Name: longitudinal intravital microscopy using a mammary imaging window with replaceable lid
Uploaded: 2022-01-20T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid at JoVE.com

Bu çalışma, Araştırma Vakfı Flanders (doktora hibesi temel araştırma 11L7222N - M.C.), Boehringer Ingelheim Vakfı (C.L.G.J.S.'ye Doktora Bursu), bir EMBO doktora sonrası bursu (C.L.G.J.S.'ye ALTF 1035-2020 hibe) ve Doktor Josef Steiner Ödülü (J.v.R.'ye) tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Watson, C. J., Khaled, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+development+in+the+embryo+and+adult:+new+insights+into+the+journey+of+morphogenesis+and+commitment.">Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment.</a> Development. 147 (22), (2020).</li><li>Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intravital+Microscopy+Toolbox+to+Study+Mammary+Gland+Dynamics+from+Cellular+Level+to+Organ+Scale.">An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).</li><li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+dynamic+single-cell+behavior+in+mouse+mammary+tissue.">Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue.</a> Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).</li><li>Scheele, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+and+dynamics+of+mammary+stem+cells+during+branching+morphogenesis.">Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis.</a> Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).</li><li>Kotsuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive,+serial+in+vivo+imaging+of+a+tissue-flap+using+a+tissue+adhesion+barrier.">Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier.</a> IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).</li><li>Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+promote+collagen+fibrillogenesis+around+terminal+end+buds+of+the+developing+mammary+gland.">Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=large-volume,+high-resolution+intravital+imaging+for+tissue-wide+analysis+of+single+cell+dynamics.">large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics.</a> Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+of+the+Lactating+Mammary+Gland+in+Transgenic+Mice+Expressing+Fluorescent+Proteins.">Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins.</a> Advances in Intravital Microscopy. , 187-204 (2014).</li><li>Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+milk+lipid+droplet+transport,+growth,+and+secretion+revealed+by+intravital+imaging:+lipid+droplet+release+is+intermittently+stimulated+by+oxytocin.">Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).</li><li>Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symposium+review:+Intravital+imaging+of+the+lactating+mammary+gland+in+live+mice+reveals+novel+aspects+of+milk-lipid+secretion.">Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion.</a> Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mice+for+Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Mammary+Gland.">Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Vital+Signs+for+Long-Term+Survival+of+Mice+under+Anesthesia.">Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).</li><li>Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+Time-lapse+Intravital+Imaging+of+Real-time+Multicellular+Dynamics+in+the+Tumor+Microenvironment.">Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2++mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> IntraVital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+rodent+mammary+window+of+orthotopic+breast+cancer+for+intravital+microscopy.">A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy.</a> Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).</li><li>Zomer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cancer+stem+cell+plasticity+in+mammary+tumors.">Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors.</a> Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Niinomi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+research+and+development+in+titanium+alloys+for+biomedical+applications+and+healthcare+goods.">Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Crypt+Homeostasis+Results+from+Neutral+Competition+between+Symmetrically+Dividing+Lgr5+Stem+Cells.">Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li><li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos.">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC Developmental Biology. 9, 49 (2009).</li><li>Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+Axis+Is+Specified+Independently+of+Early+Cell+Lineage+But+Aligns+with+the+ZP+Shape.">Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape.</a> Science. 316 (5825), 719-723 (2007).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+physiological+motion+from+Intravital+and+clinical+functional+imaging+data.">Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data.</a> eLife. 7, 35800 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

R.MIW, doğal ve minimal olarak bozulmuş ortamında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin uzunlamasına görüntülenmesine izin verir ve meme bezinin çeşitli gelişim aşamalarında tekrar tekrar görselleştirilmesine izin verir. R.MIW tasarımı, pencerenin deney sırasında herhangi bir noktada açılmasını sağlar. İlgilenilen dokuya uzun süreli görsel erişim, örneğin, kapak kayması üzerinde hücre kalıntılarının birikmesiyle engellenebilir. Bu gibi durumlarda, R.MIW, tüm görünür doku alanının ve kapağın temizlenmesini sağlamak için bir görüntüleme seansından önce veya hemen sonra açılabilir. Çıkarılabilir kapak ayrıca dokunun manipülasyonuna ve spesifik inhibitörler ve tedaviler, etiketleme boyaları veya ilgilenilen spesifik hücre tipleri gibi maddelerin lokal uygulamasına izin verir.
Bu yöntem, bir görüntüleme seansı ile sınırlı olan daha önce tarif edilen meme deri flebi prosedürleri 4,7,8,13'ün sınırlamasının üstesinden gelir ve dallanma morfogenezi (Şekil 5), homeostatik doku döngüsü (Şekil 6) veya hücresel düzeyde tümör büyümesi (Şekil 3B) gibi süreçleri görselleştirebilir. ). Bununla birlikte, aynı zamanda, R.MIW, daha önce yayınlanan MIW3,18 ve diğer tüm görüntüleme pencereleri20,22'ye kıyasla R.MIW'nin büyük bir varlığını içeren görüntüleme oturumları arasında dokunun lokal manipülasyonuna izin verir. R.MIW'yi açarken, herhangi bir enfeksiyon kaynağını önlemek için her zaman aseptik koşulları korumak önemlidir. R.MIW'yi aseptik bir ortamda açma yeteneği, her görüntüleme seansından önce görüntüleme koşullarının optimize edilmesini sağlar ve bu da ilgilenilen dokuya uzun vadeli görsel erişimi büyük ölçüde geliştirir. Spesifik olarak, adiposit bakımından zengin bir stroma içine gömülü olan meme bezinde, bu çok değerlidir. Dahası, değiştirilebilir kapak, IVM deneyini sonlandırmaya gerek kalmadan terapötiklerin, farklı hücre tiplerinin, etiketleme boyalarının, görüntü rehberliğinde mikrodiseksiyonun veya dokunun başka herhangi bir lokal manipülasyonunun lokal olarak uygulanmasını benzersiz bir şekilde mümkün kılabilir. Örneğin, tümör başlangıcını incelemek için, spesifik kanser hücresi popülasyonları, bu ROI'ye R.MIW halkası aracılığıyla erişilebildiği sürece, belirlenmiş bir IVM zaman noktasında ve hassas meme bezi konumunda doğrudan duktal ağaca veya stromaya enjekte edilebilir. Tümör progresyonunu incelemek için, spesifik kanser hücresi popülasyonları (belirli bir yerde, belirli bir mikro ortamda veya belirli bir davranışla) IVM oturumu sırasında foto-işaretlenebilir ve daha sonra R.MIW'nin açılmasından sonra bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak mikrodiseke edilebilir. İzole hücreler, (tek hücreli) mRNA dizilimi gibi aşağı akış analizleri için daha fazla işlenebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, in vivo hücre davranışını moleküler ekspresyon profilleriyle birleştirebilirsiniz. R.MIW tarafından sağlanan lokal ilaç uygulamasının avantajı, dokunun tedaviden önce ve hemen sonra görüntülenmesini sağlar. Fareyi görüntüleme kutusundan çıkarmak ve daha sonra R.MIW kapağını açtıktan sonra lokal ilaç uygulamasını gerçekleştirmek için gereken aralık dakikalar içinde gerçekleştirilebilir ve bu da hızlı etkili ilaçların anında faz yakalamasını sağlar.
R.MIW aracılığıyla meme bezinin IVM'sinin birçok farklı floresan muhabir fare modeliyle uyumlu olduğunu gösteriyoruz. Yağ bakımından zengin ortamın görüntülenmesi zordur ve bu nedenle parlak floroforların kullanılması önerilir. Bununla birlikte, burada gösterildiği gibi, mCFP gibi daha az parlak floroforlar bile optimum görüntüleme koşullarında R.MIW aracılığıyla görselleştirilebilir. Kaçınılmaz olarak, yağ yastığı daha derin duktal yapıların görüntülenmesini engelleyecek ve görüntülemeyi daha yüzeysel kanallarla sınırlayacaktır. Her IVM deneyinin başlangıcında düşük çözünürlüklü bir genel bakış görüntüsü, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yeterince yüzeysel olan ilgili duktal yapıların belirlenmesine yardımcı olacaktır. Lokal doku manipülasyonu, bağ dokusunun çıkarılması veya R.MIW'yi açtıktan sonra yağ dokusunun yeniden konumlandırılması, IVM'yi yağ dokusu tarafından kaplanan spesifik ROI'ler için optimize edebilir. Bu, bu manipülasyonların yapılmasına izin vermeyen ve pencerenin kendisinin tamamen kaldırılmasını gerektiren önceki tüm pencere tasarımlarına göre önemli bir avantajdır. Spesifik olarak, inguinal lenf nodunun görselleştirilmesi için, ışık saçılımını azaltan ve yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi mümkün kılan üstteki yağ dokusunun nazikçe çıkarılması önerilir. Dokuyu manipüle ederken, her zaman aseptik koşulları koruyun ve IVM deneyi sırasında incelenen süreçleri etkileyebileceğinden, kanamayı veya dokuya ciddi hasarı önleyin.
R.MIW, eklemler veya kemik plakaları gibi sert dokuların yerini almak için klinik pratikte yaygın olarak kullanılan bir malzeme olan titanyumdan yapılmıştır. Titanyum, hafif ve inert karakteri21 de dahil olmak üzere çelik pencerelere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Son zamanlarda, esnek silikon pencere20 de dahil olmak üzere yeni görüntüleme penceresi tipleri oluşturmak için birkaç başka malzeme kullanıldı. R.MIW'nin aksine, esnek pencere implantasyon için herhangi bir dikiş gerektirmez ve özellikle yumuşak ve kırılgan dokular söz konusu olduğunda, hemen hemen her anatomik pozisyon için uygundur. Silikon pencereler, hafif ve deforme olabilen doğaları nedeniyle hayvan hareketliliği üzerinde minimum etkiye sahiptir ve belki de hızlı doku genişlemesi ve büyümesini inceleyen deneylerde daha uygundur20. Titanyum versiyona göre bir diğer avantaj, silikon pencerelerin manyetik rezonans görüntüleme20,27 dahil olmak üzere diğer görüntüleme modaliteleriyle uyumlu olmasıdır. Ancak, hedeflerin 0,17 mm cam kapaklar için optimize edildiğini akılda tutmak önemli olacaktır. Dahası, meme dokusu, özellikle ters çevrilmiş bir mikroskop kullanıldığında, esnek pencereyi kullanarak kısıtlanması zor olan solunum hareketlerine karşı hassastır. Solunum artefaktları, R.MIW tasarımı ve R.MIW'nin görüntüleme kutusunun kakma içine sabitlenmesi ile en aza indirilir. Sonuç olarak, önerilen R.MIW kurulumu kullanılarak elde edilen görüntüler, solunum eserleri nedeniyle bozulmaz. Bununla birlikte, doku lokalizasyonunda genellikle kademeli olan ve edinim sonrası hareket düzeltme yazılımı28 kullanılarak düzeltilebilen küçük sapmalar meydana gelebilir. IVM teknolojileri2,20'nin artan araç kutusuyla, her deney için özel gereksinimler sonunda ilgilenilen dokunun in vivo görselleştirmesinin en iyi yolunu belirleyecektir. Farklı pencere tasarımlarının farklı avantajları ve dezavantajları vardır ve araştırma sorusuna, mevcut mikroskopi kurulumuna, gerekli mekansal ve zamansal çözünürlüğe ve çalışılan sürecin toplam zaman aralığına bağlı olarak, en uygun yaklaşımın belirlenmesi gerekir.
Özetle, R.MIW, MEME BEZI GELIŞIMI, HOMEOSTAZ VE HASTALıK sırasında hücresel dinamiklerin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu birkaç gün ila haftalar boyunca kolaylaştırır.

Meme epiteli, memelilerde bulunan ve yavruları beslemek için süt üreten ve salgılayan eşsiz bir salgı organıdır. Yaşam boyunca, meme bezi, dokunun yapısal ve fonksiyonel değişikliklerinin eşlik ettiği çok sayıda gelişim ve büyüme turuna uğrar1. Gelişim aşamasına bağlı olarak, doku yeniden şekillenmesine katkıda bulunan hücre tipleri ve duktal ağaç içindeki konumu farklıdır.
Multifoton intravital mikroskopi (IVM), meme hücre dinamiklerinin in vivo olarak doğal ve minimal olarak bozulmuş 2,3,4 ayarında incelenmesine izin verir. Meme bezine görsel erişim sağlamak için, meme bezi gelişiminin farklı aşamalarında, ergenlik 4,5,6,7, yetişkinlik 2,8, laktasyon9,10,11,12 ve tümör dinamiği 13,14 dahil olmak üzere birkaç geçici ex vivo veya cilt flebi görüntüleme tekniği yayınlanmıştır. ,15. Bu teknikler meme hücre dinamiklerinin yüksek uzamsal ve zamansal olarak çözülmüş görüntülenmesine neden olsa da, zaman dilimi saatlerle sınırlıdır, oysa çoğu meme bezi yeniden şekillenme süreci günlerden haftalara kadar sürer. Bu nedenle, uzun zaman dilimleri için ilgilenilen dokuya optik erişime izin veren yöntemler gereklidir. Yıllar geçtikçe, bir titanyum meme görüntüleme penceresi (MIW) 2,3,19 dahil olmak üzere meme tümörü görüntüleme15,16,17,18 için birkaç kalıcı görüntüleme penceresi geliştirilmiştir. Meme tümörü büyümesini incelemek için çok yararlı olmasına rağmen, sağlıklı meme bezi yapısının görselleştirilmesi birkaç gün ile sınırlı kalmıştır. Son zamanlarda, pubertal meme bezinin20. haftada birkaç kez görselleştirilmesini sağlayan esnek bir silikon görüntüleme penceresi geliştirilmiştir. Bununla birlikte, meme bezi adiposit bakımından zengin bir yağ yastığına gömülüdür, bu da geniş ışık saçılmasına ve sonuç olarak meme duktal yapılarının sınırlı görünürlüğüne yol açar. Bu nedenle, meme bezinde uzun süre boyunca doku dinamiklerini görselleştirmek için her zaman üstün görüntüleme koşulları gereklidir. Ne klasik MIW ne de esnek silikon pencere, görüntüleme öncesi doku manipülasyonuna veya fiziksel doku konumunun optimizasyonuna izin vermez, çünkü pencere ameliyat ve implantasyondan sonra kapalı bir sistem oluşturur. Sonuç olarak, altta yatan meme dokusuna optimal optik erişimin daha uzun süreler boyunca engellenmesi muhtemeldir. Buna karşılık, cilt flebi tekniği, görüntüleme seansı sırasında dokunun optimizasyonuna ve yeniden konumlandırılmasına izin verir ve bir cilt flebi birden çok kez tekrarlanabilir2. Bununla birlikte, bir cilt flebi aracılığıyla tekrarlanan görüntüleme seansları, yalnızca cildin iyileşmesine izin vermek için ameliyatlar arasında yeterli zaman (en az 7 gün) ayrıldığında mümkündür ve bu nedenle çoğunlukla daha uzun zaman ölçeklerinde süreçleri incelemek için uygundur. Ayrıca, invaziv doğası ve büyük enfeksiyon riski ve yara kapandığında yara izi bırakması nedeniyle bu prosedürün birçok kez yapılmaması tavsiye edilir.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek, yani yüksek frekansta uzun bir süre boyunca optimal görüntüleme koşullarını sağlamak ve aynı zamanda doku manipülasyonuna izin vermek için, MIW'nin değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) geliştirilmiş bir titanyum versiyonu, sağlıklı ve hastalıklı meme bezini birkaç gün ila2 . haftalar arasında görselleştirmek için tasarlanmıştır (Şekil 1A, B). R.MIW, IVM deneyinin tüm süresi boyunca doğrudan doku manipülasyonunu mümkün kılarak optimal doku erişimi sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır ve böylece meme bezinin uzun süre boyunca doğru zamanda ve yerde görselleştirilmesine izin verir. Kapatıldığında, R.MIW klasik MIW ile karşılaştırılabilir hava geçirmez bir sistem oluşturur (Şekil 1C). Aseptik koşullar altında açıldığında, R.MIW, optik erişimi iyileştirmek için lokal doku manipülasyonuna izin verir ve ayrıca yol inhibitörleri veya agonistleri, kanser hücresi veya bağışıklık hücresi popülasyonları gibi farklı hücre tiplerinin enjeksiyonu veya doku etiketleme boyalarının eklenmesi gibi maddelerin lokal olarak uygulanmasını sağlar. Kapak, görüntüleme seansları arasında altta yatan dokuya zarar vermeden her an açılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig01.jpg"> Resim 1: Değiştirilebilir kapaklı meme görüntüleme penceresinin tasarımı. (A) Halkaya yapıştırılmış 10 mm'lik bir kapak camı ile meme görüntüleme penceresinin değiştirilebilir kapağının üstten görünümü ve yandan görünümü. (B) Bir çanta ipi dikişi kullanarak pencereyi farenin derisi içinde sabitlemek için aralarında bir oluk bulunan bir dış halka ve iç halkadan oluşan meme görüntüleme penceresinin üstten görünümü ve yandan görünümü. Dış bilezik, kapağın dört çıkıntısına (kollarına) uyan küçük bir oluğa sahiptir. (C) Kapağın açılma ve kapanma mekanizmalarını gösteren karikatür ve resimler. Eğimli çıkıntılar, kapağın pencere çerçevesinin içine sabitlendiğinden emin olur. Bu şekil Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu protokol, R.MIW'nin tasarım ve implantasyon prosedürünün yanı sıra aynı meme kanallarını tekrar ziyaret etmek ve hücresel çözünürlükte görselleştirmek için uzunlamasına bir IVM stratejisini açıklamaktadır. R.MIW, çeşitli floresan muhabir fare modellerinde meme bezinin farklı gelişimsel aşamalarında hücre bölünmelerini ve morfolojik değişiklikleri takip etmeyi sağlar. Birlikte ele alındığında, R.MIW, meme bezi gelişimi, homeostaz ve hastalık sırasında hücresel dinamiklerin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu kolaylaştırır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td>BD</td>
			<td>306573</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm round coverglass</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10696365</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 braided silk suturs</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia induction box</td>
			<td>Kentscientific</td>
			<td>VetFlo-MSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Vetergesic&#174;)</td>
			<td>Ecuphar</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tips (sterile)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13113743</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>NA</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Duratears</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible butterfly needle</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>450120</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps (blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Kentscientific</td>
			<td>RightTemp Jr.</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging box</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infuse nutrient mixture</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Nutriflex special 70/240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>324911</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted multi-photon microscope with automated stage</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Kentscientific</td>
			<td>VetFlo-1231K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12510-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>semi-transparent tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape tesa</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Vaseline</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11904325</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>Solutions Elastomeres</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any houseware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (10 ml)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lid for mammary imaging window</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium mammary imaging window</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden sticks toothpicks</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC1678836</td>
			<td>Other brands available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital microscopy using a mammary imaging window with replaceable lid

Meme bezinin dallanmış yapısı oldukça dinamiktir ve doğumdan sonra birkaç büyüme ve yeniden yapılanma aşamasına uğrar. İntravital mikroskopi, cilt flebi cerrahisi veya görüntüleme pencerelerinin implantasyonu ile kombinasyon halinde, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı meme bezinin dinamiklerini incelemek için kullanılmıştır. Çoğu meme görüntüleme teknolojisi, saatler ila günler arasında bir zaman dilimi ile sınırlıdır, oysa meme bezi yeniden şekillendirme süreçlerinin çoğu, günlerden haftalara kadar olan zaman dilimlerinde gerçekleşir. Meme bezinin yeniden şekillenmesini incelemek için, uzun zaman dilimleri için ilgilenilen dokuya optik erişime izin veren yöntemler gereklidir. Burada, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) titanyum meme görüntüleme penceresinin, meme bezinin birkaç haftaya kadar hücresel çözünürlükte yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayan geliştirilmiş bir versiyonu açıklanmaktadır. Önemli olarak, R.MIW, intravital görüntüleme deneyinin tüm süresi boyunca doku erişimi sağlar ve bu nedenle lokal doku manipülasyonu, etiketleme, ilaç uygulaması veya görüntü rehberliğinde mikrodiseksiyon için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, R.MIW, meme bezi gelişimi, homeostaz ve hastalık sırasında hücresel dinamiklerin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu sağlar.

Meme bezinin farklı gelişim aşamalarında meme epitel hücrelerinin proliferatif dinamiklerini incelemek için tarif edilen protokol gerçekleştirildi. R.MIW'nin tasarımı Şekil 1'de gösterilmiştir ve bir R.MIW'yi implante etme prosedürü Şekil 2'de özetlenmiştir. R.MIW, meme bezi ve cilt arasına cerrahi olarak implante edilir. Pencere halkası içinde tutmak ve farelerin dikişleri çekmesini önlemek için bir dikiş kullanılır (Şekil 2). R.MIW'yi tutan dikişler, hipoalerjenik özelliklere, yumuşak bir dokuya sahip olan ve kullanımı kolay olan emilemeyen ipekten yapılmıştır. R.MIW halkası, implantasyondan sonra inflamasyonu veya nekrozu teşvik etmeyen en biyouyumlu malzemelerden biri olan titanyumdan yapılmıştır21. Aseptik koşullar takip edilirse ve dikişler iyi uygulanırsa, R.MIW meme bezi implantasyonu postoperatif komplikasyon riski düşüktür. Ayrıca, abdominal görüntüleme penceresi implantasyonu22'den farklı olarak, R.MIW implantasyonu fare sağkalımı için sınırlayıcı bir faktör değildir, çünkü meme bezi hayati bir organ değildir ve etik protokolde belirtilen sınıra kadar günlük görüntülemeye izin verir. Pencere implantasyon süresini sınırlayan tek faktör, cildin homeostatik döngüsüdür ve bu da sonunda dikişlerin 4-6 hafta sonra düşmesine neden olacaktır. Bu nedenle, dikişlerin stabilitesini düzenli olarak kontrol etmek önemlidir. İstenirse, pencere stabilitesini sağlamak için dikişler çıkarılabilir ve aseptik koşullar altında (adım 3.5 - 3.8'de açıklandığı gibi) yeni bir çanta ipi sütürü ile değiştirilebilir.
Çok günlük görüntüleme yaklaşımını kullanırken karşılaşılan en büyük zorluk, ardışık günlerde yatırım getirisini geri almaktır. Bu amaçla, yatırım getiri(ler)ini seçmeden önce hızlı bir genel bakış taraması eklenebilir (Şekil 3B). Kollajen ağ sinyali (ikinci harmonik nesil tarafından görselleştirilmiş), doku yapısı ve ayrıca boyalar veya floresan proteinlerle diferansiyel veya stokastik olarak etiketlenmiş hücrelerin yerel kalıpları dahil olmak üzere dokunun aynı bölgesini izlemek için çoklu doku işaretleri kullanılabilir (Şekil 3B). Bu temsili örnekte, bir MMTV-PyMT'nin 4. meme bezine bir R.MIW implante edildi; R26-CreERT2het; R26-Konfetihet dişi fare, palpe edilebilir tümör oluşumunun başlangıcında. Daha sonra, stokastik rekombinasyon, 1.5 mg tamoksifen enjeksiyonu ile indüklendi ve bazı hücrelerde Konfeti yapısının rekombinasyonu ile sonuçlandı (Şekil 3C). Rekombine tümör hücreleri 20 günlük bir süre boyunca takip edildi (Şekil 3B,C). Meme bezinin aynı bölgesinin ardışık günlerde görüntülenmesi engellenirse, pencere daha da temizlemek için aseptik bir ortamda (adım 5.1'de açıklandığı gibi) açılabilir ve görünürlüğü ve görüntü elde etmeyi iyileştirmek için dokuyu yeniden konumlandırabilir (Şekil 3A).
Bu yöntem kullanılarak ergenlik döneminde gelişen meme bezi tek hücre düzeyinde takip edildi. Bir R.MIW aracılığıyla tekrarlanan IVM, R26-CreERT2het kullanılarak gerçekleştirildi; R26-mTmGhet 4-6 haftalıkken dişi fareler, tüm hücrelerin membran tdDomates ile etiketlendiği (Şekil 4A)23. Farelere düşük dozda tamoksifen (0.2 mg / 25 g vücut ağırlığı) enjekte edildi, bu da mTmG yapısının sporadik rekombinasyonuna neden oldu ve meme bezi de dahil olmak üzere tüm dokulardaki bazı hücrelerde kırmızıdan yeşile bir değişikliğe neden oldu (Şekil 4B). Aynı ROI'ler, hücresel çözünürlükte duktal uzama ve duktal dallanma (Şekil 4C) dahil olmak üzere meme bezindeki morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için birkaç gün boyunca tekrar gözden geçirildi. Önemli olarak, stokastik hücre etiketleme ve çok günlük IVM'nin bu kombinasyonu, uzama ve dallanma kanallarını çevreleyen stromadaki tek hücrelerin dinamikleri (Şekil 4D) ve inguinal lenf nodu içindeki hücresel dinamikler (Şekil 4E) gibi duktal ortamın dinamik değişikliklerinin görselleştirilmesine de izin verir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig04.jpg"> Şekil 4: Pubertal dallanma morfogenezinin çok günlük IVM'si. (A) Pubertal R26-CreERT2; 4-6 haftalık yaştaki R26-mTmG farelerine, R26-mTmG alelinin Cre-aracılı rekombinasyonuna yol açan düşük dozda tamoksifen enjekte edildi ve gelişmekte olan meme bezindeki dinamik değişiklikleri takip etmek için 1, 3 ve 5. günlerde görüntülendi. (B) R26-mTmG fare yapısının şematik gösterimi, yeniden birleştirilmemiş koşullarda membran tdTomato'nun (mT) her yerde ekspresyonuyla sonuçlanır. Cre-aracılı rekombinasyon üzerine, mT membran eGFP (mG) ekspresyonu için değiştirilir. (C) Bir R26-CreERT2'de bir R.MIW aracılığıyla görüntülenen uzamış ve dallanan bir meme kanalının birden fazla gün boyunca 3D görüntüsü; 6 haftalıkken R26-mTmG dişi fare. (D) Dallanma ucunun (üst paneller) ve uzama dalının (alt paneller) tek Z-düzlemi görüntüleri. mT kırmızı, mG ise camgöbeği ile tasvir edilmiştir, ölçek çubukları 100 μm'yi (A ve B) temsil eder. Stromadaki tek hücreler beyaz yıldızlarla vurgulanır. Stromdaki tek hücreleri vurgulamak için sinyal yoğunluğunun manuel olarak arttırıldığını ve meme epitel hücrelerinin biraz fazla maruz kalmasına yol açtığını unutmayın. (E) Bir R26-CreERT2'nin inguinal lenf nodunun temsili görüntüleri; R26-mTmG dişi farenin R.MIW üzerinden görüntülenmesi, genel bakış kutucuğu taraması (sol panel), tek bir Z-düzleminin (üstte) yakınlaştırma görüntüleri (sağ paneller) ve 3B işleme (altta) gösterilir. İkinci harmonik nesil (kollajen I) yeşil, mT kırmızı ve mG camgöbeği ile gösterilir. Ölçek çubukları 500 μm (genel bakış kutucuk taraması) ve 100 μm (yakınlaştırma görüntüleri) değerlerini temsil eder. Şekil panelleri C ve D, Messal ve ark. 2'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Benzer şekilde, yetişkin meme bezinde, önerilen R.MIW yaklaşımı, aynı duktal yapıların birkaç gün boyunca ödün vermeyen görünürlükle görselleştirilmesine izin verir. Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP) fare modeli gibi daha az parlak floresan muhabir modelleri24'ün kullanımı bile, duktal stabilitenin ve ince morfolojik değişikliklerin hücresel çözünürlükte görselleştirilmesine izin verir (Şekil 5). 3. gün ile 5. gün arasındaki görünürlüğün, doku yeniden konumlandırmasından sonra önemli ölçüde arttığını unutmayın (Şekil 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig05.jpg"> Şekil 5: Yetişkin meme bezinin çok günlük görüntülemesi . 3D, yetişkin bir dişi Cdh1-mCFP (camgöbeği, Ecadherin-pozitif luminal hücreler ekspresyonunu işaretleyen) faresinin meme duktal yapısının görüntülerini ardışık birkaç gün boyunca işledi. Aynı ROI'yi yeniden izlemek için kollajen I paterni (ikinci harmonik nesil, macenta) kullanıldı ve duktal (luminal) hücreleri işaretlemek için Cdh1-mCFP sinyali kullanıldı. 3. günden sonraki görünürlüğün, R.MIW kapağının açılması ve dokunun yeniden konumlandırılmasıyla iyileştirildiğini unutmayın. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig05large.jpg" target="_blank">eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tek hücre düzeyinde hormonal döngü sırasında meme epitel hücrelerinin proliferatif heterojenliğini değerlendirmek için, KikGR proteininin her yerde ekspresyonuna sahip olan foto-dönüştürülebilir Kikume Yeşil-Kırmızı (KikGR) muhabir fare modeli25,26 kullanılmıştır. KikGR, mor ışığa maruz kaldığında yeşil-kırmızı dönüşüme uğrayan parlak bir florofordur ve kırmızı/yeşil oran, hücre2'nin proliferatif aktivitesi için bir vekil olarak kullanılabilir (Şekil 6A, B). R.MIW yaklaşımını kullanarak, yetişkin meme bezinin duktal ağacındaki aynı hücreleri birkaç gün boyunca takip ettik ve duktal ağaç boyunca daha önce beklenmeyen proliferatif heterojenite bulduk (Şekil 6C). Yüksek ve düşük proliferatif hücreler dönüştürülmüş farklı alanlara eşit olarak dağılmıştır (Şekil 6C, D). Çarpıcı bir şekilde, yerel düzeyde, komşu hücreler kırmızı/yeşil oranlarında büyük farklılıklar göstermiştir (Şekil 6C, D). Foto-dönüşümden 10 gün sonra farklı hücrelerin kırmızı/yeşil oranının (proliferatif aktiviteleri için bir vekil olarak) ölçülmesi, aynı duktal mikro ortamdaki bazı hücrelerin oldukça değişken seyreltme oranlarını ortaya koymuştur (Şekil 6E). Birlikte, bu veriler yetişkin meme bezinde dikkate değer bir lokal proliferatif heterojenliği ve aynı zamanda küresel bir tekdüze ciro oranını ortaya koymaktadır.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig06.jpg"> Şekil 6: KikGR fare modeli kullanılarak yetişkin meme bezinde proliferatif heterojenliğin uzunlamasına IVM'si. (A) KikGR fareleri, mor ışığa maruz kalmadan önce ve sonra 0. günde görüntülendi. Görüntüleme seansları dönüşümden sonra 2, 6 ve 10. günlerde tekrarlandı. (B) KikGR meme epitel hücrelerinin proliferasyon (sol panel) ve zamanın bir fonksiyonu olarak proliferasyon (sağ panel) sonrası foto-dönüşümü üzerine varsayımsal sonuçların şematik tasviri. (C) Meme bezinin aynı bölgesi, 10 günlük bir süre boyunca bir R.MIW aracılığıyla görüntülendi. Daha küçük bölgeler 0. günde foto-dönüştürüldü ve zaman içinde Kikume kırmızı sinyalinin benzer bir seyreltme oranını gösterdi ve bu da epitel boyunca eşit bir devir hızına işaret etti. (D) C panelinde belirtilen bölgelerin yakınlaştırma görüntüleri (tek Z-düzlemleri), foto-dönüşümden 6 ve 10 gün sonra hücresel düzeyde proliferatif heterojenlik gösterir. Ölçek çubukları 100 μm (panel C) ve 10 μm'yi (panel D) temsil eder. (E) Foto-dönüştürülmüş üç alanda rastgele seçilen hücrelerin (n = 48 hücre) kırmızı/yeşil oranının ölçülmesi. Yüksek kırmızı/yeşil oranı düşük seyreltme oranının ve düşük proliferatif aktivitenin göstergesiyken, düşük kırmızı/yeşil oranı yüksek seyreltme oranının ve proliferasyonun göstergesidir. Şekil panelleri C-E Messal ve ark. 2'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid at JoVE.com

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

Bu protokol, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) yeni bir meme görüntüleme penceresini tanımlar. R.MIW'nin implantasyonundan sonra intravital mikroskopi, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin hücresel çözünürlükle uzunlamasına ve çok günlük görüntülenmesini sağlar.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Meme bezi oldukça dinamiktir ve yaşam boyunca birçok yeniden yapılanma turuna uğrar. Protokolümüz, sağlıklı ve hastalıklı meme bezindeki doku yeniden düzenlemelerini yönlendiren hücresel dinamikleri yakalamaya izin verir. Değiştirilebilir kapaklı meme görüntüleme penceremiz, meme bezinin uzunlamasına intravital görüntülemesinin birkaç haftaya kadar uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesini sağlar.Meme görüntüleme penceresinin değiştirilebilir kapağı, her zaman optimum görüntüleme koşulları sağlar ve görüntüleme seansları arasında doku manipülasyonuna veya ilaç uygulamasına izin verir. Yöntemimiz sadece sağlıklı meme bezi biyolojisi hakkında fikir vermekle kalmaz, aynı zamanda meme tümörünün başlamasını ve ilerlemesini tek hücre düzeyinde incelememize izin verir. Meme görüntüleme penceresinin kapağını steril bir yüzeye yerleştirerek ve tüm jant kapağı çevresine siyanoakrilat yapışkan yapıştırıcı uygulayarak başlayın.Kapağın üstüne 10 milimetrelik yuvarlak bir cam kapak kaymasını dikkatlice yerleştirin. Cam kapak kaymasını konumlandırmak için steril bir ahşap çubuk kullanın ve cam kapak kayması ile kapağın çerçevesi arasında hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için aşağı itmek üzere biraz kuvvet uygulayın. Camın kapağın kollarındaki delikleri örtmediğinden emin olun.Kapakları ve meme görüntüleme penceresini kapalı bir Petri kabında en az 30 dakika boyunca% 80 etanol içine batırarak dezenfekte edin. Cam kapak kayması üzerindeki fazla siyanoakrilat yapışkan yapıştırıcıyı çıkarmak için asetona batırılmış bir pamuk ucu kullanın. Fareyi ameliyata hazırlamak için, dördüncü meme bezinin etrafındaki alanı bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin.Dördüncü meme ucunu bir dönüm noktası olarak kullanın ve yapışkan bant kullanarak gevşek tüyleri çıkarın. Hayvanın yeterince uyuşturulup uyuşturulmadığını doğrulamak için bir pençe çekme testi yapın. İnce Graefe forseps kullanarak cildi nazikçe kaldırın ve dördüncü meme yağ yastığının üstündeki ciltte 10 ila 15 milimetrelik diyagonal bir kesi yapmak için küçük yaylı makas kullanın Dördüncü meme ucunu bir oryantasyon noktası olarak kullanın ve periton veya meme bezini kesmediğinizden veya zarar vermediğinizden emin olun.Meme görüntüleme penceresi çerçevesine uyacak bir cep oluşturmak için insizyon çizgisinin her yerinde beş ila sekiz milimetreye kadar künt diseksiyon kullanarak cildi meme yağ yastığından ve altta yatan doku katmanlarından ayırın. Lenf nodu veya tümör lezyonunun yeri de dahil olmak üzere meme dokusunun makroskopik özelliklerine dayanarak ilgi alanını veya ROI'yi tanımlayın. Kesi ile ilgili olarak ROI'yi merkezi tutmaya çalışın.Steril forseps kullanarak meme görüntüleme penceresini alın ve insizyonun pencereyi yerleştirecek kadar büyük olup olmadığını test edin. Gerekirse, meme görüntüleme penceresi oturana kadar insizyonu hafifçe büyütün. Pencereyi çıkarın ve kaudal uçtan başlayarak ve cildin dışından içine doğru insizyonun kenarından bir ila iki milimetre uzağa bir çanta ipi dikişi yerleştirmek için 5-0 ipek dikiş kullanın.Kesi boyunca yaklaşık beş milimetre yukarı doğru hareket ettirin ve dikiş ipliğini deriden içeriden dışarıya doğru geçirin. Bu prosedürü insizyonun kenarı boyunca tekrarlayın, böylece beş ila altı döngüden oluşan dairesel bir dikiş oluşturun. Dikiş ipliğinin son çıkışı, ilk girişten yaklaşık iki ila beş milimetre uzağa yerleştirilmelidir.Meme görüntüleme penceresini insizyonun içine yerleştirin ve cildi pencerenin oluğuna dikkatlice yerleştirmek için Graefe forsepslerini kullanın. Dikişin halkalarını dışarıda bıraktığınızdan emin olun. Çanta ipi dikişinin halkalarını çekin ve meme görüntüleme penceresinin oluğunda sıkmak için dikişin her iki ucunu da yavaşça çekin.Cerrahi düğümlerle bağlayın ve fazla ipliği kesin. Petrol jölesini pencerenin iç kenarına uygulamak için bir kürdan kullanın ve altta yatan dokudan kaçının. Steril forseps ile pencere çerçevesini yavaşça aşağı doğru itin ve kapağı pencere çerçevesine yerleştirin.Bu, meme bezi dokusu ile meme görüntüleme penceresi kapağı arasında bir hava hacmini önleyecektir. İnce forsepslerin uçlarını kapağın kollarındaki deliklerden geçirin ve kapağı saat yönünde bükerek sıkın. Kapağı sıktıktan sonra biraz hava kalırsa, deriden meme dokusu ile kapak arasındaki boşluğa steril bir insülin iğnesi sokun ve pistonu yavaşça çekin, böylece meme bezi dokusu ile meme görüntüleme penceresi kapağı arasında bir boşluk oluşturun.Şimdi lenf nodu bu işlemden sonra kolayca gözlemlenebilir. Meme görüntüleme penceresi çerçevesinin ve kapağın durumunu, dikişlerin stabilitesi veya kapaktaki olası hasarlar dahil olmak üzere kontrol edin. Fareyi, meme görüntüleme penceresinin görüntüleme kutusu kakmasının deliğine düşeceği şekilde kakma üzerine getirin.Fareyi stabilize etmek ve solunum nedeniyle doku hareketini azaltmak için farenin arkasına yarı saydam ve kağıt bant uygulayın. Üç saatten uzun süren görüntüleme oturumlarında, esnek bir iğneyi farenin boynuna deri altından yerleştirin ve kağıt bantla sabitleyin. Esnek bir silikon tüpe bir besin karışımı ile 10 milimetrelik bir şırınga takın ve besin karışımını tüpün sonuna ulaşana kadar itin.Silikon tüpü esnek iğneye bağlayın ve her 30 dakikada bir demlenmiş çözeltinin 50 mikrolitresini enjekte edin. Kapatmak için kapağı görüntüleme kutusunun üzerine yerleştirin. Ardından, görüntüleme kutusunu mikroskop aşamasında sabitleyin.Farenin görüntüleme kutusunun içinde sabit olduğunu doğrulayın. Mikroskobun epifloresan modunu kullanarak ilgi alanını tanımlayın ve mikroskop ayarlarını uygulayın. Büyük bir genel bakış karo taraması oluşturmak ve dokunun referans haritasını oluşturmak için görüntüleme yazılımı gezgini modunda Spiral işlevini kullanın.Spiral genel bakış içinde ilgi alanlarını tanımlayın ve ardından Z yığınını belirlemek için üst ve alt Z düzlemlerini tanımlayın. Dokunun ayrıntılı üç boyutlu veya dört boyutlu Z yığınlarını elde etmek için Başlat'a basın. İnce forsepslerin uçlarını kapağın kollarındaki meme görüntüleme penceresi deliklerinden geçirin ve saat yönünün tersine bükerek kapağı gevşetin.Alternatif olarak, doku, belirli bir ilgi alanı için görüntüleme koşullarını optimize etmek için steril künt forseps kullanılarak manipüle edilebilir veya yeniden konumlandırılabilir. Meme görüntüleme penceresinin iç kenarına petrol jölesi uygulayın ve altta yatan dokudan kaçının. Steril forseps ile pencere çerçevesini yavaşça aşağı doğru itin ve kapağı pencere çerçevesine yerleştirin.Son olarak, ince forsepslerin uçlarını kapağın kollarının deliklerinden geçirin ve kapağı saat yönünde bükerek aydınlatın. Pubertal Rosa26 Cre / ERT2 Rosa26-membranlı domates-membran GFP farelere düşük dozda tamoksifen enjekte edildi ve bu da Rosa26-membranlı domates-membran GFP alelinin Cre-mediated rekombinasyonuna yol açtı. Fareler, gelişmekte olan meme bezindeki dinamik değişiklikleri takip etmek için bir, üç ve beşinci günlerde görüntülendi.Temsili görüntüler, bir meme görüntüleme penceresinden görüntülenen uzun ve dallanmış bir meme kanalının birkaç gün boyunca 3D görüntüsünü göstermektedir. Dallanma ucunun ve uzamakta olan dalın tek Z-düzlemi görüntüleri burada gösterilmiştir. Stromadaki tek hücreler beyaz yıldızlarla vurgulanır.Temsili görüntüler, bir meme görüntüleme penceresinden görüntülenen farenin kasık lenf nodunu göstermektedir. İkinci armonik nesil yeşil renkle tasvir edilmiştir. Yetişkin bir dişi E-kadherin membran CFP faresinin meme duktal yapısının art arda birkaç gün boyunca 3D render edilmiş görüntüleri burada gösterilmiştir.Kollajen I paterni aynı ROI'yi izlemek için kullanıldı ve duktal hücreleri işaretlemek için E-kadherin membran CFP sinyali kullanıldı. Kikume yeşil-kırmızı fareleri, mor ışığa maruz kalmadan önce ve sonra sıfır gününde görüntülendi. Görüntüleme seansları, dönüşümden sonra iki, altı ve 10. günlerde tekrarlandı.Meme bezinin aynı bölgesi 10 gün boyunca bir meme görüntüleme penceresinden görüntülendi. Daha küçük bölgeler sıfır gününde foto-dönüştürüldü ve zaman içinde Kikume kırmızı sinyalinin benzer bir seyreltme oranını gösterdi ve bu da epitel boyunca eşit bir devir hızına işaret etti. Belirtilen bölgelerin yakınlaştırma görüntüleri, foto-dönüşümden altı ve 10 gün sonra hücresel düzeyde proliferatif heterojenlik göstermektedir.Foto-dönüşümden 10 gün sonra farklı hücrelerin kırmızı-yeşil oranının nicelleştirilmesi, aynı duktal mikro ortam içindeki bazı hücrelerin oldukça değişken seyreltme oranlarını ortaya koymuştur. Bu prosedürün önemli bir adımı, görüntüleme seansları arasında kapağı açmaktır. Pencerenin bu benzersiz özelliği görüntüleme koşullarını iyileştirir ve dokunun uzunlamasına görüntülenmesini sağlar.Değiştirilebilir kapaklı meme görüntüleme penceresi, fare meme bezinde tümör başlangıcı ve ilerlemesi alanında in vivo, hızlı etkili ilaç testi ve taraması ile ilgili yeni soruları kolaylaştıracaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

Kranial Pencere üzerinden neokorteks Kan Akış 2-Foton Görüntüleme Bir Yöntem

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Meme Görüntüleme Penceresi yoluyla Dendra2 Photoswitching

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

Meme Epitel Nakli Prosedürü

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...