Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) a T.F. y N.B. y por el Ministerio Federal de Educación y Ciencia (Programa BMBF "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) a F.-J.S. y T.M.T.T.

Los autores revelan todos y cada uno de los conflictos de intereses.

En la naturaleza, las manipulaciones con estructuras y funciones de proteínas generalmente ocurren debido a mutaciones, el fenómeno que conduce a un intercambio de una identidad de aminoácido en ciertas posiciones en la secuencia de proteínas. Este mecanismo natural se aplica ampliamente como método biotecnológico para la ingeniería de proteínas en forma de mutagénesis, y se basa en el repertorio de los 20 aminoácidos canónicos involucrados en el proceso. Sin embargo, el intercambio de residuos de prolina es problemático. Debido a su arquitectura especial de grupo troncal, apenas es intercambiable con los 19 residuos restantes para el reemplazo72. Por ejemplo, la prolina se conoce típicamente como un rompedor de estructura secundaria en secuencias de polipéptidos debido a su escasa compatibilidad con las estructuras secundarias más comunes, es decir, α-hélice y β-strand. Esta característica de prolina se pierde fácilmente cuando el residuo muta a otro aminoácido del repertorio común. El reemplazo de la prolina con sus análogos químicos ofrece un enfoque alternativo, que permite mantener las características básicas de la columna vertebral del residuo de prolina parental al tiempo que impone sesgos en sus transiciones conformacionales específicas o produce modulaciones del volumen molecular y la polaridad. Por ejemplo, es posible suministrar cultivos bacterianos con estructuras análogas como hidroxi-, fluoro-, alquilo-, dehidroprolinas, estructuras que tienen tamaños de anillo variables y más, facilitando así la producción de una proteína que contiene alteraciones específicas de residuos de prolina.
El método de incorporación selectiva de presión (SPI) descrito en este estudio permite un reemplazo global, es decir, específico de residuos de todas las prolinas en la proteína objetivo con análogos químicos relacionados. La importancia del método se refleja en el hecho de que SPI permite crear cambios de secuencia inaccesibles a las técnicas comunes de mutagénesis. Por ejemplo, permite la producción de una proteína diana que contiene cambios estructurales bastante pequeños que normalmente no pueden exceder uno o dos reemplazos / deleciones / adiciones de átomos, como se demostró en este estudio. Tales modificaciones de proteínas se denominan "mutaciones atómicas"73,74. En una proteína fluorescente como GFP, el resultado de esta intrusión molecular se puede ver en la velocidad de plegamiento, las polaridades locales, el empaquetamiento de proteínas, la estabilidad de las características estructurales involucradas. Los cambios en las propiedades de absorbancia y fluorescencia se producen indirectamente debido al impacto en el plegamiento de proteínas y los microambientes de residuos. La precisión de los cambios moleculares realizados por SPI es típicamente mucho mayor, en comparación con las mutaciones de prolinas a otros residuos canónicos, siendo estos últimos típicamente perjudiciales para el plegamiento, la producción y el aislamiento de proteínas.
Como método de producción, el enfoque SPI utiliza la tolerancia al sustrato de la bolsa de aminoacil-ARNt sintetasa hacia análogos químicos del aminoácido nativo. La sintetasa es responsable de la correcta identificación de la estructura del aminoácido, mientras que la incorporación a las proteínas se produce aguas abajo en el proceso de traducción. Instrumentalmente, la producción, aislamiento y purificación de proteínas en SPI se realizan de una manera típica para cualquier otra técnica de expresión de proteínas recombinantes; sin embargo, con algunas adiciones al protocolo de la siguiente manera: Prolina, que está destinada al reemplazo, se proporciona al comienzo del proceso de fermentación, de modo que las células pueden crecer y desarrollar su maquinaria celular intacta. Sin embargo, no se permite que el cultivo celular alcance la densidad óptica máxima, para mantener las células en la fase logarítmica óptima para la expresión de proteínas. Hay dos variaciones principales del método SPI en este punto. En el primero, la concentración de prolina se ajusta en el medio de crecimiento inicial (un medio definido químicamente) de modo que el agotamiento de la prolina ocurre sin ninguna intrusión externa. Las células agotan la prolina en el medio antes de que puedan salir de la fase de crecimiento logarítmico, y luego, posteriormente, se agrega el análogo y se induce la producción de proteínas de interés. En la segunda versión del método, las células se cultivan en el medio que contiene prolina hasta la mitad de su fase logarítmica. En este punto, las células deben ser extraídas y transferidas físicamente a otro medio, que ya no contiene prolina, solo el análogo, con la posterior inducción de la proteína de interés. En ambas versiones, el análogo y el reactivo de inducción de proteínas se proporcionan a las células precultivadas. El aislamiento y la purificación de la proteína de tipo salvaje se realizan de la misma manera que para las variantes. En principio, cada cepa pro-auxotrófica disponible se puede utilizar como huésped de expresión. Sin embargo, las pruebas de expresión para identificar el huésped más adecuado son recomendables. Además, se pueden utilizar pruebas de diferentes medios definidos químicamente para optimizar el rendimiento de proteínas.
Hay ciertos requisitos con respecto a los análogos químicos que deben considerarse para SPI, como la solubilidad y la concentración. La disponibilidad metabólica y la absorción de aminoácidos dependen del número de moléculas disueltas en el medio. Para aumentar la solubilidad de un compuesto en particular, se pueden elegir condiciones ligeramente ácidas o alcalinas. Dado que las moléculas artificiales pueden causar efectos inhibidores del crecimiento debido a su toxicidad celular, la concentración debe reducirse al mínimo para evitar el estrés celular75.
Una debilidad menor de SPI es la disminución de la eficiencia de incorporación con un mayor número de posiciones que deben intercambiarse. En principio, una reducción de la frecuencia de aminoácidos dentro de la biomolécula objetivo por mutagénesis dirigida al sitio puede resolver este problema. Sin embargo, las propiedades estructurales y funcionales de una proteína deseada podrían verse afectadas por el cambio de la estructura primaria.
Como se mencionó anteriormente, SPI permite el reemplazo específico del residuo del aminoácido canónico. Esto implica que los aminoácidos no canónicos se insertan en cada posición del aminoácido canónico dentro de la proteína objetivo, incluidos los residuos conservados que son indispensables para la función o el plegamiento de la proteína. Los métodos alternativos para la incorporación específica del sitio son la única posibilidad de superar este problema3. En las últimas décadas, se ha desarrollado el método del par ortogonal que puede producir proteínas que contienen residuos modificados en sitios predefinidos. La modificación más común de este método se conoce como supresión de codones de parada. Este método se basa en un sistema de traducción ortogonal diseñado dedicado a la incorporación específica del sitio de aminoácidos sintéticos76. Más de 200 aminoácidos con diferentes modificaciones de la cadena lateral se han incorporado a las proteínas hasta la fecha utilizando este enfoque77. Sin embargo, estos sistemas de traducción todavía no son adecuados para la inserción de análogos de prolina en proteínas diana. Además, el rendimiento del método se considera bajo en el caso de modificaciones menores de aminoácidos porque cierta promiscuidad de fondo de la aminoacil-ARNt sintetasa generalmente permanece en los sistemas de traducción diseñados.
Usando SPI, producimos una serie de variantes de proteína fluorescente de barril β y estudiamos los resultados del intercambio de prolina con sus análogos no naturales. En el caso del reemplazo de prolina con R-Flp y Dfp, el huésped de expresión produjo una proteína disfuncional. Es probable que el efecto se produzca por el mal plegamiento de proteínas. Este último puede originarse a partir de la conformación C 4-exo promovida por R-Flp, que no es favorecida por las estructuras de proteínas madre27. Con Dfp, es probable que el plegamiento erróneo se produzca por la velocidad disminuida de la isomerización del enlace peptídico trans-a-cis en el residuo de prolina27. Se sabe que este último se encuentra entre los pasos limitantes en el perfil cinético del plegamiento de proteínas que afecta la formación de β barril y la posterior maduración del cromóforo. De hecho, tanto para los aminoácidos, R-Flp y Dfp, la producción de proteínas resultó en una proteína agregada e insoluble. En consecuencia, la formación de cromóforos no pudo ocurrir, y la fluorescencia se perdió por completo. Sin embargo, con S-Flp y Dhp, se observó una maduración adecuada de la proteína, lo que resultó en muestras de proteínas fluorescentes para cada combinación de análogo / proteína. A pesar de algunas modulaciones en las características de absorbancia y fluorescencia de la proteína, estas se mantuvieron en gran medida similares a las de las proteínas de tipo salvaje. El efecto de la sustitución de aminoácidos se reveló en los estudios de cinética de repliegue. Este último mostró un repliegue más rápido en el caso de reemplazo con S-Flp. Los estudios del modelo han demostrado que este residuo puede generar cierta mejora en la velocidad de rotación de la amida trans-a-cis y conducir a la formación de la conformación C 4-endo. Es probable que ambos factores contribuyan a los efectos cinéticos beneficiosos de este residuo en EGFP. En contraste, Dhp produjo perfiles cinéticos de plegamiento máximamente similares a la proteína madre. La diversidad de los resultados producidos por meras mutaciones atómicas en las proteínas fluorescentes examinadas ilustra el potencial del método de producción spi para alterar las propiedades de las proteínas diana. Las alteraciones proteicas inducidas por el reemplazo de prolina con los análogos tienen implicaciones adicionales en la ingeniería de las enzimas 78,79,80 y los canales iónicos 81,82, así como en la ingeniería general de la estabilidad de las proteínas.
La limitación básica del método SPI es su modo "todo o ninguno" en el intercambio de prolina reside con análogos relacionados. Sería muy ventajoso poder seleccionar con precisión, qué residuos de prolina deben reemplazarse por los análogos y cuáles deben permanecer sin modificar. Sin embargo, en la actualidad, no existe ninguna técnica que pueda realizar una producción tan sofisticada utilizando un huésped de producción microbiana. La síntesis química de proteínas83,84, así como la producción libre de células85,86, son los dos métodos alternativos que pueden producir modificaciones de prolina específicas de la posición. Sin embargo, su complejidad operativa y sus bajos rendimientos de producción los hacen inferiores en comparación con la producción en células vivas. A partir de ahora, SPI sigue siendo el enfoque más simple y robusto desde el punto de vista operativo para la producción de proteínas complejas portadoras de mutaciones atómicas. Al introducir sustitutos de aminoácidos no naturales, el método permite modificar las características de las proteínas de una manera específica, como lo ejemplifican aquí las alteraciones en el plegamiento y la absorción / emisión de luz de las proteínas fluorescentes generadas por los reemplazos de prolina.

La mutagénesis clásica dirigida al sitio permite la permutación de cualquier secuencia de proteínas codificada por genes existente mediante la manipulación de codones a nivel de ADN. Para estudiar el plegamiento y la estabilidad de las proteínas, a menudo es deseable reemplazar aminoácidos similares con contrapartes similares. Sin embargo, la mutagénesis proteica tradicional se limita definitivamente a reemplazos estructuralmente similares entre aminoácidos canónicos como Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, que están presentes en el repertorio de código genético estándar. Por otro lado, no existen tales posibilidades para otros aminoácidos canónicos como Trp, Met, His o Pro, que a menudo desempeñan funciones estructurales y funcionales esenciales en las proteínas1. Un enfoque ideal para estudiar estas interacciones en el contexto de la arquitectura interna altamente específica de las proteínas y su proceso de plegamiento es generar modificaciones isotéricas no disruptivas. De hecho, cuando los análogos de aminoácidos isostéricos de estos aminoácidos canónicos, también conocidos como aminoácidos no canónicos (ncAA), se insertan en las proteínas, permiten cambios sutiles incluso a nivel de átomos individuales o grupos atómicos como H / F, CH2 / S / Se / Te conocidos como "mutaciones atómicas"2. Dicha "cirugía molecular" produce proteínas alteradas cuyas propiedades resultan únicamente del intercambio de átomos individuales o grupos de átomos, que en casos favorables pueden ser analizados, y los cambios detectados pueden ser racionalizados. De esta manera, el alcance de la síntesis de proteínas para estudiar el plegamiento y la estructura de las proteínas se extiende mucho más allá de la mutagénesis clásica del ADN. Tenga en cuenta que las proteínas generadas por la mutagénesis dirigida al sitio generalmente se denominan "mutantes", mientras que las proteínas con aminoácidos canónicos sustituidos se denominan "variantes" 3, "aloproteínas"4 o "congéneres de proteínas"5.
La proteína verde fluorescente (GFP), identificada por primera vez en el organismo marino Aequorea victoria, exhibe fluorescencia verde brillante cuando se expone a la luz ultravioleta a azul 6,7. Hoy en día, GFP se utiliza comúnmente como una herramienta de etiquetado altamente sensible para la visualización rutinaria de la expresión génica y la localización de proteínas en las células a través de la microscopía fluorescente. GFP también ha demostrado ser útil en varios estudios biofísicos 8,9,10 y biomédicos 11,12, así como en ingeniería de proteínas 13,14,15. El análisis riguroso de la estructura GFP permitió la creación de numerosas variantes caracterizadas por una estabilidad variada y fluorescencia máxima16,17. La mayoría de las variantes de GFP utilizadas en biología celular y molecular son proteínas monoméricas tanto en solución como en el cristal18. Su organización estructural principal es típica de todos los miembros de la familia GFP, independientemente de su origen filogenético, y consiste en 11 hebras β que forman un llamado β-barril, mientras que una α-hélice torcida corre por el centro del barril y lleva el cromóforo (Figura 1A). La maduración autocatalítica del cromóforo (Figura 1B) requiere el posicionamiento preciso de las cadenas laterales que lo rodean en el lugar central de la proteína; muchas de estas cadenas laterales están muy conservadas en otras variantes de GFP19. En la mayoría de las proteínas fluorescentes de medusas como Aequorea victoria, el cromóforo emisor de verde consiste en dos anillos aromáticos, incluido un anillo de fenol de Tyr66 y la estructura heterocíclica de cinco miembros de imidazolinona (Figura 1B). El cromóforo, cuando está correctamente incrustado en la matriz proteica, es responsable de la fluorescencia característica de toda la proteína. Se encuentra en el centro de la estructura, mientras que la estructura del barril lo aísla del medio acuoso20. La exposición del cromóforo al agua a granel daría lugar a un enfriamiento de la fluorescencia, es decir, pérdida de fluorescencia21.
El plegado adecuado de la estructura en forma de barril es esencial para proteger el cromóforo contra el enfriamiento por fluorescencia22. Los residuos de prolina (Pro) desempeñan un papel especial en la organización estructural de GFP23. Al no poder soportar una cadena de β, constituyen bucles de conexión responsables de mantener la estructura de la proteína en su conjunto. No es sorprendente que se encuentren residuos de 10-15 prolina en los GFP derivados de Aequorea y Anthoathecata; algunos de ellos están altamente conservados en otros tipos de proteínas fluorescentes β barril. Se espera que las prolinas influyan críticamente en las propiedades de plegamiento debido a sus características geométricas peculiares. Por ejemplo, en los GFP derivados de Aequorea, de los diez residuos de prolina (Figura 2A), nueve forman trans- y solo uno forma un enlace cis-peptídico (Pro89). Pro58 es esencial, es decir, no intercambiable con el resto de los 19 aminoácidos canónicos. Este residuo puede ser responsable del posicionamiento correcto del residuo Trp57, que se ha informado que es crucial para la maduración del cromóforo y el plegamiento general de GFP24. El fragmento PVPWP con tres residuos de prolina (Pro54, Pro56, Pro58) y Trp57 es la parte esencial del "párpado inferior" en la estructura GFP de la Figura 1A. El motivo estructural PVPWP se encuentra en varias proteínas como los citocromos y los canales de potasio activados por voltaje eucariota25. Las sustituciones de prolina a alanina en las posiciones 75 y 89 también son perjudiciales para la expresión y el plegamiento de proteínas y abolen la maduración del cromóforo. Pro75 y Pro89 son parte del "párpado superior" que entierra el cromóforo (Figura 1A) y se conservan a través de proteínas fluorescentes de 11 hebras β barril23. Estas dos "tapas" mantienen el cromóforo excluido del disolvente acuoso, incluso cuando la estructura terciaria estable se ha roto parcialmente26. Tal arquitectura molecular específica protege el fluoróforo del enfriamiento de fluorescencia colisional (dinámica), por ejemplo, por agua, oxígeno u otros ligandos difusibles.
Para realizar la ingeniería molecular de la estructura GFP, se deben introducir sustituciones de aminoácidos en la estructura primaria de la proteína. Se han realizado numerosas mutaciones en GFP, proporcionando variantes con estabilidad elevada, plegamiento rápido y confiable, y propiedades de fluorescencia variable17. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la mutación de los residuos de prolina se considera un enfoque arriesgado debido al hecho de que ninguno de los 19 aminoácidos canónicos restantes puede restaurar adecuadamente el perfil conformacional del residuo de prolina27. Por lo tanto, se ha desarrollado un enfoque alternativo, en el que los residuos de prolina se reemplazan con otras estructuras basadas en prolina, denominadas análogos de prolina28. Debido a su estructura química cíclica única, la prolina exhibe dos transiciones conformacionales características (Figura 1C): 1) el fruncido del anillo de prolina, un proceso rápido que implica la organización de la columna vertebral, que afecta principalmente el ángulo de torsión φ, y 2) la isomerización cis / trans del enlace peptídico, un proceso lento que afecta el plegamiento de la columna vertebral a través de los ángulos de torsión ω. Debido a su naturaleza lenta, esta última transición es comúnmente responsable de los pasos limitantes de velocidad en el proceso de plegamiento de toda la proteína. Se ha demostrado anteriormente que la isomerización cis/trans de enlace peptídico alrededor de algunos residuos de prolina presenta pasos lentos en el plegamiento de las variantes de GFP. Por ejemplo, la formación del enlace cis-peptídico en Pro89 presenta el paso lento en el proceso de plegamiento porque se basa en la transición del enlace de trans a cis29. Se puede lograr un repliegue más rápido después de reemplazar Pro89 con un bucle de péptido totalmente trans, es decir, aboliendo un evento de isomerización cis-to-trans30. Además de la isomerización cis/trans, las transiciones de fruncido también pueden generar cambios profundos en el plegamiento de la proteína debido a la organización de la columna vertebral y el empaquetamiento dentro del interior de la proteína27,31.
Las modificaciones químicas resultan en la alteración de las transiciones conformacionales intrínsecas de los residuos de prolina, afectando así la capacidad de la proteína para plegarse. Ciertos análogos de prolina son candidatos particularmente atractivos para la sustitución de prolina en proteínas, ya que permiten la manipulación y el estudio de las propiedades de plegamiento. Por ejemplo, (4R)-fluoroprolina (R-Flp), (4S)-fluoroprolina (S-Flp), 4,4-difluoroprolina (Dfp) y 3,4-dehidroprolina (Dhp) son cuatro análogos (Figura 1D) que difieren mínimamente de la prolina en términos de volumen molecular y polaridad32. Al mismo tiempo, cada análogo exhibe un fruncido de anillo distinto: S-Flp estabiliza el pucker C4-endo, R-Flp estabiliza el pucker C 4-exo, Dfp no exhibe ninguna preferencia aparente de pucker, mientras que Dhp abole el fruncido (Figura 1D)33. Mediante el uso de estos análogos en la estructura de la proteína, se puede manipular con la transición conformacional de los residuos de prolina, y con esto, afectar las propiedades de las variantes GFP resultantes.
En este trabajo, nos propusimos incorporar el conjunto designado de análogos de prolina (Figura 1D) en la estructura de las variantes de GFP utilizando el método de incorporación de presión selectiva (SPI, Figura 3)34. La sustitución de residuos de aminoácidos por sus análogos isoestructurales más cercanos es un concepto biotecnológico aplicado en el diseño de proteínas35,36. Por lo tanto, los efectos de los análogos de prolina en una proteína modelo ilustran su potencial para servir como herramientas en la ingeniería de proteínas37. La producción de proteínas que contienen análogos deseados se realizó en cepas modificadas de E. coli que no son capaces de producir prolina (prolina-auxotrofia). Por lo tanto, podrían verse obligados a aceptar la sustitución de sustratos en el proceso de biosíntesis de proteínas38. Esta sustitución global de la prolina es posible gracias a la flexibilidad natural del sustrato de las aminoacil-ARNt sintetasasendógenas 39, las enzimas clave que catalizan la esterificación de los ARNt con aminoácidos apropiados40. En general, como se describe en la Figura 3, el crecimiento celular se realiza en un medio definido hasta que se alcanza la fase de crecimiento logarítmico medio. En el siguiente paso, el aminoácido a reemplazar se agota intracelularmente del sistema de expresión durante la fermentación y posteriormente se intercambia por el análogo deseado o ncAA. La expresión de proteínas diana se induce entonces para la incorporación de aminoácidos no canónicos específicos de residuos. La sustitución del aminoácido cognado con su análogo ocurre de una manera que abarca todo el proteoma. Aunque este efecto secundario puede tener un impacto negativo en el crecimiento de la cepa huésped, la calidad de la producción de proteínas objetivo no se ve afectada en su mayoría, ya que, en la expresión recombinante, los recursos celulares se dirigen principalmente a la producción de la proteína objetivo41,42. Por lo tanto, un sistema de expresión inducible y estrictamente regulado y promotores fuertes son cruciales para una alta eficiencia de incorporación43. Nuestro enfoque se basa en la incorporación de múltiples ncAA específicos de residuos en respuesta a codones de sentido (reasignación de codones de sentido), por lo que dentro del gen objetivo, el número de posiciones para la inserción analógica de Pro se puede manipular a través de mutagénesis dirigida al sitio44. Un enfoque similar se aplicó en nuestro informe anterior sobre la preparación de péptidos recombinantes con propiedades antimicrobianas45. En este trabajo, hemos aplicado el método SPI, que permite que todos los residuos de prolina sean reemplazados por análogos relacionados, para generar proteínas que se espera que posean propiedades fisicoquímicas distintas no presentes en las proteínas sintetizadas con el repertorio canónico de aminoácidos. Al caracterizar el perfil de plegamiento y fluorescencia de las variantes resultantes, nuestro objetivo es mostrar los efectos de las sustituciones atómicas en las variantes de GFP.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

La sustitución de los residuos de prolina (Pro) en las proteínas por la mutagénesis tradicional dirigida al sitio por cualquiera de los 19 aminoácidos canónicos restantes a menudo es perjudicial para el plegamiento de proteínas y, en particular, la maduración del cromóforo en proteínas fluorescentes verdes y variantes relacionadas. Una alternativa razonable es manipular la traducción de la proteína para que todos los residuos de Pro sean reemplazados específicamente por análogos, un método conocido como incorporación selectiva de presión (SPI). Las modificaciones químicas incorporadas se pueden utilizar como una especie de "cirugía molecular" para diseccionar finamente los cambios medibles o incluso manipular racionalmente las diferentes propiedades de las proteínas. Aquí, el estudio demuestra la utilidad del método SPI para estudiar el papel de las prolinas en la organización de la estructura típica de β-barril de variantes espectrales de la proteína fluorescente verde (GFP) con 10-15 prolinas en su secuencia: proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), NowGFP y KillerOrange. Los residuos Pro están presentes en las secciones de conexión entre β y constituyen las tapas de cierre del andamio del barril, siendo así responsables del aislamiento del cromóforo del agua, es decir, las propiedades de fluorescencia. Los experimentos de incorporación selectiva de presión con (4R)-fluoroprolina (R-Flp), (4S)-fluoroprolina (S-Flp), 4,4-difluoroprolina (Dfp) y 3,4-dehidroprolina (Dhp) se realizaron utilizando una cepa de E. coli prolina-auxotrófica como huésped de expresión. Encontramos que las proteínas fluorescentes con S-Flp y Dhp son activas (es decir, fluorescentes), mientras que los otros dos análogos (Dfp y R-Flp) produjeron proteínas disfuncionales y mal plegadas. La inspección de los perfiles de absorción UV-Vis y emisión de fluorescencia mostró pocas alteraciones características en las proteínas que contienen análogos Pro. El examen de los perfiles cinéticos de plegamiento en variantes de EGFP mostró un proceso de repliegue acelerado en presencia de S-Flp, mientras que el proceso fue similar al tipo salvaje en la proteína que contiene Dhp. Este estudio muestra la capacidad del método SPI para producir modificaciones sutiles de residuos de proteínas a nivel atómico ("cirugía molecular"), que pueden adoptarse para el estudio de otras proteínas de interés. Ilustra los resultados de los reemplazos de prolina con análogos químicos cercanos en las propiedades de plegamiento y espectroscópicos en la clase de proteínas fluorescentes de barril β.

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Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Para superar las limitaciones de la mutagénesis clásica dirigida al sitio, se incorporaron análogos de prolina con modificaciones específicas en varias proteínas fluorescentes. Mostramos cómo la sustitución del hidrógeno por flúor o del simple por dobles enlaces en residuos de prolina ("cirugía molecular") afecta a las propiedades fundamentales de las proteínas, incluyendo su plegamiento e interacción con la luz.

Intercambio específico de residuos de prolina por análogos de prolina en proteínas fluorescentes: cómo la "cirugía molecular" de la columna vertebral afecta el plegamiento y la estabilidad

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

En la mayoría de los casos, la mutagénesis convencional dirigida al sitio no es apropiada para estudiar el papel funcional de las prolinas en las proteínas. Aquí, presentamos un método para incorporar análogos de prolina como aminoácidos no canónicos en proteínas sintetizadas ribosómicamente para investigar el papel de los residuos de prolina en el plegamiento y la función de las proteínas. La sustitución de prolinas por aminoácidos estándar es un enfoque arriesgado.La incorporación de análogos de prolina permite un tipo de cirugía molecular. En otras palabras, introduce cambios moleculares sutiles para influir racionalmente y manipular las propiedades de las proteínas. Dado que los residuos de prolina desempeñan un papel esencial en la estabilidad de los andamios de proteínas, nuestra tecnología podría ser útil para comprender las razones detrás de los déficits de plegamiento de proteínas, que subyacen a ciertos estados patológicos en los seres humanos.Las alteraciones de proteínas inducidas por los reemplazos de prolina tienen implicaciones para la ingeniería biotecnológica de enzimas y brindan oportunidades para mejorar la traducción o plegamiento de proteínas ribosómicas. Este método no requiere equipos especiales ni instrumentación costosa. Se debe tener especial cuidado con los pasos del protocolo, en los que la prolina nativa se agota de los cultivos de E. coli antes de la adición de análogos de prolina.Para comenzar la producción de las proteínas fluorescentes con prolina nativa, inocule 200 mililitros de medio NMM fresco en un matraz Erlenmeyer de dos litros con dos mililitros del cultivo nocturno. Incubar las células a 37 grados Centígrados en un agitador orbital a 220 RPM durante aproximadamente 3,5 horas. Durante la incubación, mida la densidad óptica a 600 nanómetros en un espectrofotómetro cada 30 minutos.Cuando la densidad óptica alcance 0.7, gire hacia abajo la suspensión celular y decante suavemente el sobrenadante en desechos. Luego, lave las células resuspiéndolos en 50 mililitros de NMM helado sin aminoácidos o NMM sin prolina. Haga girar las células de nuevo y decante el sobrenadante en residuos.A continuación, resuspenda el pellet celular mediante pipeteo suave en 200 mililitros de NMM sin prolina y complementado con ampicilina en un matraz Erlenmeyer de dos litros, e incube las células en un agitador orbital durante 30 minutos para permitir el agotamiento completo de la prolina. Después de la incubación, agregue un volumen apropiado de L-prolina o los análogos de prolina de las soluciones madre de 50 milimolares para obtener una concentración final de un milimolar en la suspensión celular. A continuación, induzca la expresión de proteínas diana mediante la adición de IPTG de 500 micromolares a partir de una solución madre de un molar.Exprese la proteína objetivo durante la noche a 37 grados Celsius en un agitador orbital y mida la densidad óptica al día siguiente. Recoger las células bacterianas por centrifugación y decantar el sobrenadante en residuos. Luego, lave las células mediante un pipeteo cuidadoso en 50 mililitros de tampón de unión que contenga 10% de glicerol.Vuelva a girar las células, decante el sobrenadante y almacene el gránulo celular en un tubo de 50 mililitros a menos 20 u 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Antes de evaluar la emisión de fluorescencia, realice un SDS-PAGE para asegurarse de que la pureza de la muestra esté por encima del 95% Luego, ajuste las muestras de cada variante de proteína purificada a una concentración de 0.3 micromoles, tomando como referencia el valor de absorbancia calculado en la longitud de onda apropiada. Asegúrese de que el volumen aproximado de la muestra final sea de 200 microlitros.Deje que las muestras diluidas se equilibren a temperatura ambiente. Después de una hora, transfiera las muestras a una cubeta de cuarzo de un centímetro y mida el espectro de emisión de fluorescencia de las muestras utilizando un espectrómetro de fluorescencia. Para inducir la desnaturalización, diluya las muestras de cada variante de proteína veinte veces agregando los dos microlitros de muestras de 300 micromolares a 18 microlitros de tampón PBS 1.11X que contiene urea molar 8.89 y TDT milimolar 5.56.Incubar las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Luego, diluya las muestras 100 veces agregando 1, 980 microlitros de PBS que contienen TDT de cinco milimolares para inducir la renaturalización y transfiera inmediatamente 200 microlitros de las muestras a una cubeta de cuarzo de un centímetro. Inserte la cubeta de cuarzo en un espectrómetro de fluorescencia apropiado y monitoree el repliegue de proteínas adquiriendo un espectro de fluorescencia cada tres segundos durante 30 minutos.Transfiera las muestras de repliegue en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, luego cierre la tapa y almacene las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad para permitir el repliegue completo de las variantes de EGFP. Después de 24 horas, mida la emisión de fluorescencia de las muestras de proteínas replegadas utilizando la misma longitud de onda de excitación que antes para capturar el punto final temporal de la recuperación de fluorescencia. Los gránulos de células que expresan proteínas nativas y variantes que llevan S-fluoroprolina y dehidroprolina tenían un color brillante típico debido al cromóforo intacto.En contraste, las variantes que contenían R-fluoroprolina y difluoroprolina permanecieron incoloras, lo que indica un plegamiento incorrecto y la deposición de proteína desplegada en los cuerpos de inclusión. El análisis SDS-PAGE verificó la presencia de proteínas insolubles que contienen R-fluoroprolina. En contraste, se encontraron proteínas nativas y variantes portadoras de S-fluoroprolina y dehidroprolina en las fracciones solubles.En el análisis de cromatografía líquida/espectrometría de masas, cada reemplazo de prolina con S-fluoroprolina produjo un cambio positivo de 18 dalton por residuo de prolina, mientras que el reemplazo con dehidroprolina produjo un cambio negativo de dos daltons por residuo. En los espectros de absorción y emisión de luz, la absorbancia del cromóforo se encontró a 488 nanómetros para EGFP y 493 nanómetros para NowGFP. En KillerOrange, la región de absorbancia del cromóforo comprendía dos bandas correspondientes a dos posibles estados de configuración y carga del cromóforo complejo.Además, los espectros de fluorescencia registrados tras la excitación en las correspondientes longitudes de onda de absorbancia máxima implicaban que los análogos no alteraban el entorno químico de los cromóforos. En experimentos de repliegue, la fluorescencia crotófora EGFP nativa se recuperó parcialmente, aunque la fluorescencia específica de triptófano fue mayor después de la renaturalización. Se observó un comportamiento similar para la variante que contiene dehidroprolina.En la S-fluoroprolina que contiene EGFP, se observó un resultado similar con una excitación de 295 nanómetros, mientras que la fluorescencia se recuperó en una medida mucho mayor a 488 nanómetros. Solo las variantes de EGFP mostraron una cinética de repliegue rápido con una recuperación de emisiones de triptófano que fue dos veces más rápida en comparación con la emisión de cromóforos. Se deben utilizar cultivos bacterianos frescos con medios de crecimiento adecuados.Las técnicas estériles y el monitoreo regular del crecimiento del cultivo también son requisitos previos importantes para el éxito del experimento. Este método es aplicable a la ingeniería de proteínas, ya que permite estudiar el papel de otros aminoácidos canónicos. Para esto, se necesitan cepas adecuadas de E. coli auxotrófica y análogos de aminoácidos.Se requiere espectrometría de masas de proteínas enteras como evidencia analítica para confirmar la incorporación de análogos de aminoácidos no canónicos. El método SPI para la incorporación de análogos de prolina nos permite manipular la columna vertebral de la proteína directamente, y ofrece ventajas para el diseño racional y la producción facilitada de proteínas a través de la estabilización global y la mejora de la traslación o plegamiento ribosómico.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Termodinámica del plegado de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescencia

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Investigación

Bioingeniería

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Las nanopartículas fluorescentes para la Medición de la concentración de iones en sistemas biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualización de las proteínas y complejos macromoleculares de Negative EM Mancha: desde la preparación de la cuadrícula para adquisición de imágenes

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