Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) till T.F. och N.B. och av det federala ministeriet för utbildning och vetenskap (BMBF-programmet "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) till F.-J.S. och T.M.T.T.

1. Införande av uttrycksplasmider i kompetenta pro-auxotrofa E. coli-celler
<ol><li>Blanda 1 ng av varje provplasmid, pQE-80L H6-EGFP, pQE-80L H6-NowGFP och pQE-80L H6-KillerOrange, med 50 μL kemiskt kompetenta eller elektrokompetenta celler i den pro-auxotrofa E. coli K12-härledda stammen JM83 (Addgene #50348 eller ATCC #35607) för omvandling genom värmechockmetoden eller elektroporering enligt tillgängliga protokoll46, 47. UTTRYCKSvektorn pQE-80L EGFP-H6 kodar för ett C-terminalt 6xHis-taggat förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP), uttrycksvektorerna pQE-80L H 6-NowGFP och pQE-80L H6-KillerOrange kodar för en N-terminalt 6xHis-taggad NowGFP48 respektive en N-terminalt 6xHis-taggad KillerOrange49, var och en i en pQE-80L-plasmidryggrad. Alla målgener kontrolleras av en bakteriell T5-promotor som regleras av lac-operatören. Ampicillinresistens användes som en urvalsmarkör och kolE1 som replikationens ursprung. Se materialförteckningen för ytterligare information om pQE-80L-plasmiden. Alternativ Pro-auxotrofisk E. coli som härrör från stammarna K-12 och B kan också användas för uttryck och bör ge liknande resultat. Den beräknade molekylmassan förH6-märkta ensindigt protonerade ([M+H]+) vildtypsproteiner (efter kromoformognad) är 27 745,33 Da (EGFP-H6), 27 931,50 Da (H6-NowGFP) och 27 606,09 Da (H6-KillerOrange). Målproteinernas primära strukturer anges i tabell 1 (His-tag understruken). Glutamin (Q) inom His-tag-sekvensen av NowGFP identifierades genom DNA-sekvensering efter subkloning av NowGFP cDNA mottaget från Pletnev et al.51 i pQE-80L-plasmiden. Det hindrar inte proteinrening eller egenskaperna hos det fluorescerande proteinet.</li>
	<li>Återställ cellerna i 950 μL SOC-medium vid 37 ° C i 1 timme.</li>
	<li>Sprid 50 μL av de återvunna cellerna på Luria Agar (LA) mediumplattor (se Kompletterande material) innehållande glukos (10 g / L) och ampicillin (100 μg / ml).</li>
	<li>Inkubera LA-mediumplattorna vid 37 ° C över natten eller 30 ° C i 24 timmar.</li>
</ol>2. Framställning av rekombinanta fluorescerande proteiner av vild typ (med kanonisk prolin) och förfarande för selektiv tryckinkorporering (SPI) för att producera fluorescerande proteiner med prolinanaloger (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)
<ol><li>Över natten odling av Pro-auxotrofisk E. coli K12-härledd stam JM83 som hyser pQE-80L EGFP-H6, pQE-80L H 6-NowGFP och pQE-80L H 6-KillerOrange<ol>
<li>Använd en steril pipettspets eller ympningsslinga för att välja en enda koloni från en LA-medelplatta och resuspendera cellerna i 5 ml lysogeny Broth (LB) -medium (se Kompletterande material; innehållande 10 g / L glukos, 100 μg / ml ampicillin) i ett sterilt 14 ml polystyrenodlingsrör. OBS: Nytransformerade kolonier rekommenderas för ympning. Celler på LA-medelplattor (från steg 2.2) som förvaras vid 4 °C ska användas inom några dagar.</li>
		<li>Odla cellkulturen över natten vid 37 ° C i en orbital shaker vid 200-250 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Produktion av rekombinant EGFP- H6, H6-NowGFP och H6-KillerOrange med infödd prolin och motsvarande proteinvarianter med prolinanaloger<ol><li>Inokulera 200 ml färskt NMM-medium (7,5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 och 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glukos, 1 μg/ml FeCl2, 1 μg/ml CaCl2, 10 μg/ml tiamin, 10 μg/ml biotin, 0,01 μg/ml spårämnen (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~ 7,2) med alla kanoniska l-aminosyror (50 mg / L); se Kompletterande material) kompletterat med 100 μg/ml ampicillin med 2 ml övernattningskultur i en 2-L Erlenmeyerkolv. OBS: Beroende på typ av protein kan alternativa odlingsmedier som MOPS medium52, glukos-mineralsalter medium53, Davis minimal medium54, M9 minimal medium55 eller GMML56 testas för att optimera proteinutbytet.</li>
		<li>Inkubera cellerna vid 37 ° C i en orbital shaker vid 220 rpm i ~ 3 h 30 min.</li>
		<li>Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) i en spektrofotometer var 30: e minut tills ett OD600-värde på ~ 0,7 uppnås. OBS: För OD600-bestämning i en spektrofotometer bör kyvetten ha en banlängd på 1 cm. Motsvarande odlingsmedium används för referensmätningen ("noll"). Inkubationstiden tills ett OD600-värde på ~ 0,7 uppnås kan bero på odlingsvolymen. 3 h 30 min är ett ungefärligt värde. I en variant av protokollets delsteg 2.2.1-2.2.3., kulturen från delsteg 2.1.2. används för att inokulera färskt NMMΔPro-medium (se Kompletterande material) kompletterat med en begränsad koncentration av prolin (t.ex. 5 mg/l i stället för 50 mg/l), och cellerna odlas över natten vid 37 °C i en orbital shaker vid 220 rpm. Nästa dag utförs OD600-bestämningen var 30: e minut tills skillnaderna mellan mätningarna är mindre än 0,05. Det maximala OD600-värdet bör vara cirka 1 (± 0,3). Den initiala, begränsade prolinkoncentrationen kan justeras beroende på uttrycksstam och odlingsmedium (se Diskussion).</li>
		<li>Snurra ner cellsuspensionen i 10 min vid 3 000 x g och 4 °C.</li>
		<li>Dekantera försiktigt supernatanten i avfall.</li>
		<li>Tvättsteg: Återsuspendera cellerna i 50 ml iskallt NMMΔAA (utan aminosyra, se Kompletterande material) eller NMMΔPro (utan prolin, se Kompletterande material) medium genom noggrann pipettering. OBS: För detta tvättsteg kan någon av de två angivna buffertarna användas, eftersom det bara är viktigt att bli av med kvarvarande prolin i inkubationsmediet.</li>
		<li>Separera cellerna från mediet genom sedimentering vid 4 °C i en centrifug vid 3 000 x g i 10 min.</li>
		<li>Dekantera försiktigt supernatanten i avfall.</li>
		<li>Pipett försiktigt upp och ner för att återsuspendera cellpelleten i 200 ml NMMΔPro-medium kompletterat med 100 μg/ml ampicillin till en 2-L Erlenmeyerkolv. OBS: Den resulterande cellsuspensionen kan separeras i flera prover med samma volym för att erhålla identiska startkulturer för att jämföra proteinuttryck i närvaro av Pro- eller prolinanaloger (t.ex. separation i 4 x 50 ml i 100 ml Erlenmeyer-kolvar).</li>
		<li>Inkubera i 30 min vid 37 °C i en orbital shaker vid 220 rpm för fullständig utarmning av Pro. OBS: Detta steg är avgörande för att helt tömma Pro från celler.</li>
		<li>Tillsätt en lämplig volym av antingen L-prolin eller R-Flp, S-Flp, Dfp och Dhp från 50 mM stamlösning för att justera 1 mM slutlig koncentration i cellsuspensionen. OBS: Som en allmän regel bör färska 50 mM lagerlösningar av Pro- eller prolinderivat alltid beredas före användning. Endast om hydrolys av den särskilda kanoniska eller icke-kanoniska aminosyran i en vattenlösning inte är ett problem, får frysta bestånd också användas.</li>
		<li>Tillsätt 0,5 mM IPTG från en 1 M stamlösning för att inducera målproteinuttryck.</li>
		<li>Uttryck målproteinet över natten (12 timmar) vid 37 °C i en orbital shaker vid 220 rpm.</li>
		<li>Mät OD600 nästa dag. OBS: OD600-bestämning görs för att kvantifiera mängden celler efter proteinuttryck. Ett lägre OD600-värde jämfört med det värde som uppmättes före tvättsteg 2.2.3 indikerar cytotoxiciteten hos den tillförda aminosyran. I detta fall bör proceduren upprepas med koncentrationen av den tillförda aminosyran minimerad (ner till 0,1 mM).</li>
		<li>Centrifugera och samla bakteriecellerna vid 5 000 x g och 4 °C i 10 minuter och dekantera supernatanten till avfall.</li>
		<li>Tvättsteg: Resuspendera cellerna genom noggrann pipettering i 50 ml bindningsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) innehållande 10% glycerol och överför cellsuspensionen till ett 50 ml koniskt polystyrenrör.</li>
		<li>Centrifugera och samla bakteriecellerna vid 5 000 x g och 4 °C i 10 minuter och dekantera supernatanten till avfall.</li>
		<li>Förvara cellpelleten i ett 50 ml koniskt polystyrenrör vid -20 °C eller -80 °C tills vidare användning (proteinrening, se nedan).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Reningsförfarande för proteinprover genom immobiliserad metalljonaffinitetskromatografi (IMAC)
<ol><li>Bakteriell celllys OBS: Utför alla steg av celllys på is eller vid 4 ° C för att förhindra nedbrytning av målproteinet.<ol>
<li>Tina bakteriecellpelleten på is eller vid 4 °C i ett 50 ml koniskt polystyrenrör i 10-20 min.</li>
		<li>Tillsätt 10 ml iskall bindningsbuffert (se Kompletterande material) och pipettera försiktigt upp och ner för att återanvända cellpelleten.</li>
		<li>Tillsätt 100 μL 50 mg/ml lysozym, 100 μL 1 mg/ml DNas I, 100 μL 1 mg/ml RNas A, 30 μL 1 MMgCl2. Invertera försiktigt cellsuspensionen fem gånger och håll det slutna röret på is eller vid 4 ° C i 60 minuter. OBS: Lysozym inducerar kemisk celllys genom att störa bakteriecellväggen.</li>
		<li>Sonicate provet för cellstörning med hjälp av en ultraljud homogenisator (t.ex. 3 gånger i 3 min i ett 50 ml polystyrenrör på en is-vattenblandning, puls 2 s / paus 4 s, 45% amplitud). OBS: Alternativt kan andra cellstörningsmetoder användas, t.ex. högtryckshomogenisering i 20 cykler vid 14 000 psi. Späd vid behov med en bindande buffert (se Kompletterande material) för att nå den minsta instrumentvolymen. Dessutom kan proteinextraktionsreagens användas för cellstörningar. Se Materialförteckningen för exempel.</li>
		<li>Centrifug i 60 min vid 18 000 x g, 4 °C.</li>
		<li>Anteckna vätskevolymen för delsteg 3.1.9. och häll supernatanten i ett nytt 50 ml polystyrenrör.</li>
		<li>Rensa supernatanten med ett membranfilter med 0,45 μm pordiameter.</li>
		<li>Ta ett prov av "lysat" för SDS-PAGE (se avsnitt 4. nedan); detta motsvarar "löslig proteinfraktion", supernatanten från delsteg 3.1.6.</li>
		<li>Lägg till en lika stor volymddH2Oenligt understeg 3.1.6. att återsuspendera cellskräpet för att bibehålla samma utspädning av proverna för efterföljande SDS-PAGE-analys.</li>
		<li>Ta ett prov av "pellets" för SDS-PAGE (se avsnitt 4. nedan); detta motsvarar "olöslig proteinfraktion", cellskräpetsuspensionen från delsteg 3.1.9.</li>
	</ol></li>
	<li>Immobiliserad metallaffinitetskromatografi (IMAC) rening OBS: Rening av målfluorescerande protein kan utföras vid 4 °C eller vid rumstemperatur (RT). För det senare alternativet, vänta tills lysatet, kolonnen och alla buffertar balanserar vid RT för att förhindra luftbubbelbildning på grund av förångning av luft som fångas i kall lösning vid placering i en varm kolonn.<ol>
<li>Rena provet med en 1 ml färdigförpackad eller självförpackad IMAC FPLC-kolonn (snabb protein [eller prestanda] vätskekromatografi) enligt tillverkarens instruktioner; ställ in maximalt kolonntryck till 0,3 MPa och flödeshastighet till 1 ml/min; Använda bindningsbuffert (se Kompletterande material) för kolonnjämning, tvättbuffert (se Kompletterande material) för tvättsteget och elueringsbuffert (se Kompletterande material) för målproteineluering. OBS: Alternativt kan ett automatiserat FPLC-system appliceras för att eluera målproteinet med elueringsbuffert som kör en linjär imidazolkoncentrationsgradient (20-200 mM).</li>
		<li>Samla och slå samman eluatfraktionerna med fluorescerande proteiner (välj efter synlig grön eller orange färg).</li>
		<li>Överför de sammanförda fraktionerna till ett dialysmembran (molekylviktsavgränsning (MWCO) på 5 000-10 000) enligt tillverkarens instruktioner och dialysera minst tre gånger mot dialysbuffert eller MS-buffert (se Kompletterande material). Utför till exempel dialys av ett 1 ml prov tre gånger mot 100 ml buffert i minst 2 timmar varje omgång. För ett detaljerat protokoll, se Budisa et al.34.</li>
		<li>Förbered en 1:100-faldig utspädning av den dialyserade elueringsfraktionen i PBS-bufferten (se Kompletterande material).</li>
		<li>Registrera absorbansspektrumet för de utspädda proverna i en UV-Vis-spektrofotometer.</li>
		<li>Beräkna proteinkoncentrationen baserat på Lambert-Beer-lagen enligt följande, med hjälp av litteraturvärden för de molära utrotningskoefficienterna ε vid specifik våglängd (för EGFP vid 488 nm ε488 = 55 000 cm-1 · M-1, NowGFP vid 493 nm ε493 = 53 600 cm-1· M-1, KillerOrange vid 514 nm ε514 = 22 600 cm-1· M-1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63320/63320eq01.jpg"> (Lambert-Beer lag) c-protein = proteinkoncentration [mg/ml] A = absorbans vid specifik våglängd ε = molär utrotningskoefficient vid specifik våglängd [M-1·cm-1] d = kyvettbanans längd, här 1 cm MW = molekylvikt för protein [g/mol] Använd dialysbuffert (se Kompletterande material) för referensmätningen ("noll").</li>
		<li>Ta ett prov av "eluat" för SDS-PAGE (se avsnitt 4 nedan), ladda 1-10 μg protein (beräknat enligt föregående steg) per provbrunn för Coomassie Brilliant Blue-färgade geler. OBS: Justera SDS-provmängderna beroende på den applicerade färgningsmetoden och färgämnets känslighet om föreningar som skiljer sig från Coomassie Brilliant Blue används för färgning av proteinband.</li>
		<li>Frys in och förvara proteinprovet i dialysbuffert (se Kompletterande material) vid -80 °C. OBS: Under detta lagringstillstånd bör proteinprover vara stabila i minst 6 månader. Alternativa laboratorie UV-Vis och fluorescensspektrofotometrar kan användas för registrering av absorptions- och fluorescensemissionsspektra av målproteiner. Följande excitationsvåglängder kan tillämpas för fluorescensemissionsmätningar: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) och 510 nm (KillerOrange).</li>
	</ol></li>
</ol>4. SDS-PAGE provberedning
<ol><li>Bestäm absorbans A vid 280 nm (A280nm) för prover "eluate", "lysate" och "pellet" från avsnitt 3. Justera sondvolymen för att uppnå A280nm = 2 genom att lägga till en lämplig mängd elueringsbuffert (den slutliga sondvolymen bör vara minst 80 μL).</li>
	<li>Blanda provet i förhållandet 4:1 (v/v) med 5x SDS-laddningsfärgbuffert (se Kompletterande material) genom pipettering, t.ex. 80 μL av provet med 20 μL 5x SDS-laddningsbuffert.</li>
	<li>Koka SDS-proverna vid 95 ° C i 5 minuter i ett vattenbad eller värmeblock för att denaturera proteinerna.</li>
	<li>Låt proverna svalna till RT och snurra ner sonderna vid 13 000 x g i 1 min i en mikrocentrifug innan de laddas på gelén.</li>
	<li>Använd 5-10 μL för Coomassie Brilliant Blue-stained SDS-PAGE. För närmare uppgifter om SDS-PAGE-förfarandet, se57. OBS: Justera SDS-provmängderna beroende på den applicerade färgningsmetoden och färgämnets känslighet. Resultatet av SDS-PAGE bör kontrolleras noggrant för att säkerställa att proverna innehåller mer än 95% av det totala proteinet i ett band som motsvarar den förväntade molekylvikten för det önskade proteinet. För detta, ta ett fotografi av den Coomassie-färgade gelén och jämför intensiteten hos proteinbandet med önskad molekylvikt med intensiteten hos alla andra band i körfältet (om någon) genom densitometri. För densitometrisk utvärdering av bandintensiteter kan programvaran ImageJ användas58. För att experimentellt bevisa införlivandet av de önskade ncAA i proteinet av intresse, bör intakt proteinmassanalys genom högpresterande vätskekromatografi (HPLC) kopplad till elektrosprayjoniseringstid för flygmasspektrometri (LC-ESI-TOF-MS) utföras enligt beskrivningen59 (se protokoll avsnitt 5 och materialtabell däri för exemplarisk utrustning).</li>
</ol>5. Fluorescensutsläpp av proteinvarianter
<ol><li>Kontrollera resultatet från SDS-PAGE-experimentet före proceduren för att se till att provets renhet är >95 % (se ANMÄRKNINGen efter steg 4.5.)</li>
	<li>Justera proverna för varje renad proteinvariant till en koncentration av 0,3 μM, med det beräknade absorbansvärdet vid lämplig våglängd som referens (delsteg 3.2.5). Se till att den ungefärliga slutliga provvolymen är 200 μL.</li>
	<li>Låt de utspädda proverna ekvillibrera i 1 timme vid RT.</li>
	<li>Överför proverna till en 1 cm kvartskyvett och mät ett fluorescensemissionsspektrum för proverna med hjälp av en fluorescensspektrometer (se materialtabell) med tillämpning av följande excitationsvåglängder: 488 nm (för EGFP), 493 nm (för NowGFP), 510 nm (för KillerOrange).</li>
</ol>6. Denaturering och omfällning av EGFP-varianter
<ol><li>Kontrollera resultatet från SDS-PAGE-experimentet före proceduren för att se till att provets renhet är >95 % (se ANMÄRKNINGen efter steg 4.5.)</li>
	<li>Förbered för varje renad proteinvariant två prover med 2 μL slutlig volym i en koncentration av 300 μM (se bestämning av proteinkoncentration i delsteg 3.2.4-3.2.6).</li>
	<li>Tillsätt 18 μL 1,11x PBS-buffert (se Kompletterande material) innehållande 8,89 M urea och 5,56 mM DTT till 2 μL av varje renad proteinvariant (för att erhålla 1x PBS innehållande 8 M urea och 5 mM DTT) för att inducera denaturering. OBS: För steg 6.4–6.6 ska du bearbeta varje prov separat.</li>
	<li>Inkubera proverna i 5 minuter vid 95 °C.</li>
	<li>Späd 20 μL-proverna 100-faldigt genom att tillsätta 1980 μL 1x PBS (se Kompletterande material) innehållande 5 mM DTT för att inducera renaturering, vilket ger 0,3 μM slutlig proteinkoncentration och omedelbart överföra 200 μL av proverna till en 1 cm kvartskyvett. OBS: Det är mycket viktigt att arbeta snabbt här eftersom renaturering börjar omedelbart.</li>
	<li>Sätt in kvartskyvetten i en lämplig fluorescensspektrometer (se Materialtabell) och övervaka proteinveckningen i proverna genom att förvärva ett fluorescensspektrum var 3: e sekund under 30 minuter. För varje proteinvariant, använd 295 nm fluorescensexcitation för det första provet och 488 nm fluorescensexcitation för den andra.</li>
	<li>Överför omfällningsproverna till 1,5 ml mikrocentrifugrör, stäng locket och förvara proverna vid RT i mörkret i 24 timmar för att möjliggöra fullständig omfällning av EGFP-varianter.</li>
	<li>Mäta fluorescensutsläpp av refoldade proteinprover enligt steg 6.6 med samma excitationsvåglängd som tidigare för att fånga det tidsmässiga effektmåttet för fluorescensåtervinning.</li>
</ol>

Författarna avslöjar alla intressekonflikter.

I naturen uppträder manipuleringar med proteinstrukturer och funktioner vanligtvis på grund av mutationer, fenomenet som leder till ett utbyte av en aminosyraidentitet vid vissa positioner i proteinsekvensen. Denna naturliga mekanism tillämpas allmänt som en bioteknisk metod för proteinteknik i form av mutagenes, och den bygger på repertoaren av de 20 kanoniska aminosyrorna som är involverade i processen. Utbytet av prolinrester är dock problematiskt. På grund av sin speciella ryggradsgruppsarkitektur är den knappast utbytbar med de återstående 19 resterna för ersättning72. Till exempel är prolin typiskt känd som en sekundär strukturbrytare i polypeptidsekvenser på grund av dess dåliga kompatibilitet med de vanligaste sekundära strukturerna, dvs α-helix och β-sträng. Denna prolinfunktion går lätt förlorad när återstoden muteras till en annan aminosyra från den gemensamma repertoaren. Ersättningen av prolin med dess kemiska analoger erbjuder ett alternativt tillvägagångssätt, vilket gör det möjligt att behålla de grundläggande ryggradsegenskaperna hos moderprolinresten samtidigt som man ålägger bias på dess specifika konformationsövergångar eller producerar moduleringar av molekylvolymen och polariteten. Det är till exempel möjligt att leverera bakteriekulturer med analoga strukturer såsom hydroxi-, fluor-, alkyl-, dehydroproliner, strukturer med varierande ringstorlekar och mer, vilket underlättar produktionen av ett protein som innehåller specifika prolinrestförändringar.
Den selektiva tryckinkorporeringsmetoden (SPI) som beskrivs i denna studie möjliggör en global, dvs. restspecifik ersättning av alla proliner i målproteinet med relaterade kemiska analoger. Metodens betydelse återspeglas av det faktum att SPI gör det möjligt att skapa sekvensförändringar som är otillgängliga för vanliga mutagenstekniker. Till exempel tillåter det produktion av ett målprotein som innehåller ganska små strukturella förändringar som vanligtvis inte får överstiga en eller två atomersättningar / deletioner / tillägg, vilket demonstreras i denna studie. Sådana proteinmodifieringar kallas "atommutationer"73,74. I ett fluorescerande protein såsom GFP kan resultatet av detta molekylära intrång ses i vikningshastigheten, lokala polariteter, proteinförpackning, stabilitet hos de involverade strukturella egenskaperna. Förändringarna i absorbans- och fluorescensegenskaperna produceras indirekt på grund av påverkan på proteinveckning och restmikromiljöer. Precisionen hos de molekylära förändringar som utförs av SPI är vanligtvis mycket högre, jämfört med mutationer av proliner till andra kanoniska rester, den senare är typiskt skadlig för proteinveckningen, produktionen och isoleringen.
Som en produktionsmetod använder SPI-metoden substrattoleransen för aminoacyl-tRNA-syntetasfickan mot kemiska analoger av den inhemska aminosyran. Syntetasen är ansvarig för korrekt identifiering av aminosyrastrukturen, medan införlivandet i proteiner sker nedströms i översättningsprocessen. Instrumentellt utförs proteinproduktionen, isoleringen och reningen i SPI på ett sätt som är typiskt för alla andra rekombinanta proteinuttryckstekniker; emellertid med vissa tillägg till protokollet enligt följande: Proline, som är bunden för ersättning, tillhandahålls i början av jäsningsprocessen, så att cellerna kan växa och utveckla sitt intakta cellulära maskineri. Cellkulturen får emellertid inte nå den maximala optiska densiteten, för att hålla cellerna i den logaritmiska fasen optimal för proteinuttryck. Det finns två stora variationer av SPI-metoden vid denna tidpunkt. I den första justeras koncentrationen av prolin i det initiala tillväxtmediet (ett kemiskt definierat medium) så att utarmning av prolin sker utan något yttre intrång. Cellerna avgaser prolin i mediet innan de kan lämna den logaritmiska tillväxtfasen, och därefter tillsätts analogen och proteinet av intresseproduktion induceras. I den andra versionen av metoden odlas cellerna i mediet innehållande prolin fram till mitten av deras logaritmiska fas. Vid denna tidpunkt bör cellerna tas ut och fysiskt överföras till ett annat medium, som inte längre innehåller prolin, endast analogen, med efterföljande induktion av proteinet av intresse. I båda versionerna tillhandahålls analogen och proteininduktionsreagenset till de förvuxna cellerna. Isoleringen och reningen av vildtypsproteinet utförs på samma sätt som för varianterna. I princip kan varje tillgänglig pro-auxotrofisk stam användas som uttrycksvärd. Ändå rekommenderas uttryckstester för att identifiera den lämpligaste värden. Tester av olika kemiskt definierade medier kan också användas för att optimera proteinutbytet.
Det finns vissa krav på kemiska analoger som måste beaktas för SPI, såsom löslighet och koncentration. Den metaboliska tillgängligheten och upptaget av aminosyror är beroende av antalet upplösta molekyler i mediet. För att öka lösligheten hos en viss förening kan svagt sura eller alkaliska förhållanden väljas. Eftersom de konstgjorda molekylerna kan orsaka tillväxthämmande effekter på grund av deras celltoxicitet, bör koncentrationen sänkas till ett minimum för att undvika cellstress75.
En mindre svaghet i SPI är minskningen av inkorporeringseffektiviteten med ett större antal positioner som behöver bytas ut. I princip kan en minskning av aminosyrafrekvensen inom målbiomolekylen genom platsriktad mutagenes lösa detta problem. De strukturella och funktionella egenskaperna hos ett önskat protein kan emellertid påverkas av att ändra den primära strukturen.
Som nämnts tidigare tillåter SPI restspecifik ersättning av den kanoniska aminosyran. Detta innebär att icke-kanoniska aminosyror sätts in i varje position av den kanoniska aminosyran i målproteinet, inklusive konserverade rester som är oumbärliga för proteinfunktion eller vikning. Alternativa metoder för platsspecifik inkorporering är den enda möjligheten att lösa detta problem3. Under de senaste decennierna har den ortogonala parmetoden utvecklats som kan producera proteiner som innehåller modifierade rester på fördefinierade platser. Den vanligaste modifieringen av denna metod är känd som stoppkodonundertryckning. Denna metod är baserad på ett konstruerat ortogonalt översättningssystem dedikerat för platsspecifik inkorporering av syntetiska aminosyror76. Mer än 200 aminosyror med olika sidokedjemodifieringar har hittills införlivats i proteiner med hjälp av detta tillvägagångssätt77. Dessa översättningssystem är emellertid fortfarande inte lämpliga för införande av prolinanaloger i målproteiner. Vidare anses metodens prestanda vara låg vid mindre aminosyramodifieringar eftersom viss bakgrundspromiskuitet hos aminoacyl-tRNA-syntetaset typiskt kvarstår i de konstruerade översättningssystemen.
Med hjälp av SPI producerade vi ett antal β-fat fluorescerande proteinvarianter och studerade resultaten av utbytet av prolin med dess onaturliga analoger. Vid prolinersättning med R-Flp och Dfp producerades ett dysfunktionellt protein av uttrycksvärden. Effekten produceras sannolikt av felveckning av protein. Den senare kan härröra från C4-exo-konformationen som främjas av R-Flp, som är ogynnsam av moderproteinstrukturerna27. Med Dfp kommer felveckningen sannolikt att produceras genom den minskade hastigheten hos trans-till-cis-peptidbindningsisomeriseringen vid prolinresten27. Det senare är känt för att vara bland de begränsande stegen i den kinetiska profilen för proteinveckningen som påverkar β-fatbildning och efterföljande kromoformognad. För både aminosyror, R-Flp och Dfp resulterade proteinproduktionen i ett aggregerat och olösligt protein. Följaktligen kunde kromoforbildning inte inträffa, och fluorescensen förlorades helt. Med S-Flp och Dhp observerades dock korrekt proteinmognad, vilket resulterade i fluorescerande proteinprover för varje analog / proteinkombination. Trots vissa moduleringar i proteinets absorbans- och fluorescensegenskaper förblev dessa i stor utsträckning liknande dem hos vildtypsproteinerna. Effekten av aminosyrasubstitutionen avslöjades i de refolding kinetikstudierna. Den senare visade en snabbare omfällning vid ersättning med S-Flp. Modellstudier har visat att denna rest kan generera en viss förbättring av trans-till-cis-amidrotationshastigheten och leda till bildandet av C 4-endo-konformationen. Båda dessa faktorer kommer sannolikt att bidra till de fördelaktiga kinetiska effekterna av denna rest i EGFP. Däremot producerade Dhp kinetiska vikningsprofiler som maximalt liknar moderproteinet. Mångfalden av de resultat som produceras av enbart atommutationer i de undersökta fluorescerande proteinerna illustrerar potentialen hos SPI-produktionsmetoden för att förändra målproteinegenskaperna. Proteinförändringarna inducerade av prolinersättning med analogerna har ytterligare konsekvenser vid konstruktion av enzymer 78,79,80 och jonkanaler 81,82, liksom i allmänhet konstruktion av proteinstabilitet.
Den grundläggande begränsningen av SPI-metoden är dess "allt-eller-ingen" -läge vid utbyte av prolin finns med relaterade analoger. Det skulle vara till stor fördel att kunna välja exakt, vilka prolinrester som ska ersättas med analogerna och vilka som ska förbli oförändrade. För närvarande finns det emellertid ingen teknik som kan utföra en så sofistikerad produktion med hjälp av en mikrobiell produktionsvärd. Kemisk syntes av proteiner 83,84, liksom cellfri produktion85,86, är de två alternativa metoderna som kan producera positionsspecifika prolinmodifieringar. Ändå gör deras operativa komplexitet och låga produktionsutbyten dem sämre jämfört med produktionen i levande celler. Från och med nu är SPI fortfarande det mest operativt enkla och robusta tillvägagångssättet för produktion av komplexa proteiner som bär atommutationer. Genom att införa onaturliga aminosyrasubstitut möjliggör metoden modifiering av proteinegenskaper på ett målinriktat sätt, vilket exemplifieras här av förändringar i vikning och ljusabsorption / utsläpp av fluorescerande proteiner som genereras av prolinersättningar.

Klassisk platsstyrd mutagenes möjliggör permutation av någon befintlig genkodad proteinsekvens genom kodonmanipulation på DNA-nivå. För att studera proteinveckning och stabilitet är det ofta önskvärt att ersätta liknande aminosyror med liknande motsvarigheter. Traditionell proteinmutagenes är dock definitivt begränsad till strukturellt liknande ersättningar bland kanoniska aminosyror som Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, som finns i standardgenetisk kodrepertoar. Å andra sidan finns det inga sådana möjligheter för andra kanoniska aminosyror som Trp, Met, His eller Pro, som ofta spelar väsentliga strukturella och funktionella roller i proteiner1. Ett idealiskt tillvägagångssätt för att studera dessa interaktioner i samband med den mycket specifika interna arkitekturen hos proteiner och deras vikningsprocess är att generera icke-störande isosteriska modifieringar. Faktum är att när isosteriska aminosyraanaloger av dessa kanoniska aminosyror, även kända som icke-kanoniska aminosyror (ncAA), sätts in i proteiner, möjliggör de subtila förändringar även vid nivån av enskilda atomer eller atomgrupper som H / F,CH2 / S / Se / Te känd som "atommutationer"2. Sådan "molekylär kirurgi" producerar förändrade proteiner vars egenskaper enbart härrör från utbytet av enskilda atomer eller grupper av atomer, vilka i gynnsamma fall kan analyseras och de detekterade förändringarna kan rationaliseras. På detta sätt utvidgas omfattningen av proteinsyntes för att studera proteinveckning och struktur långt bortom klassisk DNA-mutagenes. Observera att proteiner som genereras av platsriktad mutagenes vanligtvis kallas "mutanter", medan proteiner med substituerade kanoniska aminosyror kallas "varianter" 3, "alloproteiner"4 eller "proteinkongener"5.
Det gröna fluorescerande proteinet (GFP), som först identifierades i den marina organismen Aequorea victoria, uppvisar ljusgrön fluorescens när den utsätts för ultraviolett till blått ljus 6,7. Idag används GFP ofta som ett mycket känsligt märkningsverktyg för rutinmässig visualisering av genuttryck och proteinlokalisering i celler via fluorescerande mikroskopi. GFP har också visat sig vara användbart i olika biofysiska 8,9,10 och biomedicinska 11,12 studier, samt i proteinteknik 13,14,15. Noggrann analys av GFP-strukturen möjliggjorde skapandet av många varianter som kännetecknas av varierad stabilitet och fluorescensmaxima 16,17. De flesta GFP-varianter som används i cell- och molekylärbiologi är monomera proteiner både i lösning och ikristallen 18. Deras huvudsakliga strukturella organisation är typisk för alla medlemmar i GFP-familjen, oberoende av deras fylogenetiska ursprung, och består av 11 β-strängar som bildar en så kallad β-fat, medan en knäckt α-helix löper genom mitten av tunnan och bär kromoforen (figur 1A). Den autokatalytiska mognaden av kromoforen (figur 1B) kräver exakt positionering av sidokedjorna som omger den på proteinets centrala plats; många av dessa sidokedjor är mycket bevarade i andra GFP-varianter19. I de flesta fluorescerande proteiner från maneter som Aequorea victoria består den grönemitterande kromoforen av två aromatiska ringar, inklusive en fenolring av Tyr66 och den femledade heterocykliska strukturen av imidazolinon (figur 1B). Kromoforen, när den är korrekt inbäddad i proteinmatrisen, är ansvarig för den karakteristiska fluorescensen hos hela proteinet. Den är belägen i mitten av strukturen, medan fatstrukturen isolerar den från det vattenhaltiga mediet20. Exponering av kromoforen för bulkvattnet skulle resultera i fluorescenssläckning, dvs förlust av fluorescens21.
Korrekt vikning av den fatliknande strukturen är avgörande för att skydda kromoforen mot fluorescenssläckning22. Proline (Pro) rester spelar en särskild roll i den strukturella organisationen av GFP23. Eftersom de inte kan stödja en β utgör de anslutningsslingor som är ansvariga för att upprätthålla proteinstrukturen som helhet. Inte överraskande finns 10-15 prolinrester i både Aequorea- och Anthoathecata-härledda GFP: er; några av dem är mycket bevarade i andra typer av fluorescerande β-fatproteiner. Proliner förväntas kritiskt påverka vikningsegenskaperna på grund av deras speciella geometriska egenskaper. Till exempel, i Aequorea-härledda GFP, av de tio prolinresterna (figur 2A), bildar nio trans- och endast en bildar en cis-peptidbindning (Pro89). Pro58 är väsentlig, dvs inte utbytbar med resten av de 19 kanoniska aminosyrorna. Denna rest kan vara ansvarig för korrekt positionering av Trp57-återstoden, som har rapporterats vara avgörande för kromoformognad och den totala GFP-vikningen24. Fragmentet PVPWP med tre prolinrester (Pro54, Pro56, Pro58) och Trp57 är den väsentliga delen av det "nedre locket" i GFP-strukturen från figur 1A. PVPWP-strukturmotivet finns i flera proteiner såsom cytokromer och eukaryota spänningsaktiverade kaliumkanaler25. Prolin-till-alanin substitutioner vid positionerna 75 och 89 är också skadliga för proteinuttryck och vikning och avskaffar kromoformognad. Pro75 och Pro89 är en del av det "övre locket" som begraver kromoforen (figur 1A) och bevaras över 11-strängade β-fat fluorescerande proteiner23. Dessa två "lock" håller kromoforen utesluten från det vattenhaltiga lösningsmedlet, även när den stabila tertiära strukturen delvis har brutits26. En sådan specifik molekylär arkitektur skyddar fluoroforen från kollisionssläckning (dynamisk) fluorescenssläckning, t.ex. av vatten, syre eller andra diffusibla ligander.
För att utföra molekylär konstruktion av GFP-strukturen bör man införa aminosyrasubstitutioner i proteinets primära struktur. Många mutationer har utförts på GFP, vilket ger varianter med förhöjd stabilitet, snabb och pålitlig vikning och variabla fluorescensegenskaper17. I de flesta fall anses emellertid mutation av prolinrester vara ett riskabelt tillvägagångssätt på grund av det faktum att ingen av de återstående 19 kanoniska aminosyrorna korrekt kan återställa prolinrestens konformationsprofil27. Således har ett alternativt tillvägagångssätt utvecklats, där prolinrester ersätts med andra prolinbaserade strukturer, kallade prolinanaloger28. På grund av sin unika cykliska kemiska struktur uppvisar prolin två karakteristiska konformationsövergångar (figur 1C): 1) prolinringen puckering, en snabb process som medför organisering av ryggraden, som främst påverkar φ torsionsvinkel, och 2) peptidbindningen cis / transisomerisering, en långsam process som påverkar ryggradsvikningen via ω-torsionsvinklarna. På grund av sin långsamma natur är den senare övergången vanligtvis ansvarig för de hastighetsbegränsande stegen i vikningsprocessen för hela proteinet. Det har tidigare visats att peptidbindning cis / transisomerisering runt vissa prolinrester har långsamma steg i vikningen av GFP-varianter. Till exempel har bildandet av cis-peptidbindningen vid Pro89 det långsamma steget i vikningsprocessen eftersom det är beroende av bindningsövergången från trans till cis29. En snabbare omfällning kan uppnås efter att Pro89 har ersatts med en all-trans-peptidslinga, dvs genom att avskaffa en cis-till-trans-isomeriseringshändelse30. Förutom cis/trans-isomeriseringen kan puckerövergångarna också generera djupgående förändringar i proteinveckning på grund av ryggradsorganisationen och förpackningen inom proteininteriören27,31.
Kemiska modifieringar resulterar i förändring av de inneboende konformationsövergångarna hos prolinresterna, vilket påverkar proteinets förmåga att vikas. Vissa prolinanaloger är särskilt attraktiva kandidater för prolinsubstitution i proteiner eftersom de möjliggör manipulation och studier av vikningsegenskaperna. Till exempel är (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluorprolin (Dfp) och 3,4-dehydroprolin (Dhp) fyra analoger (figur 1D) som skiljer sig minimalt från prolin när det gäller både molekylvolym och polaritet32. Samtidigt uppvisar varje analog en distinkt ringpubbning: S-Flp stabiliserar C 4-endo pucker, R-Flp stabiliserar C4-exo pucker, Dfp uppvisar ingen uppenbar puckerpreferens, medan Dhp avskaffar puckering (figur 1D)33. Genom att använda dessa analoger i proteinstrukturen kan man manipulera med den konformationella övergången av prolinresterna och därigenom påverka egenskaperna hos de resulterande GFP-varianterna.
I detta arbete bestämde vi oss för att införliva den angivna uppsättningen prolinanaloger (figur 1D) i strukturen hos GFP-varianter med hjälp av den selektiva tryckinkorporeringsmetoden (SPI, figur 3) 34. Ersättning av aminosyrarester med deras närmaste isostrukturella analoger är ett tillämpat biotekniskt koncept i proteindesign35,36. Således illustrerar effekterna av prolinanaloger i ett modellprotein deras potential att fungera som verktyg inom proteinteknik37. Produktionen av proteiner innehållande önskade analoger utfördes i modifierade E. coli-stammar som inte kan producera prolin (prolin-auxotrofi). Således kan de tvingas acceptera ersättning av substrat i processen med proteinbiosyntes38. Denna globala substitution av prolin möjliggörs av den naturliga substratflexibiliteten hos endogena aminoacyl-tRNA-syntetaser39, de viktigaste enzymerna som katalyserar förestringen av tRNA med lämpliga aminosyror40. I allmänhet, som beskrivs i figur 3, utförs cellulär tillväxt i ett definierat medium tills den mellersta logaritmiska tillväxtfasen uppnås. I nästa steg utarmas aminosyran som ska ersättas intracellulärt från uttryckssystemet under jäsning och utbyts därefter av den önskade analogen eller ncAA. Målproteinuttryck induceras sedan för restspecifik icke-kanonisk aminosyrainkorporering. Substitutionen av den besläktade aminosyran med dess analog sker på ett proteombrett sätt. Även om denna biverkning kan ha en negativ inverkan på tillväxten av värdstammen, påverkas kvaliteten på målproteinproduktionen för det mesta inte, eftersom de cellulära resurserna i rekombinant uttryck huvudsakligen riktas mot produktionen av målproteinet41,42. Därför är ett hårt reglerat, inducerbart uttryckssystem och starka promotorer avgörande för hög inkorporeringseffektivitet43. Vårt tillvägagångssätt är baserat på multipel restspecifik inkorporering av ncAA som svar på sinneskodoner (sinneskodonreasplacering), varigenom antalet positioner för Pro-analog insättning inom målgenen kan manipuleras via platsriktad mutagenes44. Ett liknande tillvägagångssätt tillämpades i vår tidigare rapport om framställning av rekombinanta peptider med antimikrobiella egenskaper45. I detta arbete har vi tillämpat SPI-metoden, som gör att alla prolinrester kan ersättas med relaterade analoger, för att generera proteiner som förväntas ha distinkta fysikalisk-kemiska egenskaper som inte finns i proteiner syntetiserade med den kanoniska aminosyrarepertoaren. Genom att karakterisera viknings- och fluorescensprofilen för resulterande varianter strävar vi efter att visa upp effekterna av atomsubstitutioner i varianter av GFP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

Ersättning av prolin (Pro) rester i proteiner med den traditionella platsstyrda mutagenesen med någon av de återstående 19 kanoniska aminosyrorna är ofta skadlig för proteinveckning och i synnerhet kromoformognad i gröna fluorescerande proteiner och besläktade varianter. Ett rimligt alternativ är att manipulera översättningen av proteinet så att alla Pro-rester ersätts restsubstans specifikt med analoger, en metod som kallas selektiv tryckinkorporering (SPI). De inbyggda kemiska modifieringarna kan användas som en slags "molekylär kirurgi" för att fint dissekera mätbara förändringar eller till och med rationellt manipulera olika proteinegenskaper. Här visar studien nyttan av SPI-metoden för att studera prolinernas roll i organisationen av den typiska β-fatstrukturen av spektrala varianter av det gröna fluorescerande proteinet (GFP) med 10-15 proliner i sin sekvens: förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP), NowGFP och KillerOrange. Pro-rester finns i anslutande sektioner mellan enskilda β-strängar och utgör de stängande locken på fatställningen, vilket är ansvarigt för isolering av kromoforen från vatten, dvs fluorescensegenskaper. Selektiva tryckinkorporeringsexperiment med (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluorprolin (Dfp) och 3,4-dehydroprolin (Dhp) utfördes med användning av en prolin-auxotrofisk E. coli-stam som uttrycksvärd. Vi fann att fluorescerande proteiner med S-Flp och Dhp är aktiva (dvs fluorescerande), medan de andra två analogerna (Dfp och R-Flp) producerade dysfunktionella, felveckade proteiner. Inspektion av UV-Vis-absorptions- och fluorescensemissionsprofiler visade få karakteristiska förändringar i proteinerna som innehåller Pro-analoger. Undersökning av de vikande kinetiska profilerna i EGFP-varianter visade en accelererad omfällningsprocess i närvaro av S-Flp, medan processen liknade vildtyp i proteinet innehållande Dhp. Denna studie visar SPI-metodens förmåga att producera subtila modifieringar av proteinrester på atomnivå ("molekylär kirurgi"), som kan antas för studier av andra proteiner av intresse. Det illustrerar resultaten av prolinersättningar med nära kemiska analoger på viknings- och spektroskopiska egenskaper i klassen β fluorescerande proteiner.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

För att övervinna begränsningarna av klassisk platsriktad mutagenes införlivades prolinanaloger med specifika modifieringar i flera fluorescerande proteiner. Vi visar hur ersättningen av väte med fluor eller singeln med dubbelbindningar i prolinrester ("molekylär kirurgi") påverkar grundläggande proteinegenskaper, inklusive deras vikning och interaktion med ljus.

Restspecifikt utbyte av prolin med prolinanaloger i fluorescerande proteiner: Hur "molekylär kirurgi" i ryggraden påverkar vikning och stabilitet

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

I de flesta fall är konventionell platsriktad mutagenes inte lämplig för att studera prolinernas funktionella roll i proteiner. Här presenterar vi en metod för att införliva prolinanaloger som icke-kanoniska aminosyror i ribosomiskt syntetiserade proteiner för att undersöka prolinresternas roll på proteinveckning och funktion. Substitutionen av proliner med vanliga aminosyror är ett riskabelt tillvägagångssätt.Inkorporering av prolinanaloger möjliggör en slags molekylär kirurgi. Med andra ord introducerar den subtila molekylära förändringar för att rationellt påverka och manipulera proteinegenskaper. Eftersom prolinrester spelar en viktig roll i stabiliteten hos proteinställningar, kan vår teknik vara till hjälp för att förstå orsakerna bakom proteinveckningsunderskott, som ligger till grund för vissa patologiska tillstånd hos människor.De proteinförändringar som induceras av prolinersättningar har konsekvenser för den biotekniska konstruktionen av enzymer och ger möjligheter till förbättring av ribosomal proteinöversättning eller vikning. Denna metod kräver ingen specialutrustning och dyr instrumentering. Särskild försiktighet bör iakttas med protokollsteg, där infödd prolin är utarmad från E.coli-kulturer före tillsats av prolinanaloger.För att påbörja produktionen av fluorescerande proteiner med infödd prolin, inokulera 200 ml färskt NMM-medium i en två-liters Erlenmeyer-kolv med två milliliter av nattkulturen. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i en orbital shaker vid 220 RPM i cirka 3,5 timmar. Under inkubationen mäter du den optiska densiteten vid 600 nanometer i en spektrofotometer var 30: e minut.När den optiska densiteten når 0,7, snurra ner cellsuspensionen och dekantera försiktigt supernatanten till avfall. Tvätta sedan cellerna genom att återanvända i 50 ml iskall NMM utan aminosyror eller NMM utan prolin. Snurra cellerna igen och dekantera supernatanten till avfall.Därefter resuspendera cellpelleten genom mild pipettering i 200 ml NMM utan prolin och kompletterad med ampicillin i en två-liters Erlenmeyer-kolv och inkubera cellerna i en orbital shaker i 30 minuter för att möjliggöra fullständig utarmning av prolin. Efter inkubation tillsätt en lämplig volym av antingen L-prolin eller prolinanalogerna från 50-millimolära stamlösningar för att erhålla en millimolär slutlig koncentration i cellsuspensionen. Därefter inducera målproteinuttryck genom att tillsätta 500 mikromolär IPTG från en en-molär stamlösning.Uttryck målproteinet över natten vid 37 grader Celsius i en orbital shaker och mät den optiska densiteten nästa dag. Samla bakteriecellerna genom centrifugering och dekantera supernatanten i avfall. Tvätta sedan cellerna genom noggrann pipettering i 50 ml bindningsbuffert innehållande 10% glycerol.Snurra cellerna igen, dekantera supernatanten och förvara cellpelleten i ett 50-milliliter rör vid minus 20 eller 80 grader Celsius tills vidare användning. Innan du utvärderar fluorescensutsläpp, utför en SDS-PAGE för att säkerställa att provets renhet är över 95%Justera sedan proverna för varje renad proteinvariant till en koncentration av 0,3 mikromol, med det beräknade absorbansvärdet vid lämplig våglängd som referens. Se till att den ungefärliga slutliga provvolymen är 200 mikroliter.Låt de utspädda proverna balansera vid rumstemperatur. Efter en timme, överför proverna till en kvartskyvett på en centimeter och mät fluorescensemissionsspektrumet för proverna med hjälp av en fluorescensspektrometer. För att inducera denaturering, späd proverna av varje proteinvariant tjugo gånger genom att tillsätta de två mikroliter 300 mikromolära proverna till 18 mikroliter av 1,11X PBS-buffert innehållande 8,89-molär urea och 5,56-millimolär DTT.Inkubera proverna vid 95 grader Celsius i fem minuter. Späd sedan proverna 100 gånger genom att tillsätta 1 980 mikroliter PBS innehållande fem millimolär DTT för att inducera renaturering och överför omedelbart 200 mikroliter av proverna till en kvartskyvett på en centimeter. Sätt in kvartskyvetten i en lämplig fluorescensspektrometer och övervaka proteinveckning genom att förvärva ett fluorescensspektrum var tredje sekund under 30 minuter.Överför omfällningsproverna till 1,5 ml mikrocentrifugrör, stäng sedan locket och förvara proverna vid rumstemperatur i mörkret för att möjliggöra fullständig omfällning av EGFP-varianter. Efter 24 timmar, mäta fluorescensutsläpp av de refoldade proteinproverna med samma excitationsvåglängd som tidigare för att fånga det tidsmässiga slutpunkten för fluorescensåtervinning. Pellets från celler som uttrycker inhemskt protein och varianter som bär S-fluoroprolin och dehydroprolin hade en typisk ljus färg på grund av den intakta kromoforen.Däremot förblev varianter innehållande R-fluoroprolin och difluorprolin färglösa, vilket indikerar felveckning och avsättning av utfällt protein i inklusionskroppar. SDS-PAGE-analys verifierade närvaron av olösliga R-fluoroprolininnehållande proteiner. Däremot hittades inhemska proteiner och S-fluoroprolin och dehydroprolinbärande varianter i de lösliga fraktionerna.I vätskekromatografi / masspektrometrianalys gav varje prolinersättning med S-fluoroprolin ett positivt 18-dalton skift per prolinrest, medan ersättning med dehydroprolin gav en negativ förskjutning av två dalton per rest. I ljusabsorptions- och emissionsspektra hittades kromoforabsorbering vid 488 nanometer för EGFP och 493 nanometer för NowGFP. I KillerOrange bestod kromoforabsorabsansregionen av två band som motsvarade två möjliga konfigurations- och laddningstillstånd för den komplexa kromoforen.Vidare innebar fluorescensspektra registrerade vid excitation vid motsvarande maximala absorbansvåglängder att analogerna inte förändrade kromoforernas kemiska miljö. I omfällningsexperiment återhämtade sig den ursprungliga EGFP-kromoforfluorescensen delvis, även om den tryptofanspecifika fluorescensen var större efter renaturering. Liknande beteende observerades för varianten innehållande dehydroprolin.I EGFP-innehållande S-fluoroprolin observerades ett liknande resultat med en excitation på 295 nanometer, medan fluorescens återhämtade sig i mycket högre utsträckning vid 488 nanometer. Endast EGFP-varianterna visade snabb omfällningskinetik med tryptofanutsläppsåtervinning som var dubbelt så snabb jämfört med kromoforutsläppet. Färska bakteriekulturer med lämpliga tillväxtmedier måste användas.Sterila tekniker och regelbunden övervakning av odlingstillväxten är också viktiga förutsättningar för att experimentet ska lyckas. Denna metod är tillämplig på proteinteknik, eftersom den tillåter att studera rollen hos andra kanoniska aminosyror. För detta behövs lämpliga auxotrofa E.coli-stammar och aminosyraanaloger.Masspektrometri av hela proteiner krävs som analytiska bevis för att bekräfta införlivandet av icke-kanoniska aminosyraanaloger. SPI-metoden för att införliva prolinanaloger gör det möjligt för oss att manipulera proteinets ryggrad direkt och erbjuder fördelar för rationell design och underlättad produktion av proteiner genom global stabilisering och förbättring av ribosomal översättning eller vikning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Termodynamik för membranprotein Folding Mätt fluorescensspektroskopi

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Lysrör Nanopartiklar för mätning av jonkoncentration i biologiska system

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Tillverkning av elektrokemiska-DNA biosensorer för att Reagentless Upptäckt av nukleinsyror, proteiner och små molekyler

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisera proteiner och Makromolekylär av negativa Stain EM: från Grid förberedelse till Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Mikroflödessystem Blandare för att studera protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifiering av Global diastoliska funktionen av kinematisk modellering baserad Analys av Transmitral Flow via Parametrized diastoliska Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Leverans av proteiner, peptider eller cellimpermeabel Små molekyler i levande celler genom inkubation med Endosomolytic Reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

Sammanslagning jonkoncentration Polarisering mellan intill varandra placerade jonbytesmembran för att blockera utbredningen av Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...