Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Эта работа была поддержана Немецким исследовательским фондом (Кластер передового опыта «Унифицированные системы в катализе») для T.F. и N.B. и Федеральным министерством образования и науки (программа BMBF «HSP 2020», TU-WIMIplus Project SynTUBio) для F.-J.S. и Т.М.Т.Т.

Авторы раскрывают все и любые конфликты интересов.

В природе манипуляции с белковыми структурами и функциями обычно происходят из-за мутаций, явления, которое приводит к обмену аминокислотной идентичностью в определенных положениях в последовательности белка. Этот природный механизм широко применяется в качестве биотехнологического метода белковой инженерии в форме мутагенеза и опирается на репертуар 20 канонических аминокислот, участвующих в процессе. Однако обмен остатков пролина проблематичен. Из-за своей особой архитектуры магистральной группы он едва ли взаимозаменяем с оставшимися 19 остатками для замены72. Например, пролин обычно известен как разрушитель вторичной структуры в полипептидных последовательностях из-за его плохой совместимости с наиболее распространенными вторичными структурами, то есть α-спиралью и β-цепью. Эта функция пролина легко теряется, когда остаток мутирует в другую аминокислоту из общего репертуара. Замена пролина его химическими аналогами предлагает альтернативный подход, позволяющий сохранить основные системообразующие особенности родительского пролинового остатка при наложении смещения на его специфические конформационные переходы или получении модуляций молекулярного объема и полярности. Например, можно снабжать бактериальные культуры аналоговыми структурами, такими как гидрокси-, фтор-, алкил-, дегидропролины, структуры, имеющие переменные размеры колец и т.д., тем самым облегчая выработку белка, содержащего специфические изменения пролинового остатка.
Метод селективного включения давления (SPI), описанный в этом исследовании, позволяет осуществить глобальную, т.е. специфическую для остатка замену всех пролинов в целевом белке родственными химическими аналогами. О важности метода свидетельствует тот факт, что SPI позволяет создавать изменения последовательностей, недоступные для распространенных методов мутагенеза. Например, он позволяет производить целевой белок, содержащий довольно небольшие структурные изменения, которые обычно не могут превышать одного или двух замен/делеций/добавлений атомов, как показано в данном исследовании. Такие модификации белка называют «атомными мутациями»73,74. В флуоресцентном белке, таком как GFP, результат этого молекулярного вторжения можно увидеть в скорости сворачивания, локальных полярностях, белковой упаковке, стабильности вовлеченных структурных особенностей. Изменения абсорбционных и флуоресцентных свойств производятся косвенно за счет влияния на сворачивание белка и остаточные микросреды. Точность молекулярных изменений, выполняемых SPI, как правило, намного выше, по сравнению с мутациями пролинов к другим каноническим остаткам, причем последние, как правило, вредны для сворачивания, производства и выделения белка.
В качестве метода производства подход SPI использует субстратную толерантность кармана аминоацил-тРНК-синтетазы к химическим аналогам нативной аминокислоты. Синтетаза отвечает за правильную идентификацию аминокислотной структуры, в то время как включение в белки происходит вниз по течению в процессе трансляции. Инструментально, производство, выделение и очистка белка в SPI выполняются способом, типичным для любых других методов экспрессии рекомбинантного белка; однако с некоторыми дополнениями к протоколу следующим образом: Пролин, который должен быть заменен, предоставляется в начале процесса ферментации, так что клетки могут расти и развивать свой неповрежденный клеточный механизм. Однако клеточной культуре не дают достичь максимальной оптической плотности, чтобы удержать клетки в логарифмической фазе, оптимальной для экспрессии белка. На данный момент существует два основных варианта метода SPI. В первом концентрацию пролина корректируют в исходной питательной среде (химически определенной среде) таким образом, что истощение пролина происходит без какого-либо внешнего вторжения. Клетки выхлопывают пролин в среде до того, как смогут выйти из логарифмической фазы роста, а затем, впоследствии, добавляется аналог, и индуцируется интересующий белок. Во втором варианте способа клетки выращивают в среде, содержащей пролин, до середины их логарифмической фазы. В этот момент клетки следует вынуть и физически перенести в другую среду, которая уже не содержит пролина, только аналог, с последующей индукцией интересующего белка. В обоих вариантах аналог и реагент индукции белка обеспечиваются предварительно выращенным клеткам. Выделение и очистка белка дикого типа выполняются так же, как и для вариантов. В принципе, каждый доступный проауксотрофный штамм может быть использован в качестве экспресс-хоста. Тем не менее, рекомендуется проводить экспрессионные тесты для определения наиболее подходящего хоста. Кроме того, тесты различных химически определенных сред могут быть использованы для оптимизации выхода белка.
Существуют определенные требования в отношении химических аналогов, которые необходимо учитывать для SPI, такие как растворимость и концентрация. Метаболическая доступность и поглощение аминокислот зависят от количества растворенных молекул в среде. Для повышения растворимости того или иного соединения могут быть выбраны слабокислые или щелочные условия. Поскольку искусственные молекулы могут вызывать ингибирующие рост эффекты из-за их клеточной токсичности, концентрация должна быть снижена до минимума, чтобы избежать клеточного стресса75.
Незначительным недостатком SPI является снижение эффективности регистрации с большим количеством позиций, которые необходимо обменять. В принципе, снижение частоты аминокислот в целевой биомолекуле путем сайт-направленного мутагенеза может решить эту проблему. Однако структурные и функциональные свойства желаемого белка могут быть затронуты изменением первичной структуры.
Как упоминалось ранее, SPI позволяет специфическую для остатка замену канонической аминокислоты. Это означает, что неканонические аминокислоты вставляются в каждое положение канонической аминокислоты в целевом белке, включая консервированные остатки, которые необходимы для функции белка или сворачивания. Альтернативные методы инкорпорации на конкретном участке являются единственной возможностью преодолеть эту проблему3. В последние несколько десятилетий был разработан метод ортогональной пары, который может продуцировать белки, содержащие модифицированные остатки в заранее определенных местах. Наиболее распространенная модификация этого метода известна как подавление стоп-кодона. Этот метод основан на инженерной ортогональной системе трансляции, предназначенной для конкретного включения синтетических аминокислот76. Более 200 аминокислот с различными модификациями боковой цепи были включены в белки на сегодняшний день с использованием этого подхода77. Однако эти системы трансляции все еще не подходят для вставки аналогов пролина в белки-мишени. Кроме того, эффективность метода считается низкой в случае незначительных аминокислотных модификаций, поскольку некоторая фоновая распущенность аминоацил-тРНК-синтетазы обычно остается в инженерных системах трансляции.
Используя SPI, мы произвели ряд β-бочковых вариантов флуоресцентного белка и изучили результаты обмена пролина с его неестественными аналогами. В случае замены пролина R-Flp и Dfp дисфункциональный белок продуцировался экспресс-хозяином. Эффект, вероятно, вызван неправильным сворачиванием белка. Последний может происходить от конформацииC4-экзо, продвигаемой R-Flp, которая не благоприятствует родительским белковым структурам 27. При Dfp неправильное сворачивание, вероятно, будет вызвано уменьшением скорости изомеризации транс-цис-пептидной связи в пролиновом остатке27. Последний, как известно, является одной из ограничивающих стадий в кинетическом профиле сворачивания белка, который влияет на образование β и последующее созревание хромофора. Действительно, для обеих аминокислот, R-Flp и Dfp, производство белка привело к агрегированному и нерастворимому белку. Следовательно, образование хромофоров не могло произойти, и флуоресценция была полностью потеряна. Однако при S-Flp и Dhp наблюдалось надлежащее созревание белка, в результате чего образовывались флуоресцентные образцы белка для каждой комбинации аналог/белок. Несмотря на некоторые модуляции в особенностях поглощения и флуоресценции белка, они в значительной степени оставались похожими на таковые у белков дикого типа. Эффект аминокислотного замещения был выявлен в исследованиях кинетики рефолдирования. Последний показал более быстрое переворачивание в случае замены на S-Flp. Модельные исследования показали, что этот остаток может генерировать некоторое улучшение скорости вращения транс-цис-амида и приводить к образованию конформации C 4-endo. Оба эти фактора, вероятно, будут способствовать благотворному кинетическому эффекту этого остатка в EGFP. Напротив, Dhp продуцировал кинетические профили складывания, максимально похожие на родительский белок. Разнообразие результатов, полученных простыми атомными мутациями в исследуемых флуоресцентных белках, иллюстрирует потенциал метода производства SPI в изменении свойств целевого белка. Изменения белка, вызванные заменой пролина аналогами, имеют дальнейшие последствия для разработки ферментов78,79,80 и ионных каналов 81,82, а также для общей инженерии стабильности белка.
Основным ограничением метода SPI является его режим «все или ничего» при обмене пролина на родственные аналоги. Было бы очень полезно иметь возможность точно выбирать, какие остатки пролина должны быть заменены аналогами, а какие должны оставаться немодифицированными. Однако в настоящее время не существует техники, которая могла бы выполнить такое сложное производство с использованием микробного производственного хозяина. Химический синтез белков83,84, а также бесклеточнаяпродукция 85,86 являются двумя альтернативными методами, которые могут производить позиционно-специфические модификации пролина. Тем не менее, их эксплуатационная сложность и низкая производительность делают их более низкими по сравнению с производством в живых клетках. На данный момент SPI остается наиболее простым и надежным подходом к производству сложных белков, несущих атомные мутации. Путем введения неестественных заменителей аминокислот способ позволяет целенаправленно модифицировать особенности белка, что иллюстрируется здесь изменениями в сворачивании и поглощении света / излучении флуоресцентных белков, генерируемых заменителями пролина.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

Замена остатков пролина (Pro) в белках традиционным сайт-направленным мутагенезом любой из оставшихся 19 канонических аминокислот часто наносит ущерб сворачиванию белка и, в частности, созреванию хромофора в зеленых флуоресцентных белках и связанных с ними вариантах. Разумной альтернативой является манипулирование трансляцией белка таким образом, чтобы все остатки Pro были заменены остатками, в частности аналогами, методом, известным как селективное включение давления (SPI). Встроенные химические модификации могут быть использованы в качестве своего рода «молекулярной хирургии» для тонкого рассечения измеримых изменений или даже рационального манипулирования различными свойствами белка. Здесь исследование демонстрирует полезность метода SPI для изучения роли пролинов в организации типичной β-бочковой структуры спектральных вариантов зеленого флуоресцентного белка (GFP) с 10-15 пролинами в их последовательности: усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), NowGFP и KillerOrange. Остатки Pro присутствуют в соединительных секциях между отдельными β-нитями и составляют закрывающие крышки каркаса ствола, тем самым отвечая за изоляцию хромофора от воды, т.е. флуоресцентные свойства. Эксперименты селективного включения давления с (4R)-фторпролином (R-Flp), (4S)-фторпролином (S-Flp), 4,4-дифторпролином (Dfp) и 3,4-дегидропролином (Dhp) проводили с использованием пролин-ауксотрофного штамма E. coli в качестве экспрессионного хозяина. Мы обнаружили, что флуоресцентные белки с S-Flp и Dhp активны (то есть флуоресцентны), в то время как два других аналога (Dfp и R-Flp) продуцируют дисфункциональные, неправильно свернутые белки. Проверка профилей поглощения и флуоресцентного излучения UV-Vis показала несколько характерных изменений в белках, содержащих аналоги Pro. Изучение кинетических профилей сворачивания в вариантах EGFP показало ускоренный процесс перефолдирования в присутствии S-Flp, в то время как процесс был похож на дикий тип в белке, содержащем Dhp. Это исследование демонстрирует способность метода SPI производить тонкие модификации белковых остатков на атомном уровне («молекулярная хирургия»), которые могут быть приняты для изучения других белков, представляющих интерес. Проиллюстрированы результаты замены пролина близкими химическими аналогами по складчатым и спектроскопическим свойствам в классе β-бочкообразных флуоресцентных белков.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Чтобы преодолеть ограничения классического сайт-направленного мутагенеза, аналоги пролина со специфическими модификациями были включены в несколько флуоресцентных белков. Показано, как замена водорода фтором или одинарных двойными связями в пролиновых остатках («молекулярная хирургия») влияет на фундаментальные свойства белка, включая их сворачивание и взаимодействие со светом.

Остаточно-специфический обмен пролина на аналоги пролина в флуоресцентных белках: как «молекулярная хирургия» позвоночника влияет на складчатость и стабильность

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

В большинстве случаев обычный сайт-направленный мутагенез не подходит для изучения функциональной роли пролинов в белках. Здесь мы представляем метод включения аналогов пролина в качестве неканонических аминокислот в рибосомно-синтезированные белки для исследования роли остатков пролина в сворачивании и функции белка. Замена пролинов стандартными аминокислотами является рискованным подходом.Включение аналогов пролина позволяет провести своего рода молекулярную хирургию. Другими словами, он вводит тонкие молекулярные изменения, чтобы рационально влиять и манипулировать свойствами белка. Поскольку остатки пролина играют важную роль в стабильности белковых каркасов, наша технология может быть полезна для понимания причин дефицита сворачивания белка, который лежит в основе определенных патологических состояний у людей.Изменения белка, индуцированные заменителями пролина, имеют значение для биотехнологической инженерии ферментов и предоставляют возможности для усиления трансляции или сворачивания рибосомного белка. Этот способ не требует специального оборудования и дорогостоящей аппаратуры. Особую осторожность следует соблюдать с протокольными этапами, при которых нативный пролин истощается из культур E.coli до добавления аналогов пролина.Чтобы начать производство флуоресцентных белков с нативным пролином, инокулируют 200 миллилитров свежей среды NMM в двухлитровую колбу Эрленмейера двумя миллилитрами ночной культуры. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в орбитальном шейкере при 220 об/мин в течение примерно 3,5 часов. Во время инкубации измеряйте оптическую плотность на 600 нанометрах в спектрофотометре каждые 30 минут.Когда оптическая плотность достигнет 0,7, раскрутите суспензию ячейки и осторожно декантируйте супернатант в отходы. Затем промывайте клетки, повторно используя в 50 миллилитрах ледяного NMM без каких-либо аминокислот или NMM без пролина. Снова раскрутите клетки и превратите супернатант в отходы.Затем повторно суспендируют клеточную гранулу путем мягкой пипетки в 200 миллилитрах НММ без пролина и дополняют ампициллином в двухлитровой колбе Эрленмейера и инкубируют клетки в орбитальном шейкере в течение 30 минут, чтобы обеспечить полное истощение пролина. После инкубации добавляют соответствующий объем либо L-пролина, либо аналогов пролина из 50-миллимолярных стоковых растворов для получения одномиллимолярной конечной концентрации в клеточной суспензии. Затем индуцируйте экспрессию целевого белка путем добавления 500-микромолярного IPTG из одномолярного раствора.Экспрессируйте целевой белок в течение ночи при 37 градусах Цельсия в орбитальном шейкере и измерьте оптическую плотность на следующий день. Соберите бактериальные клетки путем центрифугирования и декантируйте супернатант в отходы. Затем промыть клетки путем тщательного пипетирования в 50 миллилитрах связывающего буфера, содержащего 10% глицерина.Снова раскрутите ячейки, декантируйте супернатант и храните гранулу ячейки в 50-миллилитровой трубке при минус 20 или 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Перед оценкой флуоресцентного излучения выполните SDS-PAGE, чтобы убедиться, что чистота образца выше 95%Затем отрегулируйте образцы каждого очищенного варианта белка до концентрации 0,3 микромоли, взяв рассчитанное значение поглощения на соответствующей длине волны в качестве эталона. Убедитесь, что приблизительный конечный объем образца составляет 200 микролитров.Пусть разбавленные образцы уравновешиваются при комнатной температуре. Через час перенесите образцы в односантиметровую кварцевую кювету и измерьте спектр флуоресцентного излучения образцов с помощью флуоресцентного спектрометра. Чтобы индуцировать денатурацию, разбавьте образцы каждого варианта белка в двадцать раз, добавив два микролитра 300-микромолярных образцов к 18 микролитрам буфера 1,11X PBS, содержащего 8,89-молярной мочевины и 5,56-миллимолярного DTT.Инкубируйте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем разбавьте образцы в 100 раз, добавив 1 980 микролитров PBS, содержащих пятимимолярный DTT, чтобы вызвать ренатурацию и немедленно перенесите 200 микролитров образцов в односантиметровую кварцевую кювету. Вставьте кварцевую кювету в соответствующий флуоресцентный спектрометр и контролируйте повторное сворачивание белка, приобретая спектр флуоресценции каждые три секунды в течение 30 минут.Перенесите повторно складывающиеся образцы в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки, затем закройте крышку и храните образцы при комнатной температуре в темноте, чтобы обеспечить полное повторное складывание вариантов EGFP. Через 24 часа измерьте флуоресцентное излучение восстановленных образцов белка, используя ту же длину волны возбуждения, что и раньше, чтобы захватить временную конечную точку восстановления флуоресценции. Гранулы из клеток, экспрессирующих нативный белок и варианты, несущие S-фторпролин и дегидропролин, имели типичный яркий цвет благодаря интактному хромофору.Напротив, варианты, содержащие R-фторпролин и дифторпролин, оставались бесцветными, что указывает на неправильное сворачивание и осаждение развернутого белка в телах включения. Анализ SDS-PAGE подтвердил наличие нерастворимых R-фторпролинсодержащих белков. Напротив, в растворимых фракциях были обнаружены нативные белки и S-фторпролиновые и дегидропролинсодержащие варианты.В анализе жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии каждая замена пролина S-фторпролином производила положительный сдвиг 18-дальтон на остаток пролина, в то время как замена дегидропролином приводила к отрицательному сдвигу в два дальтона на остаток. В спектрах поглощения света и излучения поглощение хромофора было обнаружено на уровне 488 нанометров для EGFP и 493 нанометров для NowGFP. В KillerOrange область поглощения хромофора состояла из двух полос, соответствующих двум возможным конфигурационным и зарядовым состояниям комплексного хромофора.Кроме того, флуоресцентные спектры, регистрируемые при возбуждении на соответствующих максимальных длинах волн поглощения, подразумевали, что аналоги не изменяют химическую среду хромофоров. В экспериментах по рефолдированию нативная флуоресценция хромофора EGFP частично восстановилась, хотя триптофан-специфическая флуоресценция была больше после ренатурации. Аналогичное поведение наблюдалось для варианта, содержащего дегидропролин.У EGFP-содержащего S-фторпролина аналогичный результат наблюдался при 295-нанометровом возбуждении, в то время как флуоресценция восстанавливалась в гораздо большей степени при 488 нанометрах. Только варианты EGFP показали быструю кинетику повторного складывания, при этом восстановление эмиссии триптофана было в два раза быстрее по сравнению с эмиссией хромофора. Необходимо использовать свежие бактериальные культуры с подходящими питательными средами.Стерильные методики и регулярный мониторинг роста культуры также являются важными предпосылками успеха эксперимента. Этот метод применим к белковой инженерии, так как позволяет изучать роль других канонических аминокислот. Для этого нужны подходящие ауксотрофные штаммы E.coli и аминокислотные аналоги.Масс-спектрометрия цельных белков требуется в качестве аналитического доказательства для подтверждения включения неканонических аналогов аминокислот. Метод SPI для включения аналогов пролина позволяет нам напрямую манипулировать белковой основой и предлагает преимущества для рационального проектирования и облегчения производства белков за счет глобальной стабилизации и улучшения рибосомной трансляции или сворачивания.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Термодинамика Мембранные белки Складные Измеряется флуоресцентной спектроскопии

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Флуоресцентные наночастицы для измерения концентрации ионов в биологических системах

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Изготовление Электрохимические ДНК-биосенсоры для Безреагентная Обнаружение нуклеиновых кислот, белков и малых молекул

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Визуализация белков и макромолекулярных комплексов по Отрицательные пятна EM: от сетки Подготовка к Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Микрофлюидных Смесители для изучения сворачивания белков

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Количественная оценка глобальной диастолической функции по кинематическая Моделирование на основе анализа трансмитрального кровотока через Заполнение формализма Параметризованный диастолической

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Доставка белки, пептиды или сотовых непроницаемый малых молекул в живых клетках при инкубации с эндосомолитического реагента dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

Слияние концентрации ионов поляризация между Сочетавший ионообменные мембраны для блокирования распространения радиоволн в поляризационных зоны

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...