Name: longitudinal intravital microscopy using a mammary imaging window with replaceable lid
Uploaded: 2022-01-20T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Research Foundation Flanders (PhD grant fundamental research 11L7222N to M.C.), a Boehringer Ingelheim Foundation (PhD Fellowship to C.L.G.J.S), uma bolsa de pós-doutorado da EMBO (conceder ALTF 1035-2020 à C.L.G.J.S.), e o Prêmio Doctor Stein Josefer (para J.V.R.).

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D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Crypt+Homeostasis+Results+from+Neutral+Competition+between+Symmetrically+Dividing+Lgr5+Stem+Cells.">Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li><li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+physiological+motion+from+Intravital+and+clinical+functional+imaging+data.">Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data.</a> eLife. 7, 35800 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar

O R.MIW permite imagens longitudinais da glândula mamária saudável e doente em seu ambiente nativo e minimamente interrompido e permite a visualização repetida da glândula mamária em diversos estágios de desenvolvimento. O design R.MIW permite que a janela seja aberta a qualquer momento durante o experimento. O acesso visual a longo prazo ao tecido de interesse pode ser dificultado, por exemplo, pelo acúmulo de detritos celulares na mancha de cobertura. Nesses casos, o R.MIW pode ser aberto antes ou imediatamente após uma sessão de imagem para permitir a limpeza de toda a área e tampa do tecido visível. A tampa removível também permite manipulações do tecido, bem como a aplicação local de substâncias, como inibidores e terapias específicas, corantes de rotulagem ou tipos de interesse celular específicos.
Este método supera a limitação dos procedimentos de inflamação mamária descritos anteriormente 4,7,8,13, que estão limitados a uma sessão de imagem, e podem visualizar processos como morfognese ramificada (Figura 5), rotatividade de tecido homeostático (Figura 6) ou crescimento tumoral a nível celular (Figura 3B ). No entanto, ao mesmo tempo, o R.MIW permite a manipulação local do tecido entre as sessões de imagem, que compreende um grande ativo do R.MIW em comparação com o MIW 3,18 publicado anteriormente e todas as outras janelasde imagem 20,22. Ao abrir o R.MIW, é importante manter as condições assépticas o tempo todo para evitar qualquer fonte de infecção. A capacidade de abrir o R.MIW em um ambiente asséptico permite otimizar as condições de imagem antes de cada sessão de imagem, o que melhora muito o acesso visual a longo prazo ao tecido de interesse. Especificamente, na glândula mamária, que está embutida em um estroma rico em adipócito, isso é de grande valor. Além disso, a tampa substituível poderia permitir exclusivamente a administração local de terapêutica, diferentes tipos de células, corantes de rotulagem, microdissecção guiada por imagem ou qualquer outra manipulação local do tecido sem a necessidade de encerrar o experimento IVM. Por exemplo, para estudar a iniciação tumoral, populações específicas de células cancerígenas poderiam ser injetadas diretamente na árvore ductal ou estroma em um determinado ponto de tempo ivm e localização precisa da glândula mamária, desde que este ROI seja acessível através do anel R.MIW. Para estudar a progressão do tumor, populações específicas de células cancerígenas (em um local específico, em um microambiente específico ou com um comportamento específico) poderiam ser foto-marcadas durante a sessão de IVM e, posteriormente, microdissectadas usando um microscópio de dissecção fluorescente após a abertura do R.MIW. Células isoladas podem ser processadas para análises a jusante, como o sequenciamento mRNA (unicelular). Usando essa abordagem, pode-se acoplar o comportamento celular in vivo a perfis de expressão molecular. A vantagem da administração de medicamentos local habilitada pelo R.MIW permite que o tecido seja imageado antes e diretamente após o tratamento. O intervalo necessário para remover o mouse da caixa de imagem e para posteriormente realizar a administração local de medicamentos após a abertura da tampa R.MIW pode ser realizado em minutos, o que permite a captura de fase imediata de drogas de ação rápida.
Mostramos que o IVM da glândula mamária através do R.MIW é compatível com muitos modelos diferentes de mouse de repórter fluorescente. O ambiente rico em adiposos é desafiador para a imagem e, portanto, recomenda-se o uso de fluoroforos brilhantes. No entanto, como mostrado aqui, fluoroforos ainda menos brilhantes como o mCFP podem ser visualizados através do R.MIW em condições ideais de imagem. Inevitavelmente, a almofada de gordura impedirá a imagem das estruturas ductais mais profundas, e limitará a imagem aos dutos mais superficiais. Uma imagem de visão geral de baixa resolução no início de cada experimento IVM ajudará a identificar as estruturas ductais de interesse que são suficientemente superficiais para imagens de alta resolução. Manipulação de tecido local, remoção de tecido conjuntivo ou reposicionamento do tecido adiposo após a abertura do R.MIW podem otimizar o IVM para ROIs específicos que são sobrepostos por tecido adiposo. Esta é uma vantagem importante sobre todos os projetos de janelas anteriores, que não permitem realizar essas manipulações e exigiriam a remoção completa da própria janela. Especificamente, para visualização do linfonodo inguinal, recomenda-se remover suavemente o tecido gorduroso sobredisco, o que reduz a dispersão da luz e permite imagens de alta resolução. Ao manipular o tecido, mantenha sempre as condições assépticas e evite sangramentos ou danos graves ao tecido, pois podem afetar os processos que estão sendo estudados durante o experimento IVM.
O R.MIW é feito de titânio, um material que é comumente usado na prática clínica para substituir tecidos duros, como articulações ou placas ósseas. O titânio tem várias vantagens sobre janelas de aço, incluindo seu personagem leve e inerte21. Recentemente, vários outros materiais foram usados para gerar novos tipos de janelas de imagem, incluindo a janela de silício flexível20. Em contraste com o R.MIW, a janela flexível não requer suturas para implantação e é adequada para quase qualquer posição anatômica, especificamente no caso de tecidos moles e frágeis. As janelas de silício têm um impacto mínimo na motilidade animal devido à sua natureza leve e deformável e talvez mais adequada em experimentos que estudam a rápida expansão e crescimentode tecidos 20. Outra vantagem sobre a versão de titânio é que as janelas de silício são compatíveis com outras modalidades de imagem, incluindo ressonância magnética20,27. No entanto, será importante ter em mente que os objetivos são otimizados para tampas de vidro de 0,17 mm. Além disso, o tecido mamário é suscetível a movimentos respiratórios, que são difíceis de restringir usando a janela flexível, especialmente quando se usa um microscópio invertido. Os artefatos respiratórios são minimizados pelo design R.MIW e pela fixação do R.MIW na entrada da caixa de imagem. Como resultado, as imagens adquiridas usando a configuração R.MIW proposta não são distorcidas devido a artefatos respiratórios. No entanto, podem ocorrer pequenas derivas na localização tecidual, que geralmente são graduais e podem ser corrigidas usando o software de correção de movimento pós-aquisição28. Com o aumento da caixa de ferramentas das tecnologias IVM 2,20, os requisitos específicos para cada experimento eventualmente determinarão a melhor forma de visualização in vivo do tecido de interesse. Diferentes projetos de janelas têm diferentes vantagens e desvantagens e, dependendo da questão da pesquisa, da configuração disponível de microscopia, da resolução espacial e temporal necessária, e do tempo total do processo estudado, a abordagem ideal precisa ser determinada.
Em resumo, o R.MIW facilita a caracterização de alta resolução da dinâmica celular durante o desenvolvimento da glândula mamária, homeostase e doenças durante vários dias a semanas.

O epitélio mamário é um órgão secreto único presente nos mamíferos, que produz e secreta o leite para nutrir a prole. Ao longo da vida, a glândula mamária passa por múltiplas rodadas de desenvolvimento e crescimento, que são acompanhadas de alterações estruturais e funcionais do tecido1. Dependendo do estágio de desenvolvimento, os tipos de células que contribuem para a remodelação do tecido são diferentes, assim como a localização dentro da árvore ductal.
A microscopia intravital multifotrina (IVM) permite o estudo da dinâmica celular mamária in vivo no cenário nativo e minimamente perturbado 2,3,4. Para obter acesso visual à glândula mamária, várias técnicas temporárias de imagem ex vivo ou retalho de pele foram publicadas durante diferentes estágios de desenvolvimento da glândula mamária, incluindo puberdade 4,5,6,7, idade adulta 2,8, lactação 9,10,11,12, e dinâmica tumoral 13,14 15. Embora essas técnicas resultem em imagens altas e temporalmente resolvidas da dinâmica das células mamárias, o período de tempo é limitado a horas, enquanto a maioria dos processos de remodelação da glândula mamária leva dias a semanas. Portanto, são necessários métodos que permitam o acesso óptico ao tecido de interesse por prazos prolongados. Ao longo dos anos, várias janelas permanentes de imagem foram desenvolvidas para imagens de tumores mamários 15,16,17,18, incluindo uma janela de imagem mamária de titânio (MIW)2,3,19. Embora muito útil para estudar o crescimento do tumor mamário, a visualização da estrutura saudável da glândula mamária permaneceu limitada a alguns dias. Recentemente, foi desenvolvida uma janela flexível de imagem de silício, que permite a visualização da glândula mamária pubertal ao longo de várias semanas20. No entanto, a glândula mamária está embutida em uma almofada de gordura rica em adipócitos, o que leva a uma extensa dispersão de luz e, como resultado, visibilidade limitada das estruturas ductais mamárias. Portanto, condições de imagem superiores são necessárias em todos os momentos para visualizar a dinâmica tecidual durante períodos prolongados de tempo na glândula mamária. Nem o MIW clássico, nem a janela flexível de silício permitem a manipulação tecidual ou a otimização da localização do tecido físico antes da imagem, já que a janela forma um sistema fechado após a cirurgia e implantação. Como resultado, o acesso óptico ideal ao tecido mamário subjacente provavelmente ficará impedido por períodos de tempo mais longos. Em contraste, a técnica de retalho da pele permite a otimização e o reposicionamento do tecido durante a sessão de imagem e uma aba de pele pode ser repetida várias vezes2. No entanto, sessões repetidas de imagem através de um retalho de pele só são possíveis quando tempo suficiente (pelo menos 7 dias) é alocado entre cirurgias para permitir a recuperação da pele e, portanto, é mais adequado para estudar processos em escalas de tempo mais longas. Além disso, é aconselhável não realizar esse procedimento muitas vezes devido à sua natureza invasiva e grande risco de infecções e cicatrizes após o fechamento da ferida.
Para superar essas limitações, ou seja, para garantir condições de imagem ideais por um período prolongado de tempo em alta frequência e, ao mesmo tempo, permitir a manipulação tecidual, uma versão melhorada de titânio do MIW com uma tampa substituível (R.MIW) foi projetada para visualizar a glândula mamária saudável e doente ao longo de vários dias até a semana2 (Figura 1A, B) O R.MIW foi projetado para fornecer acesso ideal ao tecido, permitindo manipulação direta de tecidos durante toda a duração do experimento IVM, e assim permite a visualização da glândula mamária no momento e local certos durante períodos prolongados de tempo. Quando fechado, o R.MIW forma um sistema hermético comparável ao MIW clássico (Figura 1C). Quando aberto sob condições assépticas, o R.MIW permite que a manipulação de tecidos locais melhore o acesso óptico e também permite a administração local de substâncias, como inibidores de vias ou agonistas, injeção de diferentes tipos de interesse celular, como células cancerosas ou populações de células imunes, ou adição de corantes de rotulagem tecidual. A tampa pode ser aberta a qualquer momento entre as sessões de imagem sem causar danos ao tecido subjacente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig01.jpg"> Figura 1: Design da janela de imagem mamária com uma tampa substituível. (A) Vista superior e lateral da tampa substituível da janela de imagem mamária com um vidro de cobertura de 10 mm colado ao anel. (B) Vista superior e lateral da janela de imagem mamária, que consiste em um anel externo e anel interno com uma ranhura no meio para fixar a janela dentro da pele do mouse usando uma sutura de corda de bolsa. O anel externo tem uma pequena ranhura que se encaixa nas quatro projeções (braços) da tampa. (C) Desenho animado e imagens demonstrando os mecanismos de abertura e fechamento da tampa. As projeções inclinadas garantem que a tampa esteja fixa dentro da moldura da janela. Esta figura foi modificada a partir de Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig01large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Este protocolo descreve o procedimento de design e implantação do R.MIW, bem como uma estratégia longitudinal de IVM para revisitar os mesmos dutos mamários e sua visualização em uma resolução celular. O R.MIW permite seguir divisões celulares e alterações morfológicas durante diferentes fases de desenvolvimento da glândula mamária em diversos modelos de ratos repórteres fluorescentes. Em conjunto, o R.MIW facilita a caracterização de alta resolução da dinâmica celular durante o desenvolvimento da glândula mamária, homeostase e doenças.

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		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td>BD</td>
			<td>306573</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
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			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10696365</td>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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			<td>13113743</td>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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			<td>BD</td>
			<td>324911</td>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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			<td>VetFlo-1231K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td>Fine Science Tools</td>
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		</tr>
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			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>semi-transparent tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape tesa</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Vaseline</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11904325</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>Solutions Elastomeres</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any houseware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (10 ml)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lid for mammary imaging window</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium mammary imaging window</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden sticks toothpicks</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC1678836</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital microscopy using a mammary imaging window with replaceable lid

A estrutura ramificada da glândula mamária é altamente dinâmica e passa por várias fases de crescimento e remodelação após o nascimento. A microscopia intravital em combinação com a cirurgia de retalhos da pele ou implantação de janelas de imagem tem sido usada para estudar a dinâmica da glândula mamária saudável em diferentes estágios de desenvolvimento. A maioria das tecnologias de imagem mamária são limitadas a um período de horas a dias, enquanto a maioria dos processos de remodelação da glândula mamária ocorrem em períodos de dias a semanas. Para estudar a remodelagem da glândula mamária, são necessários métodos que permitam o acesso óptico ao tecido de interesse por prazos prolongados. Aqui, uma versão melhorada da janela de imagem mamária de titânio com uma tampa substituível (R.MIW) é descrita que permite imagens de alta resolução da glândula mamária com resolução celular por até várias semanas. É importante ressaltar que o R.MIW fornece acesso a tecidos durante toda a duração do experimento de imagem intravital e, portanto, pode ser usado para manipulação de tecidos locais, rotulagem, administração de medicamentos ou microdissecção guiada por imagem. Em conjunto, o R.MIW permite a caracterização de alta resolução da dinâmica celular durante o desenvolvimento da glândula mamária, homeostase e doenças.

Para estudar a dinâmica proliferativa das células epiteliais mamárias durante os diferentes estágios de desenvolvimento da glândula mamária foi realizado o protocolo descrito. O design do R.MIW é retratado na Figura 1, e o procedimento para implantar um R.MIW é resumido na Figura 2. O R.MIW é implantado cirurgicamente entre a glândula mamária e a pele. Uma sutura é usada para segurar dentro do anel da janela e evitar que os ratos puxem as suturas (Figura 2). As suturas que seguram o R.MIW são feitas de seda não absorvível, que tem propriedades hipoalergênicas, uma textura macia, e é fácil de manusear. O anel R.MIW é feito de titânio, um dos materiais mais biocompatíveis que não promovem inflamação ou necrose após a implantação21. Se as condições assépticas forem seguidas e as suturas forem bem executadas, a implantação da glândula mamária R.MIW representa um baixo risco de complicações pós-operatórias. Além disso, ao contrário da implantação da janela de imagem abdominal22, a implantação de R.MIW não é um fator limitante para a sobrevivência do camundongo, pois a glândula mamária não é um órgão vital e permite imagens diárias até o limite especificado no protocolo ético. O único fator que limita a duração da implantação da janela é o giro homeostático da pele, o que eventualmente levará as suturas a cair após 4 - 6 semanas. Por isso, é importante inspecionar regularmente a estabilidade das suturas. Se desejar, as suturas podem ser removidas e substituídas por uma nova sutura de corda de bolsa em condições assépticas (conforme descrito nas etapas 3.5 - 3.8) para tranquilizar a estabilidade da janela.
Um grande desafio ao usar a abordagem de imagem de vários dias é refazer um ROI em dias consecutivos. Para isso, uma varredura rápida de visão geral pode ser incluída antes de selecionar o ROI(s) (Figura 3B). Múltiplos marcos teciduais podem ser usados para refazer a mesma região do tecido, incluindo o sinal de rede de colágeno (visualizado pela segunda geração harmônica), estrutura tecidual, bem como padrões locais de células de forma diferencial ou estochasticamente rotulada com corantes ou proteínas fluorescentes (Figura 3B). Neste exemplo representativo, um R.MIW foi implantado na 4ª glândula mamária de um MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-Confettihet camundongo fêmea no início da formação de tumor palpável. Posteriormente, a recombinação estocástica foi induzida pela injeção de 1,5 mg de tamoxifeno, resultando em recombinação da construção de Confete em algumas células (Figura 3C). As células tumorais recombinadas foram acompanhadas por um período de 20 dias (Figura 3B,C). Se a imagem da mesma região da glândula mamária durante dias consecutivos for impedida, a janela pode ser aberta em um ambiente asséptico (como descrito na etapa 5.1) para clarear ainda mais, e reposicionar o tecido para melhorar a visibilidade e a aquisição de imagens (Figura 3A).
Utilizando este método, a glândula mamária em desenvolvimento durante a puberdade foi seguida no nível de célula única. O IVM repetido através de um R.MIW foi realizado usando het R26-CreERT2; Camundongos fêmeas dehet 100 r26-mTmG entre 4 e 6 semanas de idade, em que todas as células são rotuladas com tdTomato de membrana (Figura 4A)23. Os camundongos foram injetados com uma baixa dose de tamoxifen (0,2 mg/25 g de peso corporal), resultando em recombinação esporádica da construção mTmG, causando uma mudança de vermelho para verde em algumas células em todos os tecidos, incluindo a glândula mamária (Figura 4B). Os mesmos ROIs foram revisitados ao longo de vários dias para visualizar alterações morfológicas dentro da glândula mamária, incluindo alongamento ductal e ramificação ductal (Figura 4C) em resolução celular. É importante ressaltar que essa combinação de rotulagem celular estocástica e IVM de vários dias também permite visualizar as mudanças dinâmicas do ambiente ductal, como a dinâmica das células únicas no estroma ao redor dos dutos de alongamento e ramificação (Figura 4D), bem como a dinâmica celular dentro do linfonodo inguinal (Figura 4E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig04.jpg"> Figura 4: IVM de vários dias de morfogênese de ramificação pubertal. (A) Pubertal R26-CreERT2; Camundongos R26-mTmG com idade entre 4-6 semanas foram injetados com uma baixa dose de tamoxifeno levando à recombinação mediada por Cre do alelo R26-mTmG e foram imagens nos dias 1, 3 e 5 para acompanhar as mudanças dinâmicas no desenvolvimento da glândula mamária. (B) Representação esquemática da construção do mouse R26-mTmG , que em condições não recombinadas resulta em expressão onipresente de membrana tdTomato (mT). Após a recombinação mediada por Cre, mT é alternada para expressão de membrana eGFP (mG). (C) renderização 3D de um duto mamário alongado e ramificado ao longo de vários dias, imagens através de um R.MIW em um R26-CreERT2; R26-mTmG rato fêmea com 6 semanas de idade. (D) Imagens de plano Z único da ponta de ramificação (painéis superiores) e do ramo alongamento (painéis inferiores). mT é retratado em vermelho, e mG em ciano, barras de escala representam 100 μm (A e B). Células únicas no estroma são destacadas por asteriscos brancos. Note que a intensidade do sinal foi aumentada manualmente para destacar as células únicas no estroma, levando a uma aparência ligeiramente superexposta das células epiteliais mamárias. (E) Imagens representativas do linfonodo inguinal de um R26-CreERT2; O mouse feminino R26-mTmG é imageado através de um R.MIW, mostrando uma varredura de ladrilhos (painel esquerdo), imagens de zoom (painéis direito) de um único plano Z (superior) e uma renderização 3D (inferior). A segunda geração harmônica (colágeno I) é mostrada em verde, mT em vermelho e mG em ciano. As barras de escala representam 500 μm (inclinação geral) e 100 μm (imagens de zoom). Os painéis de figura C e D são modificados a partir de Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Da mesma forma, na glândula mamária adulta, a abordagem R.MIW proposta permite a visualização das mesmas estruturas ductais ao longo de vários dias com visibilidade descomprometida. Mesmo o uso de modelos de repórter fluorescentes menos brilhantes24, como o modelo de mouse Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), permite a visualização da estabilidade ductal e alterações morfológicas sutis em uma resolução celular (Figura 5). Note que a visibilidade entre o dia 3 e o dia 5 melhorou significativamente após o reposicionamento tecidual (Figura 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig05.jpg"> Figura 5: Imagens de vários dias da glândula mamária adulta. 3D renderizadas imagens de uma estrutura ductal mamária de uma fêmea adulta Cdh1-mCFP (ciano, marcando a expressão de células luminais positivas de Ecadherin) durante vários dias consecutivos. O padrão de colágeno I (segunda geração harmônica, magenta) foi usado para refazer o mesmo ROI, e o sinal Cdh1-mCFP foi usado para marcar as células ductais (luminais). Note que a visibilidade após o terceiro dia foi melhorada pela abertura da tampa R.MIW e reposicionamento do tecido. As barras de escala representam 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para avaliar a heterogeneidade proliferativa das células epiteliais mamárias durante o ciclo hormonal no nível unicelular, utilizou-se o modelo de rato kikume green-vermelho (KikGR)foto-conversível (KikGR), que tem expressão onipresente da proteína KikGR. KikGR é um fluoróforo brilhante que sofre conversão verde-vermelho após exposição à luz violeta e a razão vermelho/verde pode ser usada como proxy para a atividade proliferativa de uma célula2 (Figura 6A,B). Usando a abordagem R.MIW, seguimos as mesmas células dentro da árvore ductal da glândula mamária adulta ao longo de vários dias e encontramos heterogeneidade proliferativa anteriormente inesperada em toda a árvore ductal (Figura 6C). Células proliferativas altas e baixas foram igualmente distribuídas sobre as diferentes áreas convertidas (Figura 6C,D). Surpreendentemente, no nível local, as células vizinhas apresentaram grandes diferenças em sua relação vermelho/verde (Figura 6C,D). Quantificação da razão vermelho/verde de diferentes células (como proxy para sua atividade proliferativa) 10 dias após a foto-conversão, revelou taxas de diluição altamente variáveis de algumas células dentro do mesmo microambixe ductal (Figura 6E). Juntos, esses dados revelam uma notável heterogeneidade local proliferativa dentro da glândula mamária adulta e, ao mesmo tempo, uma taxa de rotatividade uniforme global.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig06.jpg"> Figura 6: IVM longitudinal de heterogeneidade proliferativa na glândula mamária adulta usando o modelo de rato KikGR. (A) Os camundongos KikGR foram imageados no dia 0 antes e depois da exposição à luz violeta. As sessões de imagem foram repetidas nos dias 2, 6 e 10 após a conversão. (B) Representação esquemática dos desfechos hipotéticos após a foto-conversão de células epiteliais mamárias KikGR após a proliferação (painel esquerdo) e nenhuma proliferação (painel direito) em função do tempo. (C) A mesma área da glândula mamária foi imagens através de um R.MIW durante um período de 10 dias. Regiões menores foram foto-convertidas no dia 0 e mostram uma taxa de diluição semelhante do sinal vermelho Kikume ao longo do tempo, indicando uma taxa de rotatividade igual em todo o epitélio. (D) Imagens de zoom (monomotores únicos) das regiões indicadas no painel C mostram heterogeneidade proliferativa no nível celular 6 e 10 dias após a conversão de fotos. As barras de escala representam 100 μm (painel C) e 10 μm (painel D). (E) Quantificação da razão vermelho/verde de células selecionadas aleatoriamente (n = 48 células) em três áreas foto-convertidas. Uma alta relação vermelho/verde é indicativa de baixa taxa de diluição e atividade de baixa proliferação, enquanto uma baixa relação vermelho/verde é indicativo de uma alta taxa de diluição e proliferação. Os painéis de figuras C-E foram modificados de Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

Este protocolo descreve uma nova janela de imagem mamária com uma tampa substituível (R.MIW). A microscopia intravital após a implantação do R.MIW permite imagens longitudinais e de vários dias da glândula mamária saudável e doente com resolução celular durante os diferentes estágios de desenvolvimento.

Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

A glândula mamária é altamente dinâmica e passa por várias rodadas de remodelação ao longo da vida. Nosso protocolo permite capturar a dinâmica celular que conduz rearranjos teciduais na glândula mamária saudável e doente. Nossa janela de imagem mamária com uma tampa substituível permite realizar imagens intravitais longitudinais da glândula mamária por longos períodos de tempo, até várias semanas.A tampa substituível da janela de imagem mamária garante condições ideais de imagem em todos os momentos e permite manipulação de tecidos ou administração de medicamentos entre as sessões de imagem. Nosso método não só fornece insights sobre biologia saudável da glândula mamária, mas também nos permite estudar a iniciação e progressão do tumor mamário no nível unicelular. Comece colocando a tampa da janela de imagem mamária em uma superfície estéril e aplicando cola adesiva cianoacrila ao redor de todo o perímetro da tampa da borda.Coloque cuidadosamente um deslizamento de vidro redondo de 10 milímetros em cima da tampa. Use uma vara de madeira estéril para posicionar o deslizamento da tampa de vidro e aplique alguma força para empurrá-lo para baixo para garantir uma vedação hermética entre o deslizamento da tampa de vidro e a moldura da tampa. Certifique-se de que o vidro não cubra os orifícios nos braços da tampa.Desinfete as tampas e a janela de imagem mamária submergindo-as em 80% de etanol por pelo menos 30 minutos em uma placa de Petri fechada. Use uma ponta de algodão embebida em acetona para remover o excesso de cola adesiva cianoacrilato no deslizamento da tampa do vidro. Para preparar o rato para a cirurgia, raspe a área ao redor da quarta glândula mamária usando uma lâmina de barbear.Use o quarto mamilo como marco e remova os cabelos soltos usando fita adesiva. Realize um teste de retirada da pata para verificar se o animal está adequadamente anestesiado. Levante suavemente a pele usando fórceps graefe finos e use uma pequena tesoura de mola para fazer uma incisão diagonal de 10 a 15 milímetros na pele em cima da quarta almofada de gordura mamária Use o quarto mamilo como ponto de orientação e certifique-se de não cortar ou danificar o peritônio ou a glândula mamária.Separe a pele da almofada de gordura mamária e camadas de tecido subjacente usando dissecção contundente de até cinco a oito milímetros ao redor da linha de incisão para criar um bolso para caber na moldura da janela de imagem mamária. Defina a região de interesse, ou ROI, com base nas características macroscópicas do tecido mamário, incluindo a localização do linfonodo ou uma lesão tumoral. Tente manter o ROI central no que diz respeito à incisão.Pegue a janela de imagem mamária usando fórceps estéreis e teste se a incisão é grande o suficiente para inserir a janela. Se necessário, amplie ligeiramente a incisão até que a janela de imagem mamária se encaixe. Remova a janela e use uma sutura de seda 5-0 para colocar uma sutura de corda de bolsa de uma a dois milímetros de distância da borda da incisão começando da extremidade caudal e de fora para dentro da pele.Mova aproximadamente cinco milímetros ao longo da incisão e passe o fio de sutura através da pele de dentro para fora. Repita este procedimento ao longo da borda da incisão, criando assim uma sutura circular composta de cinco a seis loops. A saída final da linha de sutura deve estar localizada a aproximadamente dois a cinco milímetros da primeira entrada.Coloque a janela de imagem mamária dentro da incisão e use os fórceps Graefe para colocar cuidadosamente a pele no sulco da janela. Certifique-se de deixar os laços da sutura lá fora. Puxe os laços da sutura da corda da bolsa e puxe suavemente as duas extremidades da sutura para apertá-la no sulco da janela de imagem mamária.Amarre com nós cirúrgicos e corte o excesso de rosca. Use um palito para aplicar geleia de petróleo na borda interna da janela, evitando o tecido subjacente. Empurre suavemente a estrutura da janela para baixo com fórceps estéreis e posicione a tampa na moldura da janela.Isso evitará um volume de ar entre o tecido mamário da glândula e a tampa da janela de imagem mamária. Coloque as pontas das fórceps finas através dos orifícios nos braços da tampa e aperte a tampa torcendo-a no sentido horário. Se algum ar permanecer depois de apertar a tampa, introduza uma agulha de insulina estéril através da pele na cavidade entre o tecido mamário e a tampa e puxe lentamente o êmbolo, criando assim um vácuo entre o tecido da glândula mamária e a tampa da janela de imagem mamária.Agora, o linfonodo pode ser facilmente observado após este procedimento. Inspecione a condição da estrutura da janela de imagem mamária e da tampa, incluindo a estabilidade das suturas ou qualquer dano potencial à tampa. Posicione o mouse na entrada de tal forma que a janela de imagem mamária caia no orifício da caixa de imagem.Aplique fita semi-transparente e em papel sobre a parte de trás do mouse para estabilizar o mouse e reduzir o movimento do tecido devido à respiração. Para sessões de imagem superiores a três horas, coloque uma agulha flexível subcutânea no pescoço do mouse e fixe-a com fita de papel. Conecte uma seringa de 10 milímetros com uma mistura de nutrientes a um tubo de silicone flexível e empurre a mistura de nutrientes até chegar ao fim do tubo.Conecte o tubo de silicone à agulha flexível e injete 50 microliters da solução infundida a cada 30 minutos. Coloque a tampa sobre a caixa de imagem para fechá-la. Em seguida, proteja a caixa de imagem no estágio do microscópio.Verifique se o mouse está estável dentro da caixa de imagens. Defina a área de interesse usando o modo de epifluorescência do microscópio e aplique as configurações do microscópio. Use a função Espiral no modo navegador de software de imagem para gerar uma grande varredura de ladrilhos e criar um mapa de referência do tecido.Defina a região de interesses dentro da visão geral da Espiral e, em seguida, defina os planos Z superior e inferior para determinar a pilha Z. Pressione Comece a obter as pilhas Z tridimensionais ou quadridimensionais detalhadas do tecido. Coloque as pontas das fórceps finas através dos orifícios da janela de imagem mamária nos braços da tampa e solte a tampa torcendo no sentido anti-horário.Alternativamente, o tecido pode ser manipulado ou reposicionado usando fórceps estéreis para otimizar as condições de imagem para a região específica de interesse. Aplique geleia de petróleo na borda interna da janela de imagem mamária, evitando o tecido subjacente. Empurre suavemente a estrutura da janela para baixo com fórceps estéreis e posicione a tampa na moldura da janela.Por fim, coloque as pontas das fórceps finas através dos orifícios dos braços da tampa e alimente a tampa torcendo-a no sentido horário. Pubertal Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-membrana de tomate-membrana GFP camundongos foram injetados com uma baixa dose de tamoxifeno, levando à recombinação mediada por Cre do alelo GFP de membrana de tomate rosa26. Os camundongos foram imagens nos dias um, três e cinco para acompanhar as mudanças dinâmicas na glândula mamária em desenvolvimento.As imagens representativas mostram a renderização 3D de um duto mamário alongado e ramificado ao longo de vários dias, imagens através de uma janela de imagem mamária. Imagens únicas de plano Z da ponta de ramificação e do ramo alongamento são mostradas aqui. Células únicas no estroma são destacadas por asteriscos brancos.As imagens representativas mostram o linfonodo inguinal do mouse retratado através de uma janela de imagem mamária. A segunda geração harmônica é retratada em verde. Imagens renderizadas em 3D de uma estrutura ductal mamária de um rato CFP de membrana e-cadherin feminina adulta durante vários dias consecutivos são mostradas aqui.O padrão de colágeno I foi usado para refazer o mesmo ROI e o sinal CFP da membrana e-cadherina foi usado para marcar as células ductais. Os ratos verde-vermelhos kikume foram imagens no dia zero antes e depois da exposição à luz violeta. As sessões de imagem foram repetidas nos dias dois, seis e dez após a conversão.A mesma área da glândula mamária foi imagens através de uma janela de imagem mamária por 10 dias. Regiões menores foram foto-convertidas no dia zero e apresentaram uma taxa de diluição semelhante do sinal vermelho Kikume ao longo do tempo, indicando uma taxa de rotatividade igual em todo o epitélio. Imagens de zoom das regiões indicadas mostram heterogeneidade proliferativa no nível celular seis e 10 dias após a conversão de fotos.A quantificação da razão vermelho-verde de diferentes células 10 dias após a fotoconversão revelou taxas de diluição altamente variáveis de algumas células dentro do mesmo microambiente ductal. Uma etapa crucial deste procedimento é abrir a tampa entre as sessões de imagem. Esta característica única da janela melhora as condições de imagem e permite imagens longitudinais do tecido.A janela de imagem mamária com tampa substituível facilitará novas questões sobre in vivo, testes de drogas de ação rápida e triagem no campo de iniciação tumoral e progressão na glândula mamária do camundongo.

Research

JoVE Journal

Biology

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4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

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