Name: longitudinal intravital microscopy using a mammary imaging window with replaceable lid
Uploaded: 2022-01-20T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר פלנדריה (מענק דוקטורט מחקר בסיסי 11L7222N ל- M.C.), קרן בוהרינגר אינגלהיים (מלגת דוקטורט ל- C.L.G.J.S), מלגת פוסט-דוקטורט של EMBO (מענק ALTF 1035-2020 ל- C.L.G.J.S.), ופרס דוקטור ג'וזף שטיינר (ל- J.v.R).

<ol>
	<li>Watson, C. J., Khaled, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+development+in+the+embryo+and+adult:+new+insights+into+the+journey+of+morphogenesis+and+commitment.">Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment.</a> Development. 147 (22), (2020).</li><li>Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intravital+Microscopy+Toolbox+to+Study+Mammary+Gland+Dynamics+from+Cellular+Level+to+Organ+Scale.">An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).</li><li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+dynamic+single-cell+behavior+in+mouse+mammary+tissue.">Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue.</a> Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).</li><li>Scheele, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+and+dynamics+of+mammary+stem+cells+during+branching+morphogenesis.">Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis.</a> Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).</li><li>Kotsuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive,+serial+in+vivo+imaging+of+a+tissue-flap+using+a+tissue+adhesion+barrier.">Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier.</a> IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).</li><li>Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+promote+collagen+fibrillogenesis+around+terminal+end+buds+of+the+developing+mammary+gland.">Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=large-volume,+high-resolution+intravital+imaging+for+tissue-wide+analysis+of+single+cell+dynamics.">large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics.</a> Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+of+the+Lactating+Mammary+Gland+in+Transgenic+Mice+Expressing+Fluorescent+Proteins.">Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins.</a> Advances in Intravital Microscopy. , 187-204 (2014).</li><li>Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+milk+lipid+droplet+transport,+growth,+and+secretion+revealed+by+intravital+imaging:+lipid+droplet+release+is+intermittently+stimulated+by+oxytocin.">Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).</li><li>Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symposium+review:+Intravital+imaging+of+the+lactating+mammary+gland+in+live+mice+reveals+novel+aspects+of+milk-lipid+secretion.">Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion.</a> Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mice+for+Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Mammary+Gland.">Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Vital+Signs+for+Long-Term+Survival+of+Mice+under+Anesthesia.">Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).</li><li>Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+Time-lapse+Intravital+Imaging+of+Real-time+Multicellular+Dynamics+in+the+Tumor+Microenvironment.">Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2++mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> IntraVital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+rodent+mammary+window+of+orthotopic+breast+cancer+for+intravital+microscopy.">A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy.</a> Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).</li><li>Zomer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cancer+stem+cell+plasticity+in+mammary+tumors.">Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors.</a> Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Niinomi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+research+and+development+in+titanium+alloys+for+biomedical+applications+and+healthcare+goods.">Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Crypt+Homeostasis+Results+from+Neutral+Competition+between+Symmetrically+Dividing+Lgr5+Stem+Cells.">Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li><li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos.">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC Developmental Biology. 9, 49 (2009).</li><li>Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+Axis+Is+Specified+Independently+of+Early+Cell+Lineage+But+Aligns+with+the+ZP+Shape.">Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape.</a> Science. 316 (5825), 719-723 (2007).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+physiological+motion+from+Intravital+and+clinical+functional+imaging+data.">Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data.</a> eLife. 7, 35800 (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף

ה- R.MIW מאפשר הדמיה אורכית של בלוטת החלב הבריאה והחולה בסביבתה הטבעית והמופרעת באופן מינימלי ומאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של בלוטת החלב בשלבי התפתחות מגוונים. עיצוב R.MIW מאפשר לפתוח את החלון בכל שלב במהלך הניסוי. גישה חזותית ארוכת טווח לרקמה המעניינת עלולה להיפגע, למשל, על ידי הצטברות של פסולת תאים על הכיסוי. במקרים כאלה, ניתן לפתוח את ה- R.MIW לפני או מיד לאחר סשן הדמיה כדי לאפשר ניקוי של כל אזור הרקמה והמכסה הנראים לעין. המכסה הנשלף מאפשר גם מניפולציות של הרקמה, כמו גם יישום מקומי של חומרים, כגון מעכבים וטיפולים ספציפיים, צבעי תיוג או סוגי תאים ספציפיים בעלי עניין.
שיטה זו מתגברת על המגבלה של 4,7,8,13 פרוצדורות העור של החלב שתוארו קודם לכן, המוגבלות לסשן הדמיה אחד, ויכולות לדמיין תהליכים כגון הסתעפות מורפוגנזה (איור 5), תחלופת רקמות הומאוסטטית (איור 6), או צמיחת גידול ברמה התאית (איור 3B ). עם זאת, יחד עם זאת, ה- R.MIW מאפשר מניפולציה מקומית של הרקמה בין מפגשי ההדמיה, המהווים נכס גדול של ה- R.MIW בהשוואה ל- MIW 3,18 שפורסם בעבר ולכל שאר חלונות ההדמיה20,22. בעת פתיחת R.MIW, חשוב לשמור על תנאים אספטיים בכל עת כדי למנוע כל מקור של זיהום. היכולת לפתוח את ה-R.MIW בסביבה אספטית מאפשרת אופטימיזציה של תנאי ההדמיה לפני כל מפגש הדמיה, מה שמשפר מאוד את הגישה החזותית ארוכת הטווח לרקמה המעניינת. באופן ספציפי, בבלוטת החלב, אשר מוטבעת בסטרומה עשירה באדיפוציטים, זה בעל ערך רב. יתר על כן, המכסה הניתן להחלפה יכול לאפשר באופן ייחודי מתן מקומי של טיפולים, סוגי תאים שונים, צבעי תיוג, מיקרודיסקציה מונחית תמונה, או כל מניפולציה מקומית אחרת של הרקמה ללא צורך לסיים את ניסוי ההיפוך ההפוכותי. לדוגמה, כדי לחקור את התחלת הגידול, ניתן להזריק אוכלוסיות ספציפיות של תאים סרטניים ישירות לעץ הצינור או לסטרומה בנקודת זמן מוגדרת של IVM ומיקום מדויק של בלוטות החלב, כל עוד החזר ההשקעה הזה נגיש דרך טבעת R.MIW. כדי לחקור את התקדמות הגידול, אוכלוסיות ספציפיות של תאים סרטניים (במיקום מסוים, בסביבת מיקרו מסוימת, או עם התנהגות מסוימת) יכולות להיות מסומנות באופן מצולם במהלך סשן ההיפוך ההפוכותי ולאחר מכן לנתח אותן במיקרוסקופ כריתה פלואורסצנטי לאחר פתיחת ה- R.MIW. תאים מבודדים יכולים להיות מעובדים עוד יותר לצורך ניתוחים במורד הזרם, כגון ריצוף mRNA (חד-תאי). על ידי שימוש בגישה זו, ניתן להצמיד את התנהגות תאי in vivo לפרופילי ביטוי מולקולריים. היתרון של מתן תרופות מקומי המתאפשר על ידי R.MIW מאפשר לצלם את הרקמה לפני הטיפול ומיד לאחריו. המרווח הדרוש כדי להסיר את העכבר מתיבת ההדמיה ולאחר מכן לבצע מתן תרופות מקומי לאחר פתיחת מכסה R.MIW יכול להתבצע תוך דקות, מה שמאפשר לכידת פאזה מיידית של תרופות הפועלות במהירות.
אנו מראים כי IVM של בלוטת החלב דרך R.MIW תואם למודלים רבים ושונים של עכברים מדווחים פלואורסצנטיים. הסביבה העשירה בשומן מאתגרת לצילום, ולכן מומלץ להשתמש בפלואורופורים בהירים. עם זאת, כפי שמוצג כאן, ניתן לדמיין אפילו פלואורופורים בהירים פחות כגון mCFP באמצעות R.MIW בתנאי הדמיה אופטימליים. באופן בלתי נמנע, כרית השומן תמנע את ההדמיה של מבני הצינורות העמוקים יותר, ותגביל את ההדמיה לצינורות השטחיים יותר. תמונת סקירה ברזולוציה נמוכה בתחילת כל ניסוי IVM תסייע לזהות את המבנים הצינוריים המעניינים שהם שטחיים מספיק להדמיה ברזולוציה גבוהה. מניפולציה מקומית של רקמות, הסרת רקמת חיבור או מיקום מחדש של רקמת השומן לאחר פתיחת ה-R.MIW יכולים לייעל את ה-IVM עבור ROIs ספציפיים שמונחים על ידי רקמת השומן. זהו יתרון חשוב על פני כל עיצובי החלונות הקודמים, שאינם מאפשרים לבצע מניפולציות אלה וידרשו הסרה מלאה של החלון עצמו. באופן ספציפי, להדמיה של בלוטת הלימפה המפשעתית, מומלץ להסיר בעדינות את רקמת השומן יתר על המידה, מה שמפחית את פיזור האור ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה. בעת מניפולציה של הרקמה, תמיד לשמור על מצבים אספטיים ולמנוע דימום או נזק חמור לרקמה, כפי שהם עשויים להשפיע על התהליכים הנחקרים במהלך ניסוי IVM.
ה- R.MIW עשוי מטיטניום, חומר המשמש בדרך כלל בפרקטיקה הקלינית להחלפת רקמות קשות כגון מפרקים או צלחות עצם. לטיטניום יש מספר יתרונות על פני חלונות פלדה, כולל האופי הקליל והאינרטישלה 21. לאחרונה, מספר חומרים אחרים שימשו ליצירת סוגי חלונות הדמיה חדשניים, כולל חלון הסיליקון הגמיש20. בניגוד ל-R.MIW, החלון הגמיש אינו דורש תפרים כלשהם להשתלה ומתאים כמעט לכל תנוחה אנטומית, במיוחד במקרה של רקמות רכות ושבריריות. לחלונות הסיליקון יש השפעה מינימלית על תנועתיות בעלי החיים בשל אופיים הקל והמעוות, וייתכן שהם מתאימים יותר לניסויים החוקרים התרחבות וצמיחה מהירה של רקמות20. יתרון נוסף על פני גרסת הטיטניום הוא שחלונות הסיליקון תואמים לדרכי הדמיה אחרות, כולל הדמיית תהודה מגנטית 20,27. עם זאת, יהיה חשוב לזכור כי המטרות מותאמות עבור כיסויי זכוכית 0.17 מ"מ. יתר על כן, רקמת החלב רגישה לתנועות נשימה, שקשה להגביל באמצעות החלון הגמיש, במיוחד בעת שימוש במיקרוסקופ הפוך. ממצאי נשימה ממוזערים על ידי עיצוב R.MIW וקיבוע ה- R.MIW בשיבוץ של תיבת ההדמיה. כתוצאה מכך, תמונות שנרכשו באמצעות הגדרת R.MIW המוצעת אינן מעוותות עקב ממצאי נשימה. עם זאת, סחף קל בלוקליזציה של רקמות יכול להתרחש, שהם בדרך כלל הדרגתיים וניתן לתקן אותם באמצעות תוכנה לתיקון תנועה לאחר הרכישה28. עם ארגז הכלים ההולך וגדל של טכנולוגיות IVM 2,20, הדרישות הספציפיות עבור כל ניסוי יקבעו בסופו של דבר את הדרך הטובה ביותר להדמיה in vivo של הרקמה המעניינת. לעיצובי חלונות שונים יש יתרונות וחסרונות שונים ובהתאם לשאלת המחקר, למערך המיקרוסקופיה הזמין, לרזולוציה המרחבית והזמנית הנדרשת ולטווח הזמן הכולל של התהליך הנחקר, יש לקבוע את הגישה האופטימלית.
לסיכום, R.MIW מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של הדינמיקה התאית במהלך התפתחות בלוטות החלב, הומאוסטזיס ומחלות במשך מספר ימים עד שבועות.

אפיתל החלב הוא איבר הפרשה ייחודי הנמצא ביונקים, המייצר ומפריש חלב להזנת הצאצאים. במהלך החיים, בלוטת החלב עוברת סבבים מרובים של התפתחות וצמיחה, אשר מלווים בשינויים מבניים ותפקודיים של הרקמה1. בהתאם לשלב ההתפתחותי, סוגי התאים התורמים לשיפוץ הרקמות שונים, כמו גם המיקום בתוך עץ הצינור.
מיקרוסקופיה תוך-ורידית מרובת-פוטון (IVM) מאפשרת לחקור את הדינמיקה של תאי החלב in vivo בהגדרה הטבעית והמזערית שלהפרעה 2,3,4. כדי לקבל גישה חזותית לבלוטת החלב, פורסמו מספר טכניקות זמניות להדמיית ex vivo או דש העור במהלך שלבים שונים של התפתחות בלוטת החלב, כולל גיל ההתבגרות 4,5,6,7, בגרות 2,8, הנקה 9,10,11,12, ודינמיקת הגידול13,14 ,15. אף על פי שטכניקות אלה גורמות להדמיה מרחבית וזמנית גבוהה של דינמיקה של תאי החלב, מסגרת הזמן מוגבלת לשעות בעוד שרוב תהליכי שיפוץ בלוטת החלב נמשכים ימים עד שבועות. לכן, נדרשות שיטות המאפשרות גישה אופטית לרקמה המעניינת למשך מסגרות זמן ממושכות. במהלך השנים פותחו מספר חלונות הדמיה קבועים להדמיית גידולי יונקיםבהדמיית 15,16,17,18, כולל חלון הדמיה של יונקים מטיטניום (MIW)2,3,19. למרות מאוד שימושי כדי לחקור צמיחת גידול החלב, הדמיה של מבנה בלוטת החלב בריא נשאר מוגבל למספר ימים. לאחרונה פותח חלון הדמיה גמיש מסיליקון, המאפשר הדמיה של בלוטת החלב של ההתבגרות במשךמספר שבועות 20. עם זאת, בלוטת החלב מוטבעת בכרית שומן עשירה באדיפוציטים, מה שמוביל לפיזור אור נרחב וכתוצאה מכך הראות המוגבלת של מבני צינורות החלב. לכן, תנאי הדמיה מעולים נדרשים בכל עת כדי לדמיין את הדינמיקה של הרקמות על פני פרקי זמן ממושכים בבלוטת החלב. לא ה-MIW הקלאסי, ולא חלון הסיליקון הגמיש מאפשרים מניפולציה של רקמות או אופטימיזציה של מיקום הרקמה הפיזית לפני ההדמיה, שכן החלון יוצר מערכת סגורה לאחר ניתוח והשתלה. כתוצאה מכך, גישה אופטית אופטימלית לרקמת החלב הבסיסית עשויה להיות מונעת על פני תקופות זמן ארוכות יותר. לעומת זאת, טכניקת דש העור מאפשרת אופטימיזציה ומיקום מחדש של הרקמה במהלך סשן ההדמיה וניתן לחזור על דש העור מספר פעמים2. עם זאת, מפגשי הדמיה חוזרים ונשנים דרך דש העור אפשריים רק כאשר מוקצה מספיק זמן (לפחות 7 ימים) בין ניתוחים כדי לאפשר התאוששות של העור ולכן הוא מתאים בעיקר לתהליכי מחקר בקני מידה ארוכים יותר של זמן. יתר על כן, מומלץ לא לבצע הליך זה פעמים רבות בגלל אופיו הפולשני והסיכון הגדול לזיהומים וצלקות עם סגירת הפצע.
כדי להתגבר על המגבלות הללו, כלומר, כדי להבטיח תנאי הדמיה אופטימליים לפרק זמן ממושך בתדירות גבוהה ובמקביל לאפשר מניפולציה של רקמות, גרסה משופרת של הטיטניום של ה-MIW עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW) תוכננה כדי לדמיין את בלוטת החלב הבריאה והחולה במשך מספר ימים עד שבועות2 (איור 1A, ב). ה-R.MIW תוכנן בהתאמה אישית כדי לספק גישה אופטימלית לרקמות, מה שמאפשר מניפולציה ישירה של רקמות לאורך כל משך הניסוי של IVM, ובכך מאפשר הדמיה של בלוטת החלב בזמן ובמקום הנכונים לאורך פרקי זמן ממושכים. כאשר הוא סגור, R.MIW יוצר מערכת אטומה הדומה ל-MIW הקלאסי (איור 1C). כאשר הוא נפתח בתנאים אספטיים, ה-R.MIW מאפשר מניפולציה מקומית של רקמות כדי לשפר את הגישה האופטית וגם מאפשר מתן מקומי של חומרים, כגון מעכבי מסלולים או אגוניסטים, הזרקה של סוגי תאים שונים בעלי עניין, כגון אוכלוסיות תאים סרטניים או תאי מערכת החיסון, או תוספת של צבעי תיוג רקמות. ניתן לפתוח את המכסה בכל רגע בין מפגשי ההדמיה מבלי לגרום נזק לרקמה שמתחת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig01.jpg"> איור 1: עיצוב חלון הדמיה של החלב עם מכסה הניתן להחלפה. (A) מבט עליון ומבט מהצד של המכסה הניתן להחלפה של חלון הדמיית החלב עם כיסוי בקוטר 10 מ"מ המודבק לטבעת. (B) מבט עליון ומבט מהצד של חלון ההדמיה של החלב, המורכב מטבעת חיצונית וטבעת פנימית עם חריץ ביניהם כדי לאבטח את החלון בתוך עורו של העכבר באמצעות תפר מיתר ארנק. לטבעת החיצונית יש חריץ קטן שמתאים לארבע הקרנות (הזרועות) של המכסה. (C) קריקטורה ותמונות המדגימות את מנגנוני הפתיחה והסגירה של המכסה. הקרנות ההטיה מוודאות שהמכסה קבוע בתוך מסגרת החלון. נתון זה שונה מ- Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
פרוטוקול זה מתאר את הליך התכנון וההשתלה של R.MIW, כמו גם אסטרטגיית IVM אורכית כדי לבחון מחדש את אותם צינורות החלב ואת ההדמיה שלהם ברזולוציה תאית. ה-R.MIW מאפשר לעקוב אחר חלוקות תאים ושינויים מורפולוגיים במהלך שלבים התפתחותיים שונים של בלוטת החלב במודלים מגוונים של עכברים מדווחים פלואורסצנטיים. יחד, R.MIW מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של הדינמיקה התאית במהלך התפתחות בלוטת החלב, הומאוסטזיס ומחלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td>BD</td>
			<td>306573</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm round coverglass</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10696365</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 braided silk suturs</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia induction box</td>
			<td>Kentscientific</td>
			<td>VetFlo-MSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Vetergesic&#174;)</td>
			<td>Ecuphar</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tips (sterile)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13113743</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>NA</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Duratears</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible butterfly needle</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>450120</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps (blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Kentscientific</td>
			<td>RightTemp Jr.</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging box</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infuse nutrient mixture</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Nutriflex special 70/240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>324911</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted multi-photon microscope with automated stage</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Kentscientific</td>
			<td>VetFlo-1231K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12510-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>semi-transparent tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape tesa</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Vaseline</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11904325</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>Solutions Elastomeres</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any houseware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (10 ml)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lid for mammary imaging window</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium mammary imaging window</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden sticks toothpicks</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC1678836</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital microscopy using a mammary imaging window with replaceable lid

המבנה המסועף של בלוטת החלב הוא דינמי מאוד ועובר מספר שלבים של גדילה ושיפוץ לאחר הלידה. מיקרוסקופיה תוך ורידית בשילוב עם ניתוח דש העור או השתלת חלונות הדמיה שימשה לחקר הדינמיקה של בלוטת החלב הבריאה בשלבי התפתחות שונים. רוב טכנולוגיות הדמיית החלב מוגבלות למסגרת זמן של שעות עד ימים, בעוד שרוב תהליכי שיפוץ בלוטות החלב מתרחשים במסגרות זמן של ימים עד שבועות. כדי לחקור שיפוץ בלוטות החלב, נדרשות שיטות המאפשרות גישה אופטית לרקמה המעניינת למסגרות זמן ממושכות. כאן מתוארת גרסה משופרת של חלון ההדמיה של יונק הטיטניום עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW) המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של בלוטת החלב ברזולוציה תאית למשך עד מספר שבועות. חשוב לציין שה-R.MIW מספק גישה לרקמות לאורך כל משך ניסוי ההדמיה התוך-לוויטלית, ולכן הוא יכול לשמש למניפולציה מקומית של רקמות, תיוג, מתן תרופות או מיקרו-דיסקציה מונחית תמונה. יחד, R.MIW מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של הדינמיקה התאית במהלך התפתחות בלוטות החלב, הומאוסטזיס ומחלות.

כדי לחקור את הדינמיקה המתפשטת של תאי אפיתל החלב במהלך שלבי ההתפתחות השונים של בלוטת החלב, בוצע הפרוטוקול המתואר. העיצוב של R.MIW מתואר באיור 1, וההליך להשתלת R.MIW מסוכם באיור 2. ה- R.MIW מושתל בניתוח בין בלוטת החלב לעור. תפר משמש כדי להחזיק בתוך טבעת החלון ולמנוע מהעכברים למשוך את התפרים (איור 2). התפרים המחזיקים את ה-R.MIW עשויים ממשי שאינו נספג, בעל תכונות היפואלרגניות, מרקם רך וקל לטיפול בו. טבעת R.MIW עשויה מטיטניום, אחד החומרים הניתנים ביותר להתאמה ביולוגית שאינם מקדמים דלקת או נמק לאחר השתלה21. אם התנאים האספטיים עוקבים אחריהם והתפרים מבוצעים היטב, השתלת בלוטת החלב R.MIW מהווה סיכון נמוך לסיבוכים לאחר הניתוח. יתר על כן, בניגוד להדמיית בטן השתלת חלון22, השתלת R.MIW אינה גורם מגביל להישרדות העכבר מכיוון שבלוטת החלב אינה איבר חיוני ומאפשרת הדמיה יומית עד לגבול שצוין בפרוטוקול האתי. הגורם היחיד שמגביל את משך השתלת החלון הוא המחזור ההומאוסטטי של העור, מה שיוביל בסופו של דבר לכך שהתפרים ייפלו לאחר 4 - 6 שבועות. לכן, חשוב לבדוק באופן קבוע את יציבות התפרים. אם תרצה, ניתן להסיר את התפרים ולהחליפם בתפר חדש של מיתר ארנק בתנאים אספטיים (כמתואר בשלבים 3.5 - 3.8) כדי להרגיע את יציבות החלון.
אתגר מרכזי בעת שימוש בגישת ההדמיה הרב-יומית הוא שחזור החזר על ההשקעה בימים רצופים. לשם כך, ניתן לכלול סריקת סקירה מהירה לפני בחירת החזר ההשקעה (איור 3B). ניתן להשתמש בציוני דרך מרובים של רקמות כדי לשחזר את אותו אזור ברקמה, כולל אות רשת הקולגן (שהודגם על ידי דור הרמוני שני), מבנה הרקמה, כמו גם דפוסים מקומיים של תאים באופן דיפרנציאלי או סטוכסטי המסומנים בצבעים או בחלבונים פלואורסצנטיים (איור 3B). בדוגמה מייצגת זו, הושתל R.MIW על בלוטת החלב הרביעית של MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-קונפטיhet עכבר נקבה בתחילת היווצרות גידול מוחשי. לאחר מכן, רקומבינציה סטוכסטית הושרה על ידי הזרקה של טמוקסיפן של 1.5 מ"ג, וכתוצאה מכך רקומבינציה של מבנה הקונפטי בתאים מסוימים (איור 3C). תאי הגידול הרקומבינריים היו במעקב במשך תקופה של 20 יום (איור 3B,C). אם מונעים הדמיה של אותו אזור בבלוטת החלב במשך ימים רצופים, ניתן לפתוח את החלון בסביבה אספטית (כמתואר בשלב 5.1) כדי להבהיר עוד יותר, ולמקם מחדש את הרקמה כדי לשפר את הראות ואת רכישת התמונה (איור 3A).
בשיטה זו, בלוטת החלב המתפתחת במהלך גיל ההתבגרות הייתה מלווה ברמת התא הבודד. IVM חוזר באמצעות R.MIW בוצע באמצעות R26-CreERT2het; R26-mTmGנקבת עכברים בין גיל 4-6 שבועות, שבה כל התאים מסומנים עם ממברנה tdTomato (איור 4A)23. לעכברים הוזרק מינון נמוך של טמוקסיפן (0.2 מ"ג/25 גרם משקל גוף), וכתוצאה מכך נוצר רקומבינציה ספורדית של מבנה ה-mTmG, מה שגרם לשינוי מאדום לירוק בחלק מהתאים בכל הרקמות, כולל בלוטת החלב (איור 4B). אותם ROIs נבדקו מחדש במשך מספר ימים כדי לדמיין שינויים מורפולוגיים בתוך בלוטת החלב, כולל התארכות צינורית והסתעפות צינורית (איור 4C) ברזולוציה תאית. חשוב לציין שהשילוב הזה של תיוג תאים סטוכסטיים ו-IVM רב-יומי מאפשר גם לדמיין את השינויים הדינמיים של הסביבה הצינורית, כמו הדינמיקה של תאים בודדים בסטרומה המקיפה את התעלות המוארכות והמסתעפות (איור 4D), כמו גם את הדינמיקה התאית בתוך צומת הלימפה המפשעתית (איור 4E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig04.jpg"> איור 4: IVM רב-יומי של מורפוגנזה מסתעפת של ההתבגרות. (A) Pubertal R26-CreERT2; עכברי R26-mTmG בגילם בין 4-6 שבועות הוזרקו להם מינון נמוך של טמוקסיפן שהוביל לרקומבינציה בתיווך Cre של אלל R26-mTmG והם צולמו בימים 1, 3 ו-5 כדי לעקוב אחר השינויים הדינמיים בהתפתחות בלוטת החלב. (B) ייצוג סכמטי של מבנה העכבר R26-mTmG , אשר בתנאים שאינם רקומבינים גורם לביטוי בכל מקום של ממברנה tdTomato (mT). עם רקומבינציה בתיווך Cre, mT מוחלף לביטוי eGFP (mG) של ממברנה. (C) עיבוד תלת-ממדי של צינור חלב מוארך ומסתעף במשך מספר ימים שצולם דרך R.MIW ב-R26-CreERT2; עכבר נקבת R26-mTmG בגיל 6 שבועות. (D) תמונות במישור Z יחיד של קצה ההסתעפות (לוחות עליונים) והענף המתארך (לוחות תחתונים). mT מתואר באדום, ו- mG בציאן, פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר (A ו- B). תאים בודדים בסטרומה מודגשים על ידי כוכביות לבנות. שים לב שעוצמת האות הוגדלה באופן ידני כדי להדגיש את התאים הבודדים בסטרומה, מה שהוביל למראה מעט מוגזם של תאי האפיתל של החלב. (E) תמונות מייצגות של בלוטת המפשעתים של R26-CreERT2; עכבר נקבה R26-mTmG שצולם באמצעות R.MIW, המציג סריקת אריחי סקירה כללית (פאנל שמאלי), תמונות זום (לוחות ימניים) של מישור Z יחיד (למעלה) ועיבוד תלת-ממדי (למטה). הדור ההרמוני השני (קולגן I) מוצג בירוק, mT באדום ו-mG בציאן. סרגלי קנה מידה מייצגים 500 מיקרומטר (אריחי סקירה) ו- 100 מיקרומטר (תמונות זום). לוחות איורים C ו- D משתנים מ- Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
באופן דומה, בבלוטת החלב הבוגרת, גישת R.MIW המוצעת מאפשרת הדמיה של אותם מבני צינורות במשך מספר ימים עם ראות ללא פשרות. אפילו השימוש במודלים של כתבים פלואורסצנטיים פחות בהירים24, כגון מודל העכבר Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), מאפשר הדמיה של יציבות צינורית ושינויים מורפולוגיים עדינים ברזולוציה תאית (איור 5). שימו לב שהראות בין היום ה-3 ליום ה-5 השתפרה באופן משמעותי לאחר מיקום מחדש של הרקמה (איור 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig05.jpg"> איור 5: הדמיה מרובת ימים של בלוטת החלב הבוגרת. 3D עיבדה תמונות של מבנה תעלת יונקים של נקבה בוגרת Cdh1-mCFP (ציאן, המסמן את ביטוי תאי הלומינל החיוביים לאקדהרין) של עכבר במשך מספר ימים רצופים. תבנית הקולגן I (הדור ההרמוני השני, מגנטה) שימשה כדי לשחזר את אותו ROI, ואות Cdh1-mCFP שימש לסימון התאים הצינוריים (לומינליים). שים לב כי הראות לאחר היום השלישי שופרה על ידי פתיחת מכסה R.MIW ומיקום מחדש של הרקמה. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
כדי להעריך את ההטרוגניות המתפשטת של תאי האפיתל של החלב במהלך המחזור ההורמונלי ברמה החד-תאית, נעשה שימוש במודל העכבר העיתונאי Kikume Green-Red (KikGR) הניתן להמרה,מודל 25,26, שיש לו ביטוי בכל מקום של חלבון KikGR. KikGR הוא פלואורופור בהיר שעובר המרה מירוק לאדום עם חשיפה לאור סגול, והיחס בין אדום לירוק יכול לשמש כמתווך לפעילות ההתפשטות של תא2 (איור 6A,B). באמצעות גישת R.MIW, עקבנו אחר אותם תאים בתוך העץ הצינורי של בלוטת החלב הבוגרת במשך מספר ימים ומצאנו הטרוגניות התפשטות בלתי צפויה בעבר בכל עץ הצינור (איור 6C). תאים שגשוג גבוהים ונמוכים חולקו באופן שווה על פני האזורים המומרים השונים (איור 6C,D). באופן מדהים, ברמה המקומית, תאים שכנים הראו הבדלים גדולים ביחס האדום/ירוק שלהם (איור 6C,D). כימות היחס בין אדום לירוק של תאים שונים (כמיופה כוח לפעילות ההתפשטות שלהם) 10 ימים לאחר המרת תמונות, חשף שיעורי דילול משתנים מאוד של תאים מסוימים באותה סביבת מיקרו-צינור (איור 6E). יחד, נתונים אלה חושפים הטרוגניות התפשטות מקומית יוצאת דופן בתוך בלוטת החלב הבוגרת, ובמקביל, שיעור תחלופה אחיד עולמי.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig06.jpg"> איור 6: IVM אורכי של הטרוגניות מתפשטת בבלוטת החלב הבוגרת באמצעות מודל העכבר KikGR. (A) עכברי KikGR צולמו ביום 0 לפני ואחרי החשיפה לאור סגול. מפגשי ההדמיה חזרו על עצמם בימים 2, 6 ו-10 לאחר ההמרה. (B) תיאור סכמטי של התוצאות ההיפותטיות עם המרת תמונה של תאי אפיתל החלב KikGR בעקבות התפשטות (לוח שמאלי) וללא התפשטות (לוח ימני) כפונקציה של זמן. (C) אותו אזור של בלוטת החלב צולם דרך R.MIW במשך תקופה של 10 ימים. אזורים קטנים יותר הומרו באופן מצולם ביום 0 והראו קצב דילול דומה של האות האדום של קיקומה לאורך זמן, מה שמעיד על קצב תחלופה שווה בכל האפיתל. (D) תמונות זום (מישורי Z בודדים) של האזורים המצוינים בלוח C מראות הטרוגניות מתפשטת ברמה התאית 6 ו-10 ימים לאחר המרת תמונות. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר (לוח C) ו- 10 מיקרומטר (לוח D). (E) כימות היחס בין אדום לירוק של תאים שנבחרו באקראי (n = 48 תאים) בשלושה אזורים שהומרו באופן מצולם. יחס גבוה בין אדום לירוק מעיד על קצב דילול נמוך ופעילות שגשוג נמוכה, בעוד שיחס נמוך בין אדום לירוק מעיד על קצב דילול והתפשטות גבוהים. לוחות איורים C- E שונו מ- Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid at JoVE.com

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

פרוטוקול זה מתאר חלון הדמיה חדש של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW). מיקרוסקופיה תוך-ורידית לאחר השתלת ה-R.MIW מאפשרת הדמיה אורכית ורב-יומית של בלוטת החלב הבריאה והחולה עם רזולוציה תאית בשלבי ההתפתחות השונים.

מיקרוסקופיה תוך-ורידית אורכית באמצעות חלון הדמיה של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

בלוטת החלב היא דינמית מאוד ועוברת סבבים מרובים של שיפוץ במהלך החיים. הפרוטוקול שלנו מאפשר ללכוד את הדינמיקה התאית המניעה סידור מחדש של רקמות בבלוטת החלב הבריאה והחולה. חלון הדמיית החלב שלנו עם מכסה הניתן להחלפה מאפשר לבצע הדמיה תוך-ורידית אורכית של בלוטת החלב לאורך תקופות זמן ארוכות, עד מספר שבועות.המכסה הניתן להחלפה של חלון ההדמיה של החלב מבטיח תנאי הדמיה אופטימליים בכל עת ומאפשר מניפולציה של רקמות או מתן תרופות בין מפגשי הדמיה. השיטה שלנו לא רק מספקת תובנות על ביולוגיה בריאה של בלוטת החלב, אלא גם מאפשרת לנו לחקור את התחלת גידולי החלב וההתקדמות שלהם ברמת התא הבודד. התחילו בהנחת המכסה של חלון הדמיון של היונק על משטח סטרילי והחלת דבק דבק ציאנואקרילט סביב כל היקף מכסה החישוק.יש להניח בזהירות כיסוי זכוכית עגול בקוטר 10 מילימטרים על גבי המכסה. השתמשו במקל עץ סטרילי כדי למקם את החלקת כיסוי הזכוכית ולהפעיל כוח מסוים כדי לדחוף אותה כלפי מטה כדי להבטיח אטימה אטומה בין החלקת כיסוי הזכוכית למסגרת המכסה. וודאו שהזכוכית אינה מכסה את החורים בזרועות המכסה.יש לחטא את המכסים ואת חלון ההדמיה של החלב על ידי טבילתם ב-80% אתנול למשך 30 דקות לפחות בצלחת פטרי סגורה. השתמשו בקצה כותנה ספוג באצטון כדי להסיר את עודפי הדבק של הציאנואקרילט על החלקת כיסוי הזכוכית. כדי להכין את העכבר לניתוח, גילחו את האזור סביב בלוטת החלב הרביעית באמצעות סכין גילוח.השתמשו בפטמה הרביעית כנקודת ציון והסירו את השערות הרפויות באמצעות סרט דביק. בצע בדיקת משיכת כפות כדי לוודא אם בעל החיים מורדם כראוי. הרימו בעדינות את העור באמצעות מלקחיים עדינים של Graefe והשתמשו במספריים קפיציים קטנים כדי לבצע חתך אלכסוני של 10 עד 15 מילימטרים בעור על גבי כרית השומן של החלב הרביעי השתמש בפטמה הרביעית כנקודת כיוון והקפיד לא לחתוך או לפגוע בצפק או בבלוטת החלב.הפרד את העור מכרית השומן של החלב ומשכבות הרקמה שמתחתיו באמצעות כריתה קהה של עד חמישה עד שמונה מילימטרים סביב קו החתך כדי ליצור כיס שיתאים למסגרת החלון הדמיה של החלב. הגדר את אזור העניין, או ROI, בהתבסס על התכונות המקרוסקופיות של רקמת החלב, כולל מיקום בלוטת הלימפה או נגע הגידול. נסו לשמור על ה-ROI במרכז בכל הנוגע לחתך.הרימו את חלון ההדמיה של החלב באמצעות מלקחיים סטריליים ובדקו אם החתך גדול מספיק כדי להכניס את החלון. במידת הצורך, הגדל מעט את החתך עד שחלון הדמיה של היונק יתאים. הסר את החלון והשתמש בתפר משי 5-0 כדי להניח תפר מיתר ארנק במרחק של 1-2 מילימטרים מקצה החתך החל מהקצה הקאודלי ומבחוץ אל פנים העור.נעים כחמישה מילימטרים למעלה לאורך החתך ומעבירים את חוט התפר דרך העור מבפנים לחוץ. חזור על הליך זה לאורך קצה החתך, ובכך צור תפר מעגלי המורכב מחמש עד שש לולאות. היציאה הסופית של חוט התפר צריכה להיות ממוקמת במרחק של כשני עד חמישה מילימטרים מהכניסה הראשונה.התאימו את חלון הדמיון של היונק בתוך החתך והשתמשו במלקחיים של Graefe כדי למקם בזהירות את העור בחריץ החלון. הקפידו להשאיר את הלולאות של התפר בחוץ. משוך את הלולאות של תפר חוט הארנק ומושך בעדינות את שני קצות התפר כדי להדק אותו בחריץ של חלון הדמיה של החלב.קשרו קשרים כירורגיים וחתכו את החוט העודף. השתמש בקיסם כדי למרוח ג'לי נפט על השפה הפנימית של החלון, תוך הימנעות מהרקמה שמתחת. דחפו בעדינות את מסגרת החלון כלפי מטה עם מלקחיים סטריליים והניחו את המכסה לתוך מסגרת החלון.זה ימנע נפח של אוויר בין רקמת בלוטת החלב לבין מכסה החלון הדמיה של החלב. מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך החורים בזרועות המכסה ומהדקים את המכסה על ידי סיבובו בכיוון השעון. אם נשאר קצת אוויר לאחר הידוק המכסה, מכניסים מחט אינסולין סטרילית דרך העור לתוך החלל שבין רקמת החלב למכסה ולאט לאט שולפים את הבוכנה, ובכך יוצרים ואקום בין רקמת בלוטת החלב למכסה החלון הדמיה של החלב.עכשיו את בלוטת הלימפה ניתן לראות בקלות לאחר הליך זה. בדוק את מצב מסגרת החלון הדמיה של החלב ואת המכסה, כולל יציבות התפרים או כל נזק פוטנציאלי למכסה. מקם את העכבר על השיבוץ באופן כזה שחלון הדמיית החלב נופל בחור של שיבוץ תיבת ההדמיה.יש למרוח סרט שקוף למחצה ונייר דבק על גב העכבר כדי לייצב את העכבר ולהפחית את תנועת הרקמה עקב הנשימה. עבור מפגשי הדמיה הגדולים משלוש שעות, הניחו מחט גמישה באופן תת עורי בצוואר העכבר ואבטחו אותה באמצעות נייר דבק. חברו מזרק של 10 מילימטרים עם תערובת חומרים מזינים לצינור סיליקון גמיש ודחפו את תערובת החומרים המזינים עד שהיא מגיעה לקצה הצינור.חברו את צינור הסיליקון למחט הגמישה והזיקו 50 מיקרוליטרים של התמיסה החדורה כל 30 דקות. הניחו את המכסה מעל תיבת ההדמיה כדי לסגור אותה. לאחר מכן, אבטח את תיבת ההדמיה בשלב המיקרוסקופ.ודא שהעכבר יציב בתוך תיבת ההדמיה. הגדר את אזור העניין באמצעות מצב האפיפלואורסצנציה של המיקרוסקופ ויישם את הגדרות המיקרוסקופ. השתמש בפונקציה ספירלה במצב נווט תוכנת ההדמיה כדי ליצור סריקת אריחי סקירה גדולה וליצור מפת ייחוס של הרקמה.הגדר את אזור תחומי העניין בתוך הסקירה הספירלית ולאחר מכן הגדר את מישורי Z העליונים והתחתונים כדי לקבוע את מחסנית Z. לחץ על התחל כדי לקבל את ערימות Z התלת-ממדיות או הארבע-ממדיות המפורטות של הרקמה. מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך חורי החלון המדמיינים של החלב בזרועות המכסה ומשחררים את המכסה על ידי פיתול נגד כיוון השעון.לחלופין, ניתן לתמרן את הרקמה או למקם אותה מחדש באמצעות מלקחיים קהים סטריליים כדי לייעל את תנאי ההדמיה לאזור העניין הספציפי. מרחו ג'לי נפט על השפה הפנימית של חלון הדמיה של החלב, תוך הימנעות מהרקמה שמתחת. דחפו בעדינות את מסגרת החלון כלפי מטה עם מלקחיים סטריליים והניחו את המכסה לתוך מסגרת החלון.לבסוף, מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך חורי זרועות המכסה ומבהירים את המכסה על ידי סיבובו בכיוון השעון. לעכברי GFP ממברנת עגבניות-ממברנה Rosa26-Pubertal Rosa26 הוזרקה מינון נמוך של טמוקסיפן, מה שהוביל לרקומבינציה בתיווך Cre של אלל GFP של ממברנת עגבניות-ממברנה Rosa26. העכברים צולמו בימים הראשון, השלישי והחמישי כדי לעקוב אחר השינויים הדינמיים בבלוטת החלב המתפתחת.התמונות הייצוגיות מציגות את העיבוד התלת-ממדי של צינור חלב מוארך ומסתעף במשך מספר ימים שצולמו דרך חלון הדמיה של יונקים. תמונות מישור Z בודדות של קצה ההסתעפות והענף המאריך מוצגות כאן. תאים בודדים בסטרומה מודגשים על ידי כוכביות לבנות.התמונות המייצגות מראות את בלוטת הלימפה המפשעתית של העכבר המצולמת דרך חלון הדמיה של יונקים. הדור ההרמוני השני מתואר בירוק. תמונות מעובדות בתלת-ממד של מבנה תעלת החלב של נקבת עכבר CFP של קרום E-cadherin בוגר במשך מספר ימים רצופים מוצגות כאן.תבנית הקולגן I שימשה כדי לשחזר את אותו ROI ואות CFP של קרום E-cadherin שימש לסימון תאי הצינור. עכברים ירוקים-אדומים של Kikume צולמו ביום אפס לפני ואחרי החשיפה לאור סגול. מפגשי ההדמיה חזרו על עצמם בימים 2, 6 ו-10 לאחר ההמרה.אותו אזור של בלוטת החלב צולם דרך חלון הדמיה של יונקים במשך 10 ימים. אזורים קטנים יותר הומרו באופן מצולם ביום אפס והראו קצב דילול דומה של האות האדום של קיקומה לאורך זמן, מה שמעיד על קצב תחלופה שווה בכל האפיתל. תמונות זום של האזורים המצוינים מראות הטרוגניות מתפשטת ברמה התאית שישה ועשרה ימים לאחר המרת תמונות.כימות היחס בין אדום לירוק של תאים שונים 10 ימים לאחר המרת תמונה חשף שיעורי דילול משתנים מאוד של תאים מסוימים בתוך אותה מיקרו-סביבה של צינורות. שלב מכריע בהליך זה הוא פתיחת המכסה בין מפגשי ההדמיה. תכונה ייחודית זו של החלון משפרת את תנאי ההדמיה ומאפשרת הדמיה אורכית של הרקמה.חלון ההדמיה של החלב עם מכסה הניתן להחלפה יאפשר שאלות חדשות לגבי in vivo, בדיקות תרופות מהירות והקרנה בתחום התחלת הגידול וההתקדמות בבלוטת החלב של העכבר.

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

שיטה הדמיה 2-פוטון של זרימת הדם הניאוקורטקס דרך חלון גולגולתי

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Dendra2 Photoswitching דרך החלון דימות השד

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

החלב להשתלות אפיתל נוהל

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

גמיש מדידה של כתבים זוהרים באמצעות לוציפראז האורך אוטומטית של הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...