Name: residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis") tarafından T.F. ve N.B.'ye ve Federal Eğitim ve Bilim Bakanlığı (BMBF Programı "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) tarafından F.-J.S.'ye desteklenmiştir. ve T.M.T.T.

Yazarlar her türlü çıkar çatışmasını açıklar.

Doğada, protein yapıları ve fonksiyonları ile manipülasyonlar tipik olarak, protein dizisindeki belirli pozisyonlarda bir amino asit kimliğinin değişimine yol açan fenomen olan mutasyonlar nedeniyle meydana gelir. Bu doğal mekanizma, mutagenez şeklinde protein mühendisliği için biyoteknolojik bir yöntem olarak yaygın olarak uygulanmaktadır ve sürece dahil olan 20 kanonik amino asidin repertuarına dayanmaktadır. Bununla birlikte, prolin kalıntılarının değişimi sorunludur. Özel omurga grubu mimarisi nedeniyle,72'nin değiştirilmesi için kalan 19 kalıntı ile neredeyse hiç değiştirilemez. Örneğin, prolin, en yaygın ikincil yapılarla, yani α-sarmal ve β iplikçiklerle zayıf uyumluluğu nedeniyle polipeptit dizilerinde tipik olarak ikincil bir yapı kırıcı olarak bilinir. Bu prolin özelliği, kalıntı ortak repertuardan başka bir amino aside mutasyona uğradığında kolayca kaybolur. Prolinin kimyasal analogları ile değiştirilmesi, ana prolin kalıntısının temel omurga özelliklerini korurken, spesifik konformasyonel geçişlerine önyargı uygularken veya moleküler hacim ve polaritenin modülasyonlarını üretirken alternatif bir yaklaşım sunar. Örneğin, bakteri kültürlerine hidroksi-, floro-, alkil-, dehidroprolinler, değişken halka boyutlarına sahip yapılar ve daha fazlası gibi analog yapılar sağlamak mümkündür, böylece spesifik prolin kalıntı değişiklikleri içeren bir proteinin üretimini kolaylaştırır.
Bu çalışmada açıklanan seçici basınç birleştirme (SPI) yöntemi, hedef proteindeki tüm prolinlerin ilgili kimyasal analoglarla küresel, yani kalıntıya özgü bir şekilde değiştirilmesine izin verir. Yöntemin önemi, SPI'nın yaygın mutagenez tekniklerine erişilemeyen dizi değişiklikleri oluşturmaya izin vermesi gerçeğiyle yansıtılmaktadır. Örneğin, bu çalışmada gösterildiği gibi, tipik olarak bir veya iki atom değiştirmesini / silinmesini / eklenmesini geçemeyen oldukça küçük yapısal değişiklikler içeren bir hedef proteinin üretilmesine izin verir. Bu tür protein modifikasyonları "atomik mutasyonlar" olarak adlandırılır73,74. GFP gibi bir floresan proteininde, bu moleküler müdahalenin sonucu, katlanma hızı, lokal polariteler, protein paketleme, ilgili yapısal özelliklerin stabilitesinde görülebilir. Absorbans ve floresan özelliklerindeki değişiklikler, protein katlanması ve kalıntı mikro ortamları üzerindeki etkisinden dolayı dolaylı olarak üretilir. SPI tarafından gerçekleştirilen moleküler değişikliklerin hassasiyeti, prolinlerin diğer kanonik kalıntılara mutasyonlarına kıyasla tipik olarak çok daha yüksektir, ikincisi tipik olarak protein katlanması, üretimi ve izolasyonu için zararlıdır.
Bir üretim yöntemi olarak, SPI yaklaşımı, aminoasil-tRNA sentetaz cebinin substrat toleransını, doğal amino asidin kimyasal analoglarına doğru kullanır. Sentetaz, amino asit yapısının doğru tanımlanmasından sorumludur, proteinlere dahil edilme ise çeviri sürecinde aşağı yönde gerçekleşir. Enstrümantal olarak, SPI'daki protein üretimi, izolasyonu ve saflaştırılması, diğer rekombinant protein ekspresyon teknikleri için tipik bir şekilde gerçekleştirilir; Bununla birlikte, protokole aşağıdaki gibi bazı eklemeler ile: Değiştirilmek üzere bağlanan Prolin, fermantasyon işleminin başlangıcında sağlanır, böylece hücreler bozulmamış hücresel makinelerini büyütebilir ve geliştirebilir. Bununla birlikte, hücreleri protein ekspresyonu için en uygun logaritmik fazda tutmak için hücre kültürünün maksimum optik yoğunluğa ulaşmasına izin verilmez. Bu noktada SPI yönteminin iki ana varyasyonu vardır. İlkinde, prolin konsantrasyonu ilk büyüme ortamında (kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam) ayarlanır, böylece prolinin tükenmesi herhangi bir dış müdahale olmadan gerçekleşir. Hücreler, logaritmik büyüme aşamasından çıkmadan önce ortamdaki prolinleri tüketir ve daha sonra analog eklenir ve ilgili protein üretimi indüklenir. Yöntemin ikinci versiyonunda, hücreler logaritmik fazlarının ortasına kadar prolin içeren ortamda yetiştirilir. Bu noktada, hücreler çıkarılmalı ve fiziksel olarak artık prolin içermeyen, sadece analogu içeren başka bir ortama aktarılmalı ve daha sonra ilgilenilen proteinin indüksiyonu yapılmalıdır. Her iki versiyonda da, önceden yetiştirilmiş hücrelere analog ve protein indüksiyon reaktifi sağlanır. Vahşi tip proteinin izolasyonu ve saflaştırılması, varyantlarla aynı şekilde gerçekleştirilir. Prensip olarak, mevcut her Pro-auxotrophic suşu bir ifade konağı olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, en uygun konağı tanımlamak için ifade testleri önerilir. Ayrıca, protein verimini optimize etmek için kimyasal olarak tanımlanmış farklı ortamların testleri kullanılabilir.
SPI için dikkate alınması gereken kimyasal analoglarla ilgili çözünürlük ve konsantrasyon gibi belirli gereksinimler vardır. Amino asitlerin metabolik mevcudiyeti ve alımı, ortamdaki çözünmüş moleküllerin sayısına bağlıdır. Belirli bir bileşiğin çözünürlüğünü arttırmak için, hafif asidik veya alkali koşullar seçilebilir. Yapay moleküller hücre toksisiteleri nedeniyle büyüme engelleyici etkilere neden olabileceğinden, hücre stresini önlemek için konsantrasyon minimuma indirilmelidir75.
SPI'nın küçük bir zayıflığı, değiştirilmesi gereken daha fazla sayıda pozisyonla birleşme verimliliğinin azalmasıdır. Prensip olarak, hedef biyomolekül içindeki amino asit frekansının bölgeye yönelik mutagenez ile azaltılması bu sorunu çözebilir. Bununla birlikte, istenen bir proteinin yapısal ve fonksiyonel özellikleri, birincil yapının değiştirilmesinden etkilenebilir.
Daha önce de belirtildiği gibi, SPI kanonik amino asidin kalıntıya özgü olarak değiştirilmesine izin verir. Bu, kanonik olmayan amino asitlerin, protein fonksiyonu veya katlanması için vazgeçilmez olan korunmuş kalıntılar da dahil olmak üzere, hedef protein içindeki kanonik amino asidin her konumuna yerleştirildiği anlamına gelir. Siteye özgü birleştirme için alternatif yöntemler, bu sorunun üstesinden gelmek için tek olasılıktır3. Son birkaç on yılda, önceden tanımlanmış bölgelerde modifiye kalıntılar içeren proteinler üretebilen ortogonal çift yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemin en yaygın modifikasyonu, stop kodon baskılaması olarak bilinir. Bu yöntem, sentetik amino asitlerin sahaya özgü olarak dahil edilmesine adanmış tasarlanmış bir ortogonal çeviri sistemine dayanmaktadır76. Farklı yan zincir modifikasyonlarına sahip 200'den fazla amino asit, bu yaklaşım kullanılarak bugüne kadar proteinlere dahil edilmiştir77. Bununla birlikte, bu çeviri sistemleri prolin analoglarının hedef proteinlere yerleştirilmesi için hala uygun değildir. Ayrıca, minör amino asit modifikasyonları durumunda yöntemin performansı düşük kabul edilir, çünkü aminoasil-tRNA sentetazın bazı arka plan karışıklıkları tipik olarak mühendislik çeviri sistemlerinde kalır.
SPI kullanarak, bir dizi β varil floresan protein varyantı ürettik ve prolinin doğal olmayan analoglarıyla değişiminin sonuçlarını inceledik. R-Flp ve Dfp ile prolin replasmanı durumunda, ekspresyon konakçısı tarafından işlevsiz bir protein üretildi. Etki muhtemelen proteinin yanlış katlanmasıyla üretilir. İkincisi, ana protein yapıları27 tarafından tercih edilmeyen R-Flp tarafından teşvik edilen C4-exo konformasyonundan kaynaklanabilir. Dfp ile, yanlış katlamanın, prolin kalıntısı27'deki trans-cis peptid bağ izomerizasyonunun azalan hızı ile üretilmesi muhtemeldir. İkincisinin, β varil oluşumunu ve ardından kromofor olgunlaşmasını etkileyen protein katlanmasının kinetik profilindeki sınırlayıcı adımlar arasında olduğu bilinmektedir. Gerçekten de, her iki amino asit, R-Flp ve Dfp için, protein üretimi toplanmış ve çözünmez bir protein ile sonuçlandı. Sonuç olarak, kromofor oluşumu gerçekleşemedi ve floresan tamamen kayboldu. Bununla birlikte, S-Flp ve Dhp ile, uygun protein olgunlaşması gözlendi ve her analog / protein kombinasyonu için floresan protein örnekleri elde edildi. Proteinin absorbans ve floresan özelliklerindeki bazı modülasyonlara rağmen, bunlar büyük ölçüde vahşi tip proteinlerinkine benzer kalmıştır. Amino asit ikamesinin etkisi, yeniden katlanan kinetik çalışmalarında ortaya çıkmıştır. Model çalışmaları, bu kalıntının trans-cis amid dönme hızında bir miktar iyileşme sağlayabileceğini ve C 4-endo konformasyonunun oluşumuna yol açabileceğini göstermiştir. Her iki faktörün de EGFP'deki bu kalıntının yararlı kinetik etkilerine katkıda bulunması muhtemeldir. Buna karşılık, Dhp, ana proteine maksimum derecede benzer kinetik katlama profilleri üretti. İncelenen floresan proteinlerinde sadece atomik mutasyonlar tarafından üretilen sonuçların çeşitliliği, SPI üretim yönteminin hedef protein özelliklerini değiştirmedeki potansiyelini göstermektedir. Prolinin analoglarla replasmanı ile indüklenen protein değişiklikleri,78,79,80 enzimlerinin ve 81,82 iyon kanallarının mühendisliğinde ve ayrıca protein stabilitesinin genel mühendisliğinde daha fazla etkiye sahiptir.
SPI yönteminin temel sınırlaması, prolinin ilgili analoglarla taşınmasında "ya hep ya hiç" modudur. Hangi prolin kalıntılarının analoglarla değiştirilmesi gerektiğini ve hangilerinin değiştirilmeden kalması gerektiğini kesin olarak seçebilmek büyük avantaj sağlayacaktır. Bununla birlikte, şu anda, mikrobiyal bir üretim konağı kullanarak böylesine sofistike bir üretim gerçekleştirebilecek bir teknik yoktur. 83,84 proteinlerinin kimyasal sentezi ve hücresiz üretim85,86, pozisyona özgü prolin modifikasyonları üretebilen iki alternatif yöntemdir. Bununla birlikte, operasyonel karmaşıklıkları ve düşük üretim verimleri, onları canlı hücrelerdeki üretime kıyasla daha düşük hale getirir. Şu an itibariyle, SPI, atomik mutasyonlar taşıyan karmaşık proteinlerin üretimi için operasyonel olarak en basit ve sağlam yaklaşım olmaya devam etmektedir. Doğal olmayan amino asit ikamelerini tanıtarak, yöntem, prolin replasmanları tarafından üretilen floresan proteinlerin katlanması ve ışık emilimi / emisyonundaki değişikliklerle örneklendiği gibi, protein özelliklerinin hedeflenen bir şekilde değiştirilmesine izin verir.

Klasik bölgeye yönelik mutagenez, DNA seviyesinde kodon manipülasyonu ile mevcut herhangi bir gen kodlanmış protein dizisinin permütasyonuna izin verir. Protein katlanmasını ve stabilitesini incelemek için, benzer amino asitlerin benzer muadilleriyle değiştirilmesi genellikle arzu edilir. Bununla birlikte, geleneksel protein mutagenezi, standart genetik kod repertuarında bulunan Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe gibi kanonik amino asitler arasında yapısal olarak benzer replasmanlarla sınırlıdır. Öte yandan, Trp, Met, His veya Pro gibi proteinlerde genellikle temel yapısal ve fonksiyonel roller oynayan diğer kanonik amino asitler için böyle bir olasılık yoktur1. Bu etkileşimleri, proteinlerin son derece spesifik iç mimarisi ve katlanma süreçleri bağlamında incelemek için ideal bir yaklaşım, yıkıcı olmayan isosterik modifikasyonlar üretmektir. Gerçekten de, kanonik olmayan amino asitler (ncAA'lar) olarak da bilinen bu kanonik amino asitlerin izosterik amino asit analogları proteinlere yerleştirildiğinde, tek atomlar veya "atomik mutasyonlar" olarak bilinen H / F, CH2 / S / Se / Te gibi atom grupları düzeyinde bile ince değişikliklere izin verirler2. Böyle bir "moleküler cerrahi", özellikleri yalnızca tek atomların veya atom gruplarının değişiminden kaynaklanan, uygun durumlarda analiz edilebilen ve tespit edilen değişikliklerin rasyonelleştirilebileceği değiştirilmiş proteinler üretir. Bu şekilde, protein katlanmasını ve yapısını incelemek için protein sentezinin kapsamı, klasik DNA mutagenezinin çok ötesine genişletilmiştir. Bölgeye yönelik mutagenez tarafından üretilen proteinlerin genellikle "mutantlar" olarak adlandırıldığını, oysa ikame edilmiş kanonik amino asitlere sahip proteinlerin "varyantlar" 3, "alloproteinler"4 veya "protein türdeşleri"5 olarak adlandırıldığını unutmayın.
İlk olarak deniz organizması Aequorea victoria'da tanımlanan yeşil floresan proteini (GFP), ultraviyole ila mavi ışığa maruz kaldığında parlak yeşil floresan gösterir 6,7. Günümüzde GFP, floresan mikroskopi yoluyla hücrelerde gen ekspresyonunun ve protein lokalizasyonunun rutin olarak görselleştirilmesi için oldukça hassas bir etiketleme aracı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. GFP'nin ayrıca çeşitli biyofiziksel 8,9,10 ve biyomedikal11,12 çalışmalarında ve ayrıca protein mühendisliği 13,14,15'te yararlı olduğu kanıtlanmıştır. GFP yapısının titiz analizi, çeşitli stabilite ve floresan maxima16,17 ile karakterize edilen çok sayıda varyantın oluşturulmasını sağlamıştır. Hücre ve moleküler biyolojide kullanılan GFP varyantlarının çoğu, hem çözeltide hem de kristal18'de bulunan monomerik proteinlerdir. Temel yapısal organizasyonları, filogenetik kökenlerinden bağımsız olarak GFP ailesinin tüm üyeleri için tipiktir ve β namluyu oluşturan 11 β iplikçikten oluşurken, bükülmüş bir α sarmal, namlunun ortasından geçmekte ve kromoforu taşımaktadır (Şekil 1A). Kromoforun otokatalitik olgunlaşması (Şekil 1B), onu çevreleyen yan zincirlerin proteinin merkezi yerinde hassas bir şekilde konumlandırılmasını gerektirir; Bu yan zincirlerin birçoğu diğer GFP varyantlarında yüksek oranda korunmuştur19. Aequorea victoria gibi denizanasından elde edilen floresan proteinlerin çoğunda, yeşil yayan kromofor, Tyr66'nın bir fenol halkası ve imidazolinonun beş üyeli heterosiklik yapısı da dahil olmak üzere iki aromatik halkadan oluşur (Şekil 1B). Kromofor, protein matrisine düzgün bir şekilde yerleştirildiğinde, tüm proteinin karakteristik floresansından sorumludur. Yapının merkezinde bulunurken, namlu yapısı onu sulu ortam20'den yalıtır. Kromoforun dökme suya maruz kalması, floresan söndürmeye, yani floresan kaybına neden olur21.
Namlu benzeri yapının düzgün bir şekilde katlanması, kromoforu floresan söndürme22'ye karşı korumak için gereklidir. Prolin (Pro) kalıntıları GFP23'ün yapısal organizasyonunda özel bir rol oynamaktadır. Bir β zincirini destekleyemedikleri için, protein yapısını bir bütün olarak korumaktan sorumlu bağlantı döngüleri oluştururlar. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, hem Aequorea hem de Anthoathecata'dan türetilmiş GFP'lerde 10-15 prolin kalıntısı bulunur; bazıları diğer floresan β varil protein türlerinde oldukça korunmuştur. Prolinlerin, kendine özgü geometrik özellikleri nedeniyle katlanma özelliklerini kritik olarak etkilemesi beklenir. Örneğin, Aequorea türevi GFP'lerde, on prolin kalıntısından (Şekil 2A), dokuzu trans- oluşturur ve sadece biri cis-peptid bağı oluşturur (Pro89). Pro58 esastır, yani 19 kanonik amino asidin geri kalanıyla değiştirilemez. Bu kalıntı, kromofor olgunlaşması ve genel GFP katlanması24 için çok önemli olduğu bildirilen Trp57 kalıntısının doğru konumlandırılmasından sorumlu olabilir. Üç prolin kalıntısı (Pro54, Pro56, Pro58) ve Trp57 içeren PVPWP fragmanı, GFP yapısındaki "alt kapağın" Şekil 1A'daki temel parçasıdır. PVPWP yapısal motifi, sitokromlar ve ökaryotik voltajla aktive olmuş potasyum kanalları25 gibi çeşitli proteinlerde bulunur. 75 ve 89 pozisyonlarındaki prolin-alanin ikameleri de protein ekspresyonuna ve kromofor olgunlaşmasının katlanmasına ve ortadan kaldırılmasına zararlıdır. Pro75 ve Pro89, kromoforu gömen "üst kapağın" bir parçasıdır (Şekil 1A) ve 11 sarmallı β varil floresan proteinleri23 boyunca korunur. Bu iki "kapak", kararlı üçüncül yapı kısmen kırılmış olsa bile, kromoforu sulu çözücüden dışlanmış halde tutar26. Böyle spesifik bir moleküler mimari, floroforu çarpışmalı (dinamik) floresan söndürmeden, örneğin su, oksijen veya diğer difüzyon ligandlarından korur.
GFP yapısının moleküler mühendisliğini gerçekleştirmek için, proteinin birincil yapısına amino asit ikameleri getirilmelidir. GFP üzerinde, yüksek stabilite, hızlı ve güvenilir katlanma ve değişken floresan özelliklerine sahip varyantlar sağlayan çok sayıda mutasyon gerçekleştirilmiştir17. Bununla birlikte, çoğu durumda, prolin kalıntılarının mutasyonu, kalan 19 kanonik amino asitten hiçbirinin prolin kalıntısı27'nin konformasyonel profilini düzgün bir şekilde geri yükleyememesi nedeniyle riskli bir yaklaşım olarak kabul edilir. Böylece, prolin kalıntılarının, prolin analogları28 olarak adlandırılan diğer prolin bazlı yapılarla değiştirildiği alternatif bir yaklaşım geliştirilmiştir. Eşsiz siklik kimyasal yapısı sayesinde, prolin iki karakteristik konformasyonel geçiş sergiler (Şekil 1C): 1) prolin halka büzüşmesi, öncelikle φ burulma açısını etkileyen omurganın organizasyonunu gerektiren hızlı bir süreç ve 2) peptid bağı cis / trans izomerizasyonu, ω burulma açıları aracılığıyla omurga katlanmasını etkileyen yavaş bir işlem. Yavaş doğası nedeniyle, ikinci geçiş genellikle tüm proteinin katlanma sürecindeki hız sınırlayıcı adımlardan sorumludur. Bazı prolin kalıntıları etrafındaki peptid bağ cis / trans izomerizasyonunun, GFP varyantlarının katlanmasında yavaş adımlar içerdiği daha önce gösterilmiştir. Örneğin, Pro89'daki cis-peptid bağının oluşumu, katlanma sürecindeki yavaş adımı içerir, çünkü transtan cis29'a bağ geçişine dayanır. Pro89'u bir all-trans peptid döngüsü ile değiştirdikten sonra, yani bir cis-to-trans izomerizasyon olayı30 ortadan kaldırılarak daha hızlı bir yeniden katlanma elde edilebilir. Cis / trans izomerizasyonuna ek olarak, büzüşme geçişleri, omurga organizasyonu ve protein iç27,31 içindeki paketleme nedeniyle protein katlanmasında da derin değişiklikler yaratabilir.
Kimyasal modifikasyonlar, prolin kalıntılarının içsel konformasyonel geçişlerinin değişmesine neden olur ve böylece proteinin katlanma yeteneğini etkiler. Bazı prolin analogları, katlanma özelliklerinin manipülasyonuna ve incelenmesine izin verdikleri için proteinlerde prolin ikamesi için özellikle çekici adaylardır. Örneğin, (4R)-floroprolin (R-Flp), (4S)-floroprolin (S-Flp), 4,4-difloroprolin (Dfp) ve 3,4-dehidroprolin (Dhp), hem moleküler hacim hem de polarite açısından prolin'den minimum düzeyde farklı olan dört analogdur (Şekil 1D)32. Aynı zamanda, her analog farklı bir halka büzüşmesi sergiler: S-Flp C 4-endo büzüşmeyi stabilize eder, R-Flp C4-exo büzüşmeyi stabilize eder, Dfp belirgin bir büzüşme tercihi göstermezken, Dhp büzüşmeyi ortadan kaldırır (Şekil 1D)33. Bu analogları protein yapısında kullanarak, prolin kalıntılarının konformasyonel geçişi ile manipüle edilebilir ve bununla ortaya çıkan GFP varyantlarının özelliklerini etkileyebilir.
Bu çalışmada, belirlenmiş prolin analogları setini (Şekil 1D), seçici basınç birleştirme yöntemini kullanarak GFP varyantlarının yapısına dahil etmek için yola çıktık (SPI, Şekil 3)34. Amino asit kalıntılarının en yakın izoyapısal analogları ile değiştirilmesi, protein tasarımında uygulanan biyoteknolojik bir kavramdır35,36. Bu nedenle, prolin analoglarının bir model proteindeki etkileri, protein mühendisliğinde araç olarak hizmet etme potansiyellerini göstermektedir37. İstenilen analogları içeren proteinlerin üretimi, prolin (prolin-auxotrophy) üretemeyen modifiye E. coli suşlarında gerçekleştirildi. Böylece, protein biyosentezi sürecinde substratların değiştirilmesini kabul etmeye zorlanabilirler38. Prolinin bu küresel ikamesi, endojen aminoasil-tRNA sentezlerinin doğal substrat esnekliği ile sağlanır39, tRNA'ların esterleşmesini uygun amino asitlerle katalize eden anahtar enzimler40. Genel olarak, Şekil 3'te belirtildiği gibi, hücresel büyüme, orta logaritmik büyüme fazına ulaşılana kadar tanımlanmış bir ortamda gerçekleştirilir. Bir sonraki adımda, değiştirilecek amino asit, fermantasyon sırasında ekspresyon sisteminden hücre içi olarak tükenir ve daha sonra istenen analog veya ncAA ile değiştirilir. Hedef protein ekspresyonu daha sonra kalıntıya özgü kanonik olmayan amino asit birleşmesi için indüklenir. Konyak amino asidinin analogu ile ikame edilmesi, proteom çapında bir şekilde gerçekleşir. Bu yan etkinin konakçı suşunun büyümesi üzerinde olumsuz bir etkisi olsa da, hedef protein üretiminin kalitesi çoğunlukla etkilenmez, çünkü rekombinant ekspresyonda, hücresel kaynaklar esas olarak hedef proteinin üretimine yönlendirilir41,42. Bu nedenle, sıkı bir şekilde düzenlenmiş, indüklenebilir bir ifade sistemi ve güçlü destekleyiciler, yüksek birleştirme verimliliği için çok önemlidir43. Yaklaşımımız, duyu kodonlarına (duyu kodonu yeniden atanması) yanıt olarak ncAA'ların çoklu kalıntıya özgü dahil edilmesine dayanmaktadır, böylece hedef gen içinde, Pro analog yerleştirme için pozisyon sayısı, sahaya yönelik mutajenez44 aracılığıyla manipüle edilebilir. Benzer bir yaklaşım, antimikrobiyal özelliklere sahip rekombinant peptitlerin hazırlanmasına ilişkin bir önceki raporumuzda da uygulanmıştı45. Bu çalışmada, kanonik amino asit repertuarı ile sentezlenen proteinlerde bulunmayan farklı fizikokimyasal özelliklere sahip olması beklenen proteinleri üretmek için tüm prolin kalıntılarının ilgili analoglarla değiştirilmesini sağlayan SPI yöntemini uyguladık. Ortaya çıkan varyantların katlanma ve floresan profilini karakterize ederek, GFP varyantlarındaki atomik ikamelerin etkilerini sergilemeyi amaçlıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>&#8805;98 %, p.a., ACS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane,&#160;N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td>&#8805;99 %, p.a., for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)</td>
			<td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)</td>
			<td>10731181</td>
			<td>cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738.5</td>
			<td>100 %, p. a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chlroide (HCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4S)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033274</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4R)-fluoroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4033275</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dehydroproline</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4003545</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoroproline</td>
			<td>Enamine</td>
			<td>EN400-17448</td>
			<td>Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 20 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe, 50 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50348</td>
			<td>https://www.addgene.org/50348/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-auxotrophic E. coli strain JM83</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>35607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#181;m with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis/NIR spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: how "molecular surgery" of the backbone affects folding and stability

Proteinlerdeki prolin (Pro) kalıntılarının, kalan 19 kanonik amino asitten herhangi biri tarafından geleneksel bölgeye yönelik mutagenez ile değiştirilmesi, genellikle protein katlanmasına ve özellikle yeşil floresan proteinlerde ve ilgili varyantlarda kromofor olgunlaşmasına zararlıdır. Makul bir alternatif, proteinin çevirisini manipüle etmektir, böylece tüm Pro kalıntıları kalıntılarla değiştirilir - özellikle seçici basınç birleştirme (SPI) olarak bilinen bir yöntem olan analoglarla. Dahili kimyasal modifikasyonlar, ölçülebilir değişiklikleri ince bir şekilde incelemek veya hatta farklı protein özelliklerini rasyonel olarak manipüle etmek için bir tür "moleküler cerrahi" olarak kullanılabilir. Burada, çalışma, SPI yönteminin, yeşil floresan proteininin (GFP) spektral varyantlarının tipik β varil yapısının organizasyonundaki rolünü incelemek için yararlılığını göstermektedir: dizilerinde 10-15 prolin: gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP), NowGFP ve KillerOrange. Pro kalıntıları, bireysel β teller arasındaki bağlantı bölümlerinde bulunur ve namlu iskelesinin kapanış kapaklarını oluşturur, böylece kromoforun sudan yalıtılmasından, yani floresan özelliklerinden sorumludur. (4R)-floroprolin (R-Flp), (4 S)-floroprolin (S-Flp), 4,4-difloroprolin (Dfp) ve 3,4-dehidroprolin (Dhp) ile seçici basınç birleştirme deneyleri, ekspresyon konakçısı olarak prolin-oksotrofik bir E. coli suşu kullanılarak gerçekleştirildi. S-Flp ve Dhp'li floresan proteinlerin aktif olduğunu (yani floresan), diğer iki analogun (Dfp ve R-Flp) işlevsiz, yanlış katlanmış proteinler ürettiğini bulduk. UV-Vis absorpsiyonu ve floresan emisyon profillerinin incelenmesi, Pro analogları içeren proteinlerde çok az karakteristik değişiklik olduğunu göstermiştir. EGFP varyantlarındaki katlanır kinetik profillerin incelenmesi, S-Flp varlığında hızlandırılmış bir yeniden katlanma işlemi gösterirken, işlem Dhp içeren proteindeki vahşi tipe benzerdi. Bu çalışma, SPI yönteminin, ilgilenilen diğer proteinlerin incelenmesi için benimsenebilecek atomik düzeyde ("moleküler cerrahi") protein kalıntılarının ince modifikasyonlarını üretme kapasitesini göstermektedir. β varil floresan proteinleri sınıfındaki katlanma ve spektroskopik özellikler üzerinde yakın kimyasal analoglarla prolin replasmanlarının sonuçlarını göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability at JoVE

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Klasik bölgeye yönelik mutagenezin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, spesifik modifikasyonlara sahip prolin analogları birkaç floresan proteinine dahil edildi. Hidrojenin flor ile veya prolin kalıntılarındaki tekli çift bağlarla ("moleküler cerrahi") değiştirilmesinin, katlanmaları ve ışıkla etkileşimleri de dahil olmak üzere temel protein özelliklerini nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Floresan Proteinlerde Prolin Analogları ile Prolinin Kalıntıya Özgü Değişimi: Omurganın "Moleküler Cerrahisi" Katlanma ve Stabiliteyi Nasıl Etkiler?

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

Çoğu durumda, konvansiyonel bölgeye yönelik mutagenez, proteinlerdeki prolinlerin fonksiyonel rolünü incelemek için uygun değildir. Burada, prolin kalıntılarının protein katlanması ve fonksiyonu üzerindeki rolünü araştırmak için prolin analoglarını kanonik olmayan amino asitler olarak ribozomal olarak sentezlenmiş proteinlere dahil etmek için bir yöntem sunuyoruz. Prolinlerin standart amino asitlerle ikame edilmesi riskli bir yaklaşımdır.Prolin analoglarının dahil edilmesi bir tür moleküler cerrahiye izin verir. Başka bir deyişle, protein özelliklerini rasyonel olarak etkilemek ve manipüle etmek için ince moleküler değişiklikler getirir. Prolin kalıntıları protein iskelelerinin stabilitesinde önemli bir rol oynadığından, teknolojimiz insanlarda belirli patolojik durumların altında yatan protein katlanma açıklarının arkasındaki nedenleri anlamak için yardımcı olabilir.Prolin replasmanları tarafından indüklenen protein değişiklikleri, enzimlerin biyoteknolojik mühendisliği için etkilere sahiptir ve ribozomal protein translasyonunun veya katlanmasının geliştirilmesi için fırsatlar sağlar. Bu yöntem özel ekipman ve pahalı enstrümantasyon gerektirmez. Prolin analoglarının eklenmesinden önce doğal prolinin E.coli kültürlerinden tükendiği protokol adımlarına özel dikkat gösterilmelidir.Doğal prolin ile floresan proteinlerinin üretimine başlamak için, iki litrelik bir Erlenmeyer şişesinde 200 mililitre taze NMM ortamını iki mililitre gece kültürü ile aşılayın. Hücreleri yaklaşık 3.5 saat boyunca 220 RPM'de yörüngesel bir çalkalayıcıda 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka sırasında, optik yoğunluğu her 30 dakikada bir spektrofotometrede 600 nanometrede ölçün.Optik yoğunluk 0.7'ye ulaştığında, hücre süspansiyonunu aşağı doğru döndürün ve süpernatantı yavaşça boşa ayırın. Daha sonra, hücreleri 50 mililitre buz gibi soğuk NMM'de herhangi bir amino asit olmadan veya prolinsiz NMM içinde yeniden askıya alarak yıkayın. Hücreleri tekrar döndürün ve süpernatantı atıklara boşaltın.Daha sonra, prolinsiz 200 mililitre NMM'de nazik pipetleme yaparak hücre peletini yeniden askıya alın ve iki litrelik bir Erlenmeyer şişesinde ampisilin ile takviye edin ve prolinin tamamen tükenmesine izin vermek için hücreleri 30 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonunda bir milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için 50 milimolar stok çözeltilerinden uygun miktarda L-prolin veya prolin analogları ekleyin. Daha sonra, tek molar stok çözeltisinden 500 mikromolar IPTG ekleyerek hedef protein ekspresyonunu indükleyin.Hedef proteini bir yörüngesel çalkalayıcıda gece boyunca 37 santigrat derecede eksprese edin ve ertesi gün optik yoğunluğu ölçün. Bakteri hücrelerini santrifüjleme ile toplayın ve süpernatantı atıklara boşaltın. Daha sonra,% 10 gliserol içeren 50 mililitre bağlayıcı tamponda dikkatli pipetleme yaparak hücreleri yıkayın.Hücreleri tekrar döndürün, süpernatanı boşaltın ve hücre peletini daha fazla kullanana kadar eksi 20 veya 80 santigrat derecede 50 mililitrelik bir tüpte saklayın. Floresan emisyonunu değerlendirmeden önce, numune saflığının% 95'in üzerinde olduğundan emin olmak için bir SDS-PAGE gerçekleştirinArdından, her saflaştırılmış protein varyantının numunelerini, uygun dalga boyunda hesaplanan absorbans değerini referans olarak alarak 0.3 mikromollük bir konsantrasyona ayarlayın. Yaklaşık nihai numune hacminin 200 mikrolitre olduğundan emin olun.Seyreltilmiş numunelerin oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin. Bir saat sonra, numuneleri bir santimetrelik kuvars küvete aktarın ve bir floresan spektrometresi kullanarak numunelerin floresan emisyon spektrumunu ölçün. Denatürasyonu indüklemek için, iki mikrolitre 300 mikromolar numuneyi, 8.89-molar üre ve 5.56-milimolar DTT içeren 18 mikrolitre 1.11X PBS tamponuna ekleyerek her protein varyantının numunelerini yirmi kat seyreltin.Örnekleri beş dakika boyunca 95 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, renatürasyonu indüklemek için beş milimolar DTT içeren 1.980 mikrolitre PBS ekleyerek numuneleri 100 kat seyreltin ve numunelerin 200 mikrolitresini hemen bir santimetrelik kuvars küvete aktarın. Kuvars küvetini uygun bir floresan spektrometresine yerleştirin ve 30 dakika boyunca her üç saniyede bir floresan spektrumu elde ederek protein yeniden katlanmasını izleyin.Yeniden katlanan numuneleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarın, ardından kapağı kapatın ve EGFP varyantlarının tamamen yeniden katlanmasına izin vermek için numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında saklayın. 24 saat sonra, floresan geri kazanımının zamansal bitiş noktasını yakalamak için daha önce olduğu gibi aynı uyarma dalga boyunu kullanarak yeniden katlanmış protein örneklerinin floresan emisyonunu ölçün. Doğal protein eksprese eden hücrelerden ve S-floroprolin ve dehidroprolin taşıyan varyantlardan elde edilen peletler, bozulmamış kromofor nedeniyle tipik bir parlak renge sahipti.Buna karşılık, R-floroprolin ve difloroprolin içeren varyantlar renksiz kaldı, bu da inklüzyon cisimlerinde katlanmamış proteinin yanlış katlandığını ve biriktiğini gösterdi. SDS-PAGE analizi, çözünmeyen R-floroprolin içeren proteinlerin varlığını doğruladı. Buna karşılık, çözünür fraksiyonlarda doğal proteinler ve S-floroprolin ve dehidroprolin taşıyan varyantlar bulundu.Sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi analizinde, S-floroprolin ile yapılan her prolin replasmanı, prolin kalıntısı başına pozitif bir 18-dalton kayması üretirken, dehidroprolin ile değiştirme, kalıntı başına iki daltonluk negatif bir kayma üretti. Işık absorpsiyonu ve emisyon spektrumlarında, EGFP için 488 nanometrede ve NowGFP için 493 nanometrede kromofor emilimi bulundu. KillerOrange'da, kromofor absorbans bölgesi, karmaşık kromoforun iki olası konfigürasyon ve yük durumuna karşılık gelen iki banttan oluşuyordu.Ayrıca, karşılık gelen maksimum absorbans dalga boylarında uyarma üzerine kaydedilen floresan spektrumları, analogların kromoforların kimyasal ortamını değiştirmediğini ima etti. Yeniden katlama deneylerinde, doğal EGFP kromofor floresansı kısmen iyileşti, ancak triptofana özgü floresan renatürasyondan sonra daha büyüktü. Dehidroprolin içeren varyant için de benzer davranış gözlenmiştir.EGFP içeren S-floroprolin'de, 295 nanometrelik bir uyarılma ile benzer bir sonuç gözlenirken, floresan 488 nanometrede çok daha yüksek bir dereceye kadar geri kazanıldı. Sadece EGFP varyantları, triptofan emisyon geri kazanımının kromofor emisyonuna kıyasla iki kat daha hızlı olduğu hızlı yeniden katlanan kinetiği gösterdi. Uygun büyüme ortamına sahip taze bakteri kültürleri kullanılmalıdır.Steril teknikler ve kültür büyümesinin düzenli olarak izlenmesi de deneyin başarısı için önemli ön koşullardır. Bu yöntem, diğer kanonik amino asitlerin rolünü incelemeye izin verdiği için protein mühendisliğine uygulanabilir. Bunun için uygun oksotrofik E.coli suşlarına ve amino asit analoglarına ihtiyaç vardır.Tüm proteinlerin kütle spektrometrisi, kanonik olmayan amino asit analoglarının dahil edilmesini doğrulamak için analitik kanıt olarak gereklidir. Prolin analoglarını dahil etmek için SPI yöntemi, protein omurgasını doğrudan manipüle etmemize izin verir ve küresel stabilizasyon ve ribozomal translasyonun veya katlamanın iyileştirilmesi yoluyla rasyonel tasarım ve kolaylaştırılmış protein üretimi için avantajlar sunar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

Yan yana İyon Değişimi Membranlar arasında İyon Konsantrasyon Polarizasyon birleştirme Polarizasyon Bölgesi İlerlemesinin yasakla

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...