuffer som kjører en lineær imidazolkonsentrasjonsgradient (20-200 mM).</li>
		<li>Samle og basseng eluate fraksjoner med fluorescerende proteiner (velg ved synlig grønn eller oransje farge).</li>
		<li>Overfør de samlede brøkene til en dialysemembran (MWCO ( Molecular Weight Cutoff) på 5000-10 000) i henhold til produsentens instruksjoner og dialyse minst tre ganger mot dialysebuffer eller MS-buffer (se Tilleggsmateriale). For eksempel, utfør dialyse av en 1 ml prøve tre ganger mot 100 ml buffer i minst 2 timer hver runde. For en detaljert protokoll, se Budisa et al.34.</li>
		<li>Forbered en 1:100-fold fortynning av den dialyzed elutionfraksjonen i PBS-buffer (se Tilleggsmateriale).</li>
		<li>Registrer absorbansspekteret av de fortynnede prøvene i et UV-Vis spektrofotometer.</li>
		<li>Beregn proteinkonsentrasjonen basert på Lambert-Beer-loven som følger, ved hjelp av litteraturverdier av molarutryddelseskoeffisientene ε ved spesifikk bølgelengde (for EGFP ved 488 nm ε488 = 55 000 cm-1· M-1, NowGFP ved 493 nm ε493 = 53 600 cm-1· M-1, KillerOrange ved 514 nm ε514 = 22 600 cm-1· M-1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63320/63320eq01.jpg"> (Lambert-Øl lov) cprotein = proteinkonsentrasjon [mg/ml] A = absorbans ved spesifikk bølgelengde ε = molar utryddelseskoeffisient ved spesifikk bølgelengde [M-1·cm-1] d = cuvette bane lengde, her 1 cm MW = molekylvekt av protein [g/mol] Bruk dialysebuffer (se Tilleggsmateriale) for referansemålet ("null").</li>
		<li>Ta en prøve av "eluate" for SDS-PAGE (se avsnitt 4 nedenfor), last 1-10 μg protein (beregnet i henhold til forrige trinn) per prøvebrønn for Coomassie Brilliant Blue-farget geler. MERK: Juster SDS-prøvemengder avhengig av den påførte fargingsmetoden og følsomheten til fargestoffet hvis forbindelser som er forskjellige fra Coomassie Brilliant Blue, brukes til proteinbåndfarging.</li>
		<li>Frys og oppbevar proteinprøven i dialysebuffer (se Tilleggsmateriale) ved -80 °C. MERK: Under denne lagringstilstanden bør proteinprøver være stabile i minst 6 måneder. Alternativt laboratorium UV-Vis og fluorescensspektrofotometere kan brukes til registrering av absorpsjon og fluorescensutslippsspektra av målproteiner. Følgende eksitasjonsbølgelengder kan brukes til fluorescensutslippsmålinger: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) og 510 nm (KillerOrange).</li>
	</ol></li>
</ol>4. SDS-PAGE prøvepreparering
<ol><li>Bestem absorbans A ved 280 nm (A280nm) for prøver "eluate", "lysate" og "pellet" fra § 3. Juster probevolumet for å oppnå A280nm = 2 ved å legge til en passende mengde elutionbuffer (endelig sondevolum skal være minst 80 μL).</li>
	<li>Bland prøven med et forhold på 4:1 (v/v) med 5x SDS lastefargebuffer (se Tilleggsmateriale) ved pipettering, for eksempel 80 μL av prøven med 20 μL 5x SDS-lastebuffer.</li>
	<li>Kok SDS-prøvene ved 95 °C i 5 minutter i et vannbad eller en varmeblokk for å tette proteinene.</li>
	<li>La prøvene avkjøles ned til RT og spinn ned sondene på 13 000 x g i 1 min i en mikrocentrifuge før de lastes på gelen.</li>
	<li>Bruk 5-10 μL for Coomassie Brilliant Blue-farget SDS-PAGE. Hvis du vil ha mer informasjon om SDS-PAGE-prosedyren, kan du se57. MERK: Juster SDS-prøvemengdene avhengig av fargemetoden og følsomheten til fargestoffet. Resultatet av SDS-PAGE bør kontrolleres nøye for å sikre at prøvene inneholder mer enn 95% av det totale proteinet i et bånd som tilsvarer forventet molekylvekt av ønsket protein. For dette, ta et bilde av Coomassie-farget gel og sammenlign intensiteten av proteinbåndet med ønsket molekylvekt med intensiteten til alle andre bånd i banen (hvis noen) ved densitometri. For densitometrisk evaluering av båndintensiteter kan programvaren ImageJ brukes58. For å eksperimentelt bevise inkorporering av de ønskede ncAAene i proteinet av interesse, bør intakt proteinmasseanalyse ved høyytelses væskekromatografi (HPLC) koblet til elektrosprayionization time-of-flight massespektrometri (LC-ESI-TOF-MS) utføres som beskrevet59 (se protokoll § 5 og Tabell over materialer der for eksemplarisk utstyr).</li>
</ol>5. Fluorescensutslipp av proteinvarianter
<ol><li>Før prosedyren må du kontrollere resultatet fra SDS-PAGE-eksperimentet for å forsikre deg om at prøverenhet er >95 % (se MERKNAD etter trinn 4.5.)</li>
	<li>Juster prøvene av hver renset proteinvariant til en konsentrasjon på 0,3 μM, og ta den beregnede absorbansverdien ved riktig bølgelengde som referanse (substep 3,2,5.). Kontroller at det omtrentlige endelige prøvevolumet er 200 μL.</li>
	<li>La de fortynnede prøvene likevekte i 1 time ved RT.</li>
	<li>Overfør prøvene til en 1 cm kvarts cuvette og mål et fluorescensutslippsspekter av prøvene ved hjelp av et fluorescensspektrometer (se Materialliste) som bruker følgende eksitasjonsbølgelengder: 488 nm (for EGFP), 493 nm (for NowGFP), 510 nm (for KillerOrange).</li>
</ol>6. Denaturering og bretting av EGFP-varianter
<ol><li>Før prosedyren må du kontrollere resultatet fra SDS-PAGE-eksperimentet for å forsikre deg om at prøverenhet er >95 % (se MERKNAD etter trinn 4.5.)</li>
	<li>Forbered deg på hver renset proteinvariant to prøver av 2 μL sluttvolum i en konsentrasjon på 300 μM (se proteinkonsentrasjonsbestemmelse i substeps 3,2,4-3,2,6).</li>
	<li>Tilsett 18 μL 1,11x PBS-buffer (se Tilleggsmateriale) som inneholder 8,89 M urea og 5,56 mM DTT til 2 μL av hver rensede proteinvariant (for å oppnå 1x PBS som inneholder 8 M urea og 5 mM DTT) for å indusere denaturering. MERK: For trinn 6.4-6.6, behandle hver prøve separat.</li>
	<li>Inkuber prøvene i 5 min ved 95 °C.</li>
	<li>Fortynn 20 μL-prøvene 100 ganger ved å tilsette 1980 μL 1x PBS (se Tilleggsmateriale) som inneholder 5 mM DTT for å indusere renaturering, noe som gir 0,3 μM endelig proteinkonsentrasjon og overfører umiddelbart 200 μL av prøvene til en 1 cm kvarts cuvette. MERK: Det er veldig viktig å jobbe raskt her siden renaturation starter umiddelbart.</li>
	<li>Sett kvarts cuvette inn i et passende fluorescensspektrometer (se Materialfortegnelse) og overvåk proteinfolding i prøvene ved å anskaffe et fluorescensspekter hver tredje s over 30 min. For hver proteinvariant, bruk 295 nm fluorescenseksitasjon for den første prøven og 488 nm fluorescenseksitasjon for den andre.</li>
	<li>Overfør brettingsprøvene til 1,5 ml mikrosenterrør, lukk lokket og oppbevar prøvene på RT i mørket i 24 timer for å tillate fullstendig bretting av EGFP-varianter.</li>
	<li>Mål fluorescensutslipp av refoldede proteinprøver i henhold til trinn 6.6 ved hjelp av samme eksitasjonsbølgelengde som før for å fange det tidsmessige endepunktet for fluorescensgjenvinning.</li>
</ol>

Forfatterne avslører alle og eventuelle interessekonflikter.

I naturen oppstår manipulasjoner med proteinstrukturer og funksjoner vanligvis på grunn av mutasjoner, fenomenet som fører til utveksling av en aminosyreidentitet i visse stillinger i proteinsekvensen. Denne naturlige mekanismen er mye brukt som en bioteknologisk metode for proteinteknikk i form av mutagenese, og den er avhengig av repertoaret til de 20 kanoniske aminosyrene som er involvert i prosessen. Utveksling av proline rester er imidlertid problematisk. På grunn av sin spesielle ryggradsgruppearkitektur er den neppe utskiftbar med de resterende 19 rester for erstatning72. Proline er for eksempel vanligvis kjent som en sekundær strukturbryter i polypeptidsekvenser på grunn av sin dårlige kompatibilitet med de vanligste sekundære strukturene, det vil si α-helix og β-strand. Denne proline-funksjonen går lett tapt når restene muteres til en annen aminosyre fra det vanlige repertoaret. Utskifting av proline med sine kjemiske analoger tilbyr en alternativ tilnærming, som gjør det mulig å holde de grunnleggende ryggradsfunksjonene til foreldre proline rester mens du pålegger bias på sine spesifikke konformasjonsoverganger eller produserer moduler av molekylært volum og polaritet. For eksempel er det mulig å levere bakteriekulturer med analoge strukturer som hydroksy-, fluor-, alkyl-, dehydroproliner, strukturer som har variable ringstørrelser og mer, og dermed letter produksjonen av et protein som inneholder spesifikke prolineresterendringer.
Den selektive trykkinkorporeringsmetoden (SPI) som er beskrevet i denne studien, muliggjør en global, det vil si resterspesifikk erstatning av alle proliner i målproteinet med relaterte kjemiske analoger. Betydningen av metoden gjenspeiles av det faktum at SPI tillater å skape sekvensendringer utilgjengelige for vanlige mutageneseteknikker. For eksempel tillater det produksjon av et målprotein som inneholder ganske små strukturelle endringer som vanligvis ikke overstiger en eller to atomerstatninger / slettinger / tillegg, som vist i denne studien. Slike protein modifikasjoner kalles "atommutasjoner"73,74. I et fluorescerende protein som GFP kan resultatet av denne molekylære inntrengningen ses i hastigheten på folding, lokale polariteter, proteinpakking, stabilitet av de involverte strukturelle egenskapene. Endringene i absorbans- og fluorescensegenskapene produseres indirekte på grunn av påvirkningen på proteinfolding og rester av mikromiljøet. Presisjonen til de molekylære endringene utført av SPI er vanligvis mye høyere, sammenlignet med mutasjoner av proliner til andre kanoniske rester, sistnevnte er vanligvis skadelig for proteinfolding, produksjon og isolasjon.
Som en produksjonsmetode bruker SPI-tilnærmingen substrattoleransen til aminoacyl-tRNA-syntetaselommen mot kjemiske analoger av den innfødte aminosyren. Syntetase er ansvarlig for riktig identifisering av aminosyrestrukturen, mens inkorporering i proteiner skjer nedstrøms i oversettelsesprosessen. Instrumentalt utføres proteinproduksjonen, isolasjonen og rensingen i SPI på en måte som er typisk for andre rekombinante proteinuttrykksteknikker; Men med noen tillegg til protokollen som følger: Proline, som er bundet til utskifting, leveres i begynnelsen av gjæringsprosessen, slik at cellene kan vokse og utvikle sine intakte cellulære maskiner. Cellekulturen har imidlertid ikke lov til å nå maksimal optisk tetthet, for å holde cellene i den logaritmiske fasen optimale for proteinuttrykk. Det er to store variasjoner av SPI-metoden på dette tidspunktet. I den første justeres konsentrasjonen av prolin i det første vekstmediet (et kjemisk definert medium) slik at uttømming av prolin skjer uten ekstern inntrengning. Cellene eksos proline i mediet før de kan gå ut av den logaritmiske vekstfasen, og deretter tilsetts analogen, og proteinet av interesseproduksjon blir indusert. I den andre versjonen av metoden vokser cellene i mediet som inneholder proline til midten av deres logaritmiske fase. På dette tidspunktet bør cellene tas ut og fysisk overføres til et annet medium, som ikke lenger inneholder prolin, bare analogen, med etterfølgende induksjon av proteinet av interesse. I begge versjoner leveres analogen og proteininduksjonsreagensen til de forvoksne cellene. Isolasjon og rensing av villtypeproteinet utføres på samme måte som for varianter. I prinsippet kan alle tilgjengelige pro-auxotrofiske stammer brukes som uttrykksvert. Likevel er uttrykkstester for å identifisere den mest passende verten tilrådelig. Også tester av forskjellige kjemisk definerte medier kan brukes til å optimalisere proteinutbyttet.
Det er visse krav til de kjemiske analogene som må vurderes for SPI, for eksempel løselighet og konsentrasjon. Den metabolske tilgjengeligheten og opptaket av aminosyrer er avhengig av antall oppløste molekyler i mediet. For å øke løseligheten til en bestemt forbindelse, kan det velges litt sure eller alkaliske forhold. Siden de kunstige molekylene kan forårsake veksthemmende effekter på grunn av deres celletoksisitet, bør konsentrasjonen senkes til et minimum for å unngå cellestress75.
En mindre svakhet ved SPI er reduksjonen av inkorporeringseffektivitet med et større antall stillinger som må byttes ut. I prinsippet kan en reduksjon av aminosyrefrekvensen innenfor målet biomolekyl ved stedsstyrt mutagenese løse dette problemet. Imidlertid kan de strukturelle og funksjonelle egenskapene til et ønsket protein påvirkes ved å endre primærstrukturen.
Som nevnt tidligere tillater SPI resterspesifikk utskifting av den kanoniske aminosyren. Dette innebærer at ikke-kanoniske aminosyrer settes inn i hver posisjon av den kanoniske aminosyren i målproteinet, inkludert konserverte rester som er uunnværlige for proteinfunksjon eller folding. Alternative metoder for stedsspesifikk innlemmelse er den eneste muligheten til å løse dette problemet3. I løpet av de siste tiårene har den ortogonale parmetoden blitt utviklet som kan produsere proteiner som inneholder modifiserte rester på forhåndsdefinerte steder. Den vanligste modifikasjonen av denne metoden er kjent som stop codon-undertrykkelse. Denne metoden er basert på et konstruert ortogonalt oversettelsessystem dedikert til stedsspesifikk inkorporering av syntetiske aminosyrer76. Mer enn 200 aminosyrer med forskjellige sidekjedemodifikasjoner har blitt innlemmet i proteiner til dags dato ved hjelp av denne tilnærmingen77. Imidlertid er disse oversettelsessystemene fortsatt ikke egnet for innsetting av proline-analoger i målproteiner. Videre anses metodens ytelse som lav ved mindre aminosyreendringer fordi noe bakgrunnspromiskuitet av aminoacyl-tRNA-syntesen vanligvis forblir i de konstruerte oversettelsessystemene.
Ved hjelp av SPI produserte vi en rekke β-fat fluorescerende proteinvarianter og studerte resultatene av utveksling av proline med sine unaturlige analoger. Ved proline erstatning med R-Flp og Dfp ble et dysfunksjonelt protein produsert av uttrykksverten. Effekten er sannsynligvis produsert av protein feilfolding. Sistnevnte kan stamme fra C 4-exo-konformasjonen fremmet av R-Flp, som er ugunstig av de overordnede proteinstrukturene27. Med Dfp vil feilfoldingen sannsynligvis bli produsert av den reduserte hastigheten til trans-til-cis peptidbindingsisomerisering ved prolinerester27. Sistnevnte er kjent for å være blant de begrensende trinnene i den kinetiske profilen til proteinfoldingen som påvirker β-fatdannelse og påfølgende kromoformodning. Faktisk, for både aminosyrer, R-Flp og Dfp, resulterte proteinproduksjonen i et aggregert og uoppløselig protein. Følgelig kunne kromofordannelse ikke forekomme, og fluorescensen gikk helt tapt. Med S-Flp og Dhp ble det imidlertid observert riktig proteinmodning, noe som resulterte i fluorescerende proteinprøver for hver analog/ proteinkombinasjon. Til tross for noen moduler i proteinets absorbans- og fluorescensegenskaper, forble disse i stor grad lik de av de ville proteinene. Effekten av aminosyrerstatningen ble avslørt i de refoldende kinetikkstudiene. Sistnevnte viste en raskere bretting ved utskifting med S-Flp. Modellstudier har vist at denne resten kan generere en viss forbedring i trans-til-cis midt i rotasjonshastigheten og føre til dannelsen av C 4-endo-konformasjonen. Begge disse faktorene vil sannsynligvis bidra til de gunstige kinetiske effektene av denne resten i EGFP. I motsetning produserte Dhp kinetiske foldeprofiler som maksimalt ligner på foreldreproteinet. Mangfoldet av resultatene produsert av bare atommutasjoner i de undersøkte fluorescerende proteinene illustrerer potensialet i SPI-produksjonsmetoden ved å endre målproteinegenskaper. Proteinendringene forårsaket av proline-erstatning med analogene har ytterligere implikasjoner i konstruksjonen av enzymer 78,79,80 og ionkanaler 81,82, samt generell prosjektering av proteinstabilitet.
Den grunnleggende begrensningen av SPI-metoden er dens "alt-eller-ingen" -modus i utveksling av proline ligger med relaterte analoger. Det ville være til stor fordel å kunne velge nøyaktig hvilke proline rester som skal erstattes med analogene, og hvilke som skal forbli uendret. For tiden er det imidlertid ingen teknikk som kan utføre en så sofistikert produksjon ved hjelp av en mikrobiell produksjonsvert. Kjemisk syntese av proteiner83,84, samt cellefri produksjon85,86, er de to alternative metodene som kan produsere posisjonsspesifikke proline modifikasjoner. Likevel gjør deres operasjonelle kompleksitet og lave produksjonsutbytter dem dårligere sammenlignet med produksjonen i levende celler. Per nå er SPI fortsatt den mest operasjonelt enkle og robuste tilnærmingen for produksjon av komplekse proteiner som bærer atommutasjoner. Ved å introdusere unaturlige aminosyreerstatninger, tillater metoden modifisere proteinegenskaper på en målrettet måte, som eksemplifisert her ved endringer i folding og lysabsorpsjon / utslipp av fluorescerende proteiner generert av proline erstatninger.

Klassisk stedsstyrt mutagenese tillater permutasjon av enhver eksisterende genkodet proteinsekvens ved kodonmanipulering på DNA-nivå. For å studere proteinfolding og stabilitet er det ofte ønskelig å erstatte lignende aminosyrer med lignende kolleger. Imidlertid er tradisjonell proteinmutagenese definitivt begrenset til strukturelt lignende erstatninger blant kanoniske aminosyrer som Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, som er til stede i standard genetisk koderepertoar. På den annen side er det ingen slike muligheter for andre kanoniske aminosyrer som Trp, Met, His eller Pro, som ofte spiller essensielle strukturelle og funksjonelle roller i proteiner1. En ideell tilnærming for å studere disse interaksjonene i sammenheng med den svært spesifikke interne arkitekturen av proteiner og deres foldeprosess er å generere ikke-forstyrrende isosteriske modifikasjoner. Faktisk, når isosteriske aminosyreanaloger av disse kanoniske aminosyrene, også kjent som ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAer), settes inn i proteiner, tillater de subtile endringer selv på nivået av enkeltatomer eller atomgrupper som H / F, CH2 / S / Se / Te kjent som "atommutasjoner"2. Slike "molekylær kirurgi" produserer endrede proteiner hvis egenskaper utelukkende skyldes utveksling av enkeltatomer eller grupper av atomer, som i gunstige tilfeller kan analyseres, og de oppdagede endringene kan rasjonaliseres. På denne måten utvides omfanget av proteinsyntese for å studere proteinfolding og struktur langt utover klassisk DNA-mutagenese. Legg merke til at proteiner generert av stedsstyrt mutagenese vanligvis kalles "mutanter", mens proteiner med erstattede kanoniske aminosyrer kalles "varianter" 3, "alloproteiner"4 eller "proteinkongeners"5.
Det grønne fluorescerende proteinet (GFP), først identifisert i den marine organismen Aequorea victoria, viser lysegrønn fluorescens når det utsettes for ultrafiolett-til-blått lys 6,7. I dag brukes GFP ofte som et svært følsomt merkingsverktøy for rutinemessig visualisering av genuttrykk og proteinlokalisering i celler via fluorescerende mikroskopi. GFP har også vist seg nyttig i ulike biofysiske 8,9,10 og biomedisinske11,12 studier, samt i protein engineering 13,14,15. Streng analyse av GFP-strukturen gjorde det mulig å lage mange varianter preget av variert stabilitet og fluorescens maxima16,17. De fleste GFP-variantene som brukes i celle- og molekylærbiologi er monomeriske proteiner både i løsning og i krystall18. Deres viktigste strukturelle organisasjon er typisk for alle medlemmer av GFP-familien, uavhengig av deres fylogenetiske opprinnelse, og består av 11 β tråder som danner en såkalt β-fat, mens en knekt α-helix løper gjennom midten av fatet og bærer kromoforen (figur 1A). Den autokatalytiske modningen av kromoforen (figur 1B) krever presis posisjonering av sidekjedene som omgir den i det sentrale stedet for proteinet; mange av disse sidekjedene er svært bevart i andre GFP-varianter19. I de fleste fluorescerende proteiner fra maneter som Aequorea victoria består den grønn-emitterende kromoforen av to aromatiske ringer, inkludert en fenolring av Tyr66 og den femdelte heterosykliske strukturen til imidazolinone (figur 1B). Kromoforen, når den er riktig innebygd i proteinmatrisen, er ansvarlig for den karakteristiske fluorescensen til hele proteinet. Den ligger i midten av strukturen, mens fatstrukturen isolerer den fra det vandige mediet20. Eksponering av kromofor til bulkvannet vil føre til fluorescensslukking, det vil si tap av fluorescens21.
Riktig folding av den fatlignende strukturen er avgjørende for å beskytte kromofor mot fluorescensslukking22. Proline (Pro) rester spiller en spesiell rolle i den strukturelle organiseringen av GFP23. Å ikke kunne støtte en β-tråd, utgjør de koblingsløkker som er ansvarlige for å opprettholde proteinstrukturen som helhet. Ikke overraskende finnes 10-15 proline rester i både Aequorea- og Anthoathecata-avledede fastleger; noen av dem er svært bevart i andre typer fluorescerende β-fat proteiner. Prolines forventes å kritisk påvirke foldeegenskaper på grunn av deres særegne geometriske egenskaper. For eksempel, i Aequorea-avledede fastleger, av de ti proline-rester (figur 2A), danner ni form trans- og bare en danner en cis-peptidbinding (Pro89). Pro58 er viktig, det vil si ikke utskiftbar med resten av de 19 kanoniske aminosyrene. Denne resten kan være ansvarlig for riktig posisjonering av Trp57-rester, som har blitt rapportert å være avgjørende for kromoformodning og den samlede GFP-foldingen24. Fragmentet PVPWP med tre prolinerester (Pro54, Pro56, Pro58) og Trp57 er den essensielle delen av "nedre lokk" i GFP-strukturen fra figur 1A. Det strukturelle PVPWP-motivet finnes i flere proteiner som cytokromer og eukaryote spenningsaktiverte kaliumkanaler25. Prolin-til-alanin substitusjoner i stillingene 75 og 89 er også skadelige for proteinuttrykk og folding og avskaffe kromoformodning. Pro75 og Pro89 er en del av "øvre lokk" som begraver kromofor (figur 1A) og er bevart over 11-strandede β-fat fluorescerende proteiner23. Disse to "lokkene" holder kromoforen utelukket fra det vandige løsningsmidlet, selv når den stabile tertiære strukturen er delvis ødelagt26. En slik spesifikk molekylær arkitektur beskytter fluoroforen mot kollisjons-(dynamisk) fluorescensslukking, for eksempel ved vann, oksygen eller andre diffusible ligander.
For å utføre molekylær prosjektering av GFP-strukturen, bør man introdusere aminosyreerstatninger i proteinets primære struktur. Tallrike mutasjoner har blitt utført på GFP, og gir varianter med forhøyet stabilitet, rask og pålitelig folding og variable fluorescensegenskaper17. Likevel, i de fleste tilfeller, mutasjon av prolinrester anses som en risikabel tilnærming på grunn av det faktum at ingen av de resterende 19 kanoniske aminosyrene kan gjenopprette konformasjonsprofilen til prolinerester27 riktig. Dermed er det utviklet en alternativ tilnærming, der proline rester erstattes med andre proline-baserte strukturer, kalt proline analoger28. På grunn av sin unike sykliske kjemiske struktur viser prolin to karakteristiske konformasjonsoverganger (figur 1C): 1) proline-ringen puckering, en rask prosess som innebærer organisering av ryggraden, som først og fremst påvirker φ torsjonsvinkel, og 2) peptidbindingen cis / trans isomerisering, en langsom prosess som påvirker ryggradsfolding via ω torsjonsvinkler. På grunn av sin langsomme natur er sistnevnte overgang ofte ansvarlig for de hastighetsbegrensende trinnene i foldeprosessen til hele proteinet. Det har tidligere vist seg at peptidbinding cis / trans isomerisering rundt noen proline rester har langsomme trinn i foldingen av GFP-varianter. For eksempel har dannelsen av cis-peptidbindingen hos Pro89 det langsomme trinnet i foldeprosessen fordi den er avhengig av bindingsovergangen fra trans til cis29. En raskere bretting kan oppnås etter å ha erstattet Pro89 med en all-trans peptidsløyfe, det vil si ved å avskaffe en cis-to-trans isomeriseringshendelse30. I tillegg til cis /trans-isomeriseringen, kan puckerovergangene også generere dype endringer i proteinfolding på grunn av ryggradsorganisasjonen og pakking i proteininteriøret 27,31.
Kjemiske modifikasjoner resulterer i endring av de iboende konformasjonsovergangene til prolinrester, og påvirker dermed proteinets evne til å brette seg. Visse proline analoger er spesielt attraktive kandidater for proline substitusjon i proteiner som de tillater manipulering og studie av folding egenskaper. For eksempel er (4R)-fluoroprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp) og 3,4-dehydroproline (Dhp) fire analoger (figur 1D) som skiller seg minimalt fra prolin når det gjelder både molekylært volum og polaritet32. Samtidig viser hver analog en distinkt ringpuckering: S-Flp stabiliserer C 4-endo pucker, R-Flp stabiliserer C 4-exo pucker, Dfp viser ingen tilsynelatende pucker preferanse, mens Dhp avskaffer puckering (Figur 1D)33. Ved å bruke disse analogene i proteinstrukturen kan man manipulere med konformasjonsovergangen til prolinerester, og med dette påvirke egenskapene til de resulterende GFP-variantene.
I dette arbeidet bestemte vi oss for å innlemme det angitte settet med prolineanaloger (figur 1D) i strukturen til GFP-varianter ved hjelp av selektiv trykkinnarbeidingsmetode (SPI, figur 3)34. Utskifting av aminosyrerester med sine nærmeste isostrukturelle analoger er et anvendt bioteknologisk konsept i proteindesign35,36. Dermed illustrerer effekten av prolineanaloger i et modellprotein deres potensial til å tjene som verktøy i proteinteknikk37. Produksjonen av proteiner som inneholder ønskede analoger ble utført i modifiserte E. coli-stammer som ikke er i stand til å produsere prolin (prolin-auxotrofi). Dermed kan de bli tvunget til å akseptere erstatning av substrater i prosessen med proteinbiosyntese38. Denne globale substitusjonen av prolin er aktivert av den naturlige substratfleksibiliteten til endogene aminoacyl-tRNA-synthetaser39, de viktigste enzymene katalyserer esterifiseringen av tRNAer med passende aminosyrer40. Generelt, som beskrevet i figur 3, utføres cellulær vekst i et definert medium til den midterlig logaritmiske vekstfasen er nådd. I neste trinn er aminosyren som skal erstattes intracellulært utarmet fra uttrykkssystemet under gjæring og deretter utveksles av ønsket analog eller ncAA. Målproteinuttrykk induseres deretter for rester-spesifikk ikke-kanonisk aminosyre inkorporering. Substitusjonen av cognate aminosyren med analogen skjer på en proteom bred måte. Selv om denne bivirkningen kan ha en negativ innvirkning på veksten av vertsstammen, påvirkes kvaliteten på målproteinproduksjonen for det meste ikke, siden de cellulære ressursene i rekombinant uttrykk hovedsakelig er rettet mot produksjonen av målproteinet41,42. Derfor er et tett regulert, utydelig uttrykkssystem og sterke promotører avgjørende for høy inkorporeringseffektivitet43. Vår tilnærming er basert på flere rester-spesifikk inkorporering av ncAAs som svar på sans codons (sense codon omplassering), hvorved innenfor målgenet, antall posisjoner for Pro analog innsetting kan manipuleres via sted-rettet mutagenesis44. En lignende tilnærming ble brukt i vår forrige rapport om fremstilling av rekombinante peptider med antimikrobielle egenskaper45. I dette arbeidet har vi brukt SPI-metoden, som gjør at alle prolinrester kan erstattes av relaterte analoger, for å generere proteiner som forventes å ha distinkte fysisk-kjemiske egenskaper som ikke finnes i proteiner syntetisert med det kanoniske aminosyrerepertoaret. Ved å karakterisere folde- og fluorescensprofilen til resulterende varianter, tar vi sikte på å vise frem effekten av atomerstatninger i varianter av GFP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

Utskifting av prolin (Pro) rester i proteiner av den tradisjonelle stedsstyrte mutagenesen av noen av de resterende 19 kanoniske aminosyrene er ofte skadelig for proteinfolding og spesielt kromoformodning i grønne fluorescerende proteiner og relaterte varianter. Et rimelig alternativ er å manipulere oversettelsen av proteinet slik at alle Pro-rester erstattes rester- spesielt av analoger, en metode kjent som selektiv trykkinkorporering (SPI). De innebygde kjemiske modifikasjonene kan brukes som en slags "molekylær kirurgi" for å fint dissekere målbare endringer eller til og med rasjonelt manipulere forskjellige proteinegenskaper. Her demonstrerer studien nytten av SPI-metoden for å studere rollen som proliner i organiseringen av den typiske β-fatstrukturen av spektralvarianter av det grønne fluorescerende proteinet (GFP) med 10-15 proliner i sekvensen: forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), NowGFP og KillerOrange. Pro rester er til stede i forbindelsesseksjoner mellom individuelle β-tråder og utgjør lukkelokkene på fatets stillas, og er dermed ansvarlig for isolasjon av kromofor fra vann, det vil si fluorescensegenskaper. Selektive trykkinkorporeringsforsøk med (4R)-fluoroprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluoroprolin (Dfp) og 3,4-dehydroprolin (Dhp) ble utført ved hjelp av en proline-auxotrofisk E. coli-stamme som uttrykksvert. Vi fant at fluorescerende proteiner med S-Flp og Dhp er aktive (dvs. fluorescerende), mens de to andre analogene (Dfp og R-Flp) produserte dysfunksjonelle, feilfoldede proteiner. Inspeksjon av UV-Vis absorpsjon og fluorescensutslippsprofiler viste få karakteristiske endringer i proteinene som inneholder Pro-analoger. Undersøkelse av de sammenleggbare kinetiske profilene i EGFP-varianter viste en akselerert omfoldingsprosess i nærvær av S-Flp, mens prosessen lignet villtype i proteinet som inneholder Dhp. Denne studien viser kapasiteten til SPI-metoden for å produsere subtile modifikasjoner av proteinrester på atomnivå ("molekylær kirurgi"), som kan vedtas for studiet av andre proteiner av interesse. Det illustrerer resultatene av proline erstatninger med nære kjemiske analoger på folding og spektroskopiske egenskaper i klassen av β-fat fluorescerende proteiner.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

For å overvinne begrensningene til klassisk stedsstyrt mutagenese ble prolineanaloger med spesifikke modifikasjoner innlemmet i flere fluorescerende proteiner. Vi viser hvordan utskifting av hydrogen ved fluor eller av singel ved doble bindinger i prolinrester ("molekylær kirurgi") påvirker grunnleggende proteinegenskaper, inkludert folding og interaksjon med lys.

Rester-spesifikk utveksling av proline av proline analoger i fluorescerende proteiner: Hvordan "molekylær kirurgi" av ryggraden påvirker folding og stabilitet

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

I de fleste tilfeller er konvensjonell stedsstyrt mutagenese ikke hensiktsmessig for å studere prolines funksjonelle rolle i proteiner. Her presenterer vi en metode for å inkorporere prolinanaloger som ikke-kanoniske aminosyrer i ribosomalt syntetiserte proteiner for å undersøke rollen som prolinrester på proteinfolding og funksjon. Substitusjon av proliner med standard aminosyrer er en risikabel tilnærming.Inkorporering av proline analoger tillater en slags molekylær kirurgi. Med andre ord introduserer den subtile molekylære endringer for å rasjonelt påvirke og manipulere proteinegenskaper. Siden prolinrester spiller en viktig rolle i stabiliteten til proteinstillaser, kan teknologien vår være nyttig for å forstå årsakene bak proteinfoldende underskudd, som ligger til grunn for visse patologiske tilstander hos mennesker.Proteinendringene forårsaket av proline-erstatninger har implikasjoner for bioteknologisk prosjektering av enzymer og gir muligheter for forbedring av ribosomal proteinoversettelse eller folding. Denne metoden krever ikke spesialutstyr og dyr instrumentering. Spesiell forsiktighet bør tas med protokolltrinn, der innfødt proline er utarmet fra E.coli-kulturer før tilsetning av prolineanaloger.For å starte produksjonen av fluorescerende proteiner med innfødt prolin, inokuler 200 milliliter fersk NMM medium i en to-liters Erlenmeyer kolbe med to milliliter av nattkulturen. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i en orbital shaker ved 220 RPM i ca. 3,5 timer. Under inkubasjonen måler du den optiske tettheten ved 600 nanometer i et spektrofotometer hvert 30.Når den optiske tettheten når 0,7, snurr du ned cellefjæringen og dekanterer forsiktig supernatanten til avfall. Vask deretter cellene ved å resuspendere i 50 milliliter iskald NMM uten aminosyrer eller NMM uten prolin. Snurr cellene igjen og dekanter supernatanten i avfall.Deretter resuspenderer du cellepellet ved forsiktig pipettering i 200 milliliter NMM uten proline og supplert med ampicillin i en to-liters Erlenmeyer-kolbe, og inkuberer cellene i en orbital shaker i 30 minutter for å tillate fullstendig uttømming av proline. Etter inkubasjon, legg til et passende volum av enten L-proline eller proline analoger fra 50 millimolar lagerløsninger for å oppnå en en millimolar sluttkonsentrasjon i cellefjæringen. Deretter induser målproteinuttrykk ved å legge til 500-mikromolar IPTG fra en en-molar lagerløsning.Uttrykk målproteinet over natten ved 37 grader Celsius i en orbital shaker og mål den optiske tettheten neste dag. Samle bakteriecellene ved sentrifugering og dekanter supernatanten i avfall. Vask deretter cellene ved forsiktig pipettering i 50 milliliter bindingsbuffer som inneholder 10% glyserol.Snurr cellene igjen, dekanter supernatanten og oppbevar cellepelleten i et 50 milliliterrør ved minus 20 eller 80 grader Celsius til videre bruk. Før du evaluerer fluorescensutslipp, må du utføre en SDS-PAGE for å sikre at prøverenhet er over 95%Deretter justerer du prøvene av hver renset proteinvariant til en konsentrasjon på 0,3 mikromoler, og tar den beregnede absorbansverdien ved riktig bølgelengde som referanse. Kontroller at det omtrentlige endelige prøvevolumet er 200 mikroliter.La de fortynnede prøvene likevekt ved romtemperatur. Etter en time, overfør prøvene til en kvartskumette og mål fluorescensutslippsspekteret til prøvene ved hjelp av et fluorescensspektrometer. For å indusere denaturering, fortynn prøvene av hver proteinvariant tjue ganger ved å legge til to mikroliter 300-mikromolarprøver til 18 mikroliter 1,11X PBS-buffer som inneholder 8,89-molar urea og 5,56 millimolar DTT.Inkuber prøvene ved 95 grader Celsius i fem minutter. Fortynn deretter prøvene 100 ganger ved å legge til 1980 mikroliter PBS som inneholder fem millimolar DTT for å indusere renaturering og umiddelbart overføre 200 mikroliter av prøvene til en kvartskruvat. Sett kvarts cuvette inn i et passende fluorescensspektrometer og overvåk proteinfolding ved å skaffe seg et fluorescensspekter hvert tredje sekund over 30 minutter.Overfør brettingsprøvene til mikrosenterrør på 1,5 milliliter, lukk deretter lokket og oppbevar prøvene ved romtemperatur i mørket for å tillate fullstendig bretting av EGFP-varianter. Etter 24 timer måler du fluorescensutslipp av de brettede proteinprøvene ved hjelp av samme eksitasjonsbølgelengde som før for å fange det tidsmessige endepunktet for fluorescensgjenvinning. Pellets fra celler som uttrykker innfødt protein og varianter som bærer S-fluoroprolin og dehydroprolin hadde en typisk lys farge på grunn av intakt kromofor.I kontrast forble varianter som inneholder R-fluoroprolin og difluoroprolin fargeløs, noe som indikerer feilfolding og avsetning av utfoldet protein i inklusjonslegemer. SDS-PAGE-analyse verifiserte tilstedeværelsen av uoppløselige R-fluoroprolinholdige proteiner. I motsetning ble innfødte proteiner og S-fluoroprolin og dehydroproline-bærende varianter funnet i de oppløselige fraksjonene.I væskekromatografi/massespektrometrianalyse produserte hver proline-erstatning med S-fluoroprolin et positivt 18-dalton skift per prolinerester, mens utskifting med dehydroprolin ga et negativt skifte på to dalton per rest. I lysabsorpsjon og utslippsspektra ble kromoforabsorbering funnet ved 488 nanometer for EGFP og 493 nanometer for NowGFP. I KillerOrange besto kromoforabsorberingsregionen av to bånd som tilsvarer to mulige konfigurasjons- og ladetilstander i den komplekse kromoforen.Videre antydet fluorescensspektra registrert ved eksitasjon ved de tilsvarende maksimale absorbansbølgelengdene at analogene ikke endret kromoforenes kjemiske miljø. I refolding eksperimenter, den innfødte EGFP kromofor fluorescens gjenvunnet delvis, selv om tryptofan-spesifikk fluorescens var større etter renaturation. Lignende oppførsel ble observert for varianten som inneholder dehydroprolin.I EGFP-inneholdende S-fluoroprolin ble det observert et lignende resultat med en eksitasjon på 295 nanometer, mens fluorescens gjenvunnet i mye høyere grad ved 488 nanometer. Bare EGFP-variantene viste rask refolding kinetikk med tryptofan utslipp utvinning er dobbelt så rask sammenlignet med kromofor utslipp. Friske bakteriekulturer med egnede vekstmedier må brukes.Sterile teknikker og regelmessig overvåking av kulturvekst er også viktige forutsetninger for å lykkes med eksperimentet. Denne metoden gjelder for proteinteknikk, da den gjør det mulig å studere rollen til andre kanoniske aminosyrer. For dette er det nødvendig med egnede auxotrofiske E.coli-stammer og aminosyreanaloger.Massespektrometri av hele proteiner er nødvendig som analytisk bevis for å bekrefte inkorporering av ikke-kanoniske aminosyreanaloger. SPI-metoden for å inkorporere prolineanaloger gjør at vi kan manipulere proteinrygden direkte, og tilbyr fordeler for rasjonell design og tilrettelagt produksjon av proteiner gjennom global stabilisering og forbedring av ribosomal oversettelse eller folding.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisere Proteiner og makromolekylær komplekser ved Negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Microfluidic Mixers for å studere Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifisering av Global diastolisk funksjon av Kinetisk modellering basert analyse av transmitral Flow via Parametrized diastolisk Fylling formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Levering av proteiner, peptider eller celle-ugjennomtrengelig små molekyler inn i levende celler ved inkubasjon med den Endosomolytic Reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

Sammenslåing Ion Konsentrasjon Polarisering mellom sidestilt ionebyttermembraner å blokkere Formering av Polarisering Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting brusk og huden vev Analogs utnytte en roman passiv miksing enhet teknikk for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...