Name: using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 og P30DK079312 (til B.A.M.). Vi takker personalet på Genomics Core Facility i Research Technology Support Facility (RTSF) ved Michigan State University for at udføre Nanostring-analysen.

<ol>
	<li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Indiana+O'Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis.">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li><li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney:+a+micropuncture+study.">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology.">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats.">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li><li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex:+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains.">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li><li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+rat+homologue+of+podocin:+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli.">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice.">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li><li>Schie&#223;l, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+nephrons+in+BALB/c+and+C57BL/6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney.">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499 (2013).</li><li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction:+a+new+look+at+an+old+model.">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li><li>Yang, H. -. C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+kidney+disease.">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li><li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags.">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li><li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy.">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li><li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2.">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330 (2016).</li><li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model.">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li><li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die:+Is+there+any+cell+death+in+podocytes.">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li><li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease.">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte &amp; Blood Pressure E &amp; BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li><li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis.">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).</li><li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD.">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li><li>M&#252;hlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome.">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).</li><li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periostin:+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells.">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li><li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2/M.">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats.">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells:+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states.">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+bottom+and+using+it:+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy.">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674 (2014).</li><li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus:+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling.">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li><li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus.">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li><li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus.">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li><li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis.">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Undersøgelsen af glomerulær fysiologi har set mange forskellige tilgange, især brugen af mikropunktur, perfusion af isolerede glomeruli og mikroskopi. Tilgængeligheden af overfladeglomeruli i München Wistar rotter, Fromter og Simonsen stammer, har tilladt in vivo dynamiske undersøgelser. En vigtig note til efterforskere, der vedtager denne teknologi, er behovet for at indstille erhvervelsesparametre for at opretholde ensartede billeder mellem undersøgelser, så autofluorescensen i væv forbliver konsistent. Brug af en dual-pass fluorescein / rhodamin epifluorescensterning og justering af forstærkningsindstillinger til de grønne og røde emissionskanaler for at efterligne på computerskærmen, hvad der ses gennem okularerne, vil sikre en ensartet farvesignatur i autofluorescensen selv mellem forskellige mikroskopsystemer.
Fromter-stammen er blevet brugt i vid udstrækning, da den har et reduceret antal samlede glomeruli, ~ 75% normal, og mændene udvikler spontant hypertension omkring 12 uger med progressiv proteinuri og efterfølgende fokal glomerulær sklerose, der til sidst dør af nyresvigt12. Brugen af disse rotter og tilføjelsen af 2-fotonmikroskopi med dens reducerede fototoksicitet, forbedrede penetrationsdybde og evnen til at se flere fluorescerende sonder samtidig banede vejen for nye opdagelser 1,4,5. Med udviklingen af computerhardware og -software er kvantitative data nu standarden for alle 2-fotonlaboratorier. Flere kvantitative teknikker er blevet udviklet og anvendt til glomerulære, proksimale tubuli-, vaskulære og interstitielle processer under fysiologiske og sygdomstilstande 1,4,5,27,28,29,30.
Transgene museproduktionsfaciliteter tilføjede en ny dimension til studiet af nyrefysiologi og patologi, og det var kun et spørgsmål om tid, før dette blev kombineret med 2-fotonmikroskopi for yderligere at afgrænse betydningen af specifikke genprodukter i nyrestruktur og funktion. Imidlertid er museglomeruli, undtagen hos meget unge mus, placeret over 100 μm fra overfladen af nyren9. To-fotonmikroskopi udføres bedst i en dybde på mellem 20 og 50 μm som opløsning, og fluorescensintensiteten falder hurtigt derefter på grund af lysspredning af udsendt lys og absorption fra interaktion med hæmoglobin. Derfor var det nødvendigt at inducere overfladeglomeruli. Den almindeligt anvendte tilgang er en langvarig ensidig obstruktionsmodel i 12 uger. Da disse modeller ikke tillader baseline-bestemmelse, er det ikke muligt at adskille virkningerne af UUO fra den proces, der undersøges.
Ved hjælp af MWF-rotter kan man sammenligne baseline glomerulær funktion med den følgende UUO. Denne UUO-model er kendt for at fremkalde betændelse og en hurtig fibrose og er blevet brugt til at studere CKD og fibrose10,11,12. Som forventet var der en stigning i overfladeglomeruli hos både MWF- og SD-rotter. Desuden var de kvantitative resultater, der blev opnået efter UUO for MWF- og SD-rotterne, meget sammenlignelige. Reduktionen i blodgennemstrømningen registreret her var tidligere blevet rapporteret sammenlignet med mikroskopiske data efter UUO med mikropunkturdata3. Det var også velkendt, at rørformet og interstitiel histologi er markant ændret, og PT'erne er for det meste ikke-funktionelle, som rapporteret her, med mangel på albuminendocytose. Undersøgelserne i figur 2 og figur 3 viser en dramatisk reduktion i RBC-strømningshastigheden i glomerulære og peritubulære kapillærer og forbedret WBC-vedhæftning. Reduktionerne i flow skyldes sandsynligvis kapillærblokering fra WBC-adhæsions- og rouleauxformationer.
For yderligere at evaluere inflammation kvantificerede vi albuminpermeabilitet og viste, at det steg ti gange. Derudover viste isoleret glomeruli, at mRNA-ekspression steg for mange gener, der tidligere var kendt for at være øget i nyrebetændelse i en række nyresygdomstilstande 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Stigningerne i glomerulær overfladetæthed og albuminpermeabilitet var progressive, som det fremgår af de 12-ugers UUO-data. De nuværende data er de første til direkte at vise, at glomeruli gennemgår betydelige strukturelle skader, inflammation og molekylære ændringer i UUO-modellen. Resultaterne er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse af hele nyrevæv, der analyserede fårnyrebiopsier efter UUO og fandt flere inflammationsmarkører forhøjet19. De nuværende resultater indikerer, at der findes markant betændelse i glomeruli, der tidligere kun var kendt for kortikalt væv.
De nuværende data adskiller sig fra tidligere undersøgelser på mus, hvor der ikke blev fundet ændringer i adhæsionsmolekyleekspression, komplementaflejring og neutrofil infiltration mellem 12-ugers posthydronefrotisk og normal glomeruli31. Derudover brugte Hickey-laboratoriet den 12-ugers UUO-model til at studere immunreaktioner i glomeruli hos mus. De fandt ingen forskelle i neutrofil infiltration mellem fire uger gamle museglomeruli og postobstruktiv glomeruli32,33. Disse senere undersøgelser blev udført, efter at bækkenet i den blokerede nyre blev drænet for urin. Vi gjorde ikke dette, da vi ønskede at bestemme effekten af UUO på glomerulær funktion, som det ville være in vivo, uden kunstigt at fjerne væsken, der forårsager obstruktionen. Endelig erstattes brugen af UUO i mus med billeddannelse glomeruli på mere end 100 μm under overfladen. Selvom det er muligt, er der en afvejning af opløsning og intensitet, begge reduceres betydeligt, når man går ud over 50 μm34.
De præsenterede resultater er ikke overraskende, hvis man sammenstykker dataene fra den eksisterende litteratur om histologiske ændringer, dannelse af atubulær glomeruli, inflammation, fibrose, hæmodynamik10,11,12. De præsenterede data, herunder WBC-vedhæftning, rouleauxformationer, glomerulære molekylære inflammationsmarkører og øget albuminpermeabilitet, indikerer yderligere den omfattende inflammation, der pågår i denne UUO-model, selv efter fem uger og også til stede ved tolv uger. Det er klart, at kronisk UUO ikke er en fysiologisk tilstand, og brugen af UUO til at inducere overfladeglomeruli repræsenterer en skademodel. MWF-rotterne, som har overfladeglomeruli under fysiologiske forhold, kan undersøges i længderetningen, når der opstår skade. Det er muligt at generere transgene rotter, og mange efterforskere skaber dem med biosensorer for at stille specifikke spørgsmål. Især Medical College of Wisconsin har nu en koloni af MWF-rotter og har lavet transgene rotter med det formål at studere glomerulære processer under fysiologiske og patologiske forhold. Disse MWF-rotter giver en fantastisk mulighed for at studere glomerulære processer hos normale, syge og genetisk ændrede rotter.

Forståelse af glomerulære processer, især podocytbiologi, har været et mål i over 50 år. München Wistar rotter med overfladeglomeruli har spillet en central rolle i disse undersøgelser, herunder mikropunkturundersøgelser, for at forstå mange aspekter af fysiologiske og patologiske processer 1,2,3. Udnyttelsen af mikroskopi til at studere glomerulære komponenter intravitalt var begrænset på grund af virkningerne af fototoksicitet indtil fremkomsten af 2-fotonmikroskopi, der minimerede denne toksiske eksponering og øgede penetrationsdybden 1,2. Sammen med hurtige fremskridt inden for computerhardware og -software har dette givet mulighed for tredimensionelle (3D) og firedimensionelle (tids)studier i timevis i en enkelt indstilling 1,4,5.
Kvantificeringen af glomerulær kapillær blodgennemstrømning, vasokonstriktion og dilatation som reaktion på lægemidler, permeabilitet og virkningerne af ladning på permeabilitet og inflammation er blot nogle af de glomerulære processer, der er blevet undersøgt. Derudover kan S1-segmentet af det proksimale rør identificeres, og forskellene i opførsel af S1 og S2 rørformet epitel kan kvantificeres 1,4. Undersøgelser på mus, især med den universelle tilgængelighed af musetransgene faciliteter, har ført til hurtige fremskridt i forståelsen af molekylærbiologien af glomerulære sygdomsprocesser. Individuelle proteiner er ansvarlige for glomerulær dysfunktion i knockout-undersøgelser, især med hensyn til proteinuri 6,7,8. Anvendelsen af musemodeller til glomerulære billeddannelsesundersøgelser har imidlertid været begrænset, da glomeruli er mere end 100 μm under overfladen i de mange undersøgte stammer9.
Dette har fået efterforskere til at udvikle og bruge musemodeller, hvilket resulterer i overfladeglomeruli, der kan studeres. Den mest almindelige model er brugen af komplet UUO10,11,12. I slutningen af den forlængede UUO-periode er der talrige overfladeglomeruli i musenyrer, der kan og er blevet undersøgt13,14. Der har ikke været nogen baseline- eller kontrolundersøgelse i disse musestudier for at bestemme virkningerne af langvarig UUO på glomerulær biologi. Da dette er en alvorlig og langvarig skadesmodel, der resulterer i hurtig fibrose og kortikal ødelæggelse10,11,12, antog vi, at der ville være virkninger på glomerulære processer og funktion. For at besvare dette spørgsmål blev München Wistar Fromter (MWF) rotter med overfladeglomeruli brugt til at studere kontrol/baseline parametre, og baseline fundet blev sammenlignet med glomerulære undersøgelser i MWF rotter efter fem ugers UUO. Vi undersøgte også Sprague Dawley (SD) rotter, der ikke har overfladeglomeruli efter UUO. Resultaterne indikerer, at 5 ugers UUO i MWF- og SD-rotter faktisk øger antallet af overfladeglomeruli. Disse var imidlertid unormale glomeruli med markante ændringer i glomerulær blodgennemstrømning, inflammation og makromolekylepermeabilitet og størrelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Note: Version 7.1r1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Dissecting Scissors</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 78180-1C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph Image processing Software</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>Cat# 78266-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corportation</td>
			<td>2007 version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reptitherm Undertank Heater</td>
			<td>Zoomed</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11-889-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 70665-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes

Anvendelse af nye mikroskopimetoder til egnede dyresygdomsmodeller for at udforske nyrernes dynamiske fysiologi er fortsat en udfordring. Rotter med overfladeglomeruli giver en unik mulighed for at undersøge fysiologiske og patofysiologiske processer ved hjælp af intravital 2-fotonmikroskopi. Kvantificering af glomerulær kapillær blodgennemstrømning og vasokonstriktion og dilatation som reaktion på lægemidler, permeabilitet og betændelse er blot nogle af de processer, der kan studeres. Derudover giver transgene rotter, dvs. podocytter mærket med fluorescerende farvestoffer og andre molekylære biomarkørmetoder, øget opløsning til direkte overvågning og kvantificering af protein-proteininteraktioner og virkningerne af specifikke molekylære ændringer.
Hos mus, der mangler overfladeglomeruli efter fire uger, er ensidig ureteral obstruktion (UUO) i flere uger blevet brugt til at inducere overfladeglomeruli. Da denne induktionsmodel ikke tillader baselinestudier, kvantificerede vi virkningerne af UUO på glomerulære processer i UUO-modellen i München Wistar Frömter (MWF) rotter, som har overfladeglomeruli under fysiologiske forhold. UUO-modellen i fem uger eller mere inducerede signifikante ændringer i brutto nyremorfologi, den peritubulære og glomerulære mikrovaskulatur samt strukturen og funktionen af rørformet epitel. Glomerulær og peritubulær rød blodlegeme (RBC) flow faldt signifikant (p < 0,01), sandsynligvis på grund af den signifikante stigning i overholdelsen af hvide blodlegemer (WBC'er) inden for glomerulære og peritubulære kapillærer. Den glomerulære sigtningskoefficient for albumin steg fra 0,015 ± 0,002 i ubehandlede MWF'er til 0,045 ± 0,05 i 5 uger gamle UUO MWF-rotter. Tolv ugers UUO resulterede i yderligere stigninger i overfladeglomerulær densitet og glomerulær sigtningskoefficient (GSC) for albumin. Fluorescerende albumin filtreret over glomeruli blev ikke reabsorberet af de proksimale tubuli. Disse data tyder på, at brug af UUO til at inducere overfladeglomeruli begrænser evnen til at studere og fortolke normale glomerulære processer og sygdomsændringer.

Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Her præsenterer vi en protokol ved hjælp af 2-fotonmikroskopi i München Wistar Fromter rotter med overfladeglomeruli for at kvantificere virkningerne af langvarig ureteral obstruktion på glomerulær dynamik og funktion.

Brug af 2-fotonmikroskopi til at kvantificere virkningerne af kronisk ensidig ureteral obstruktion på glomerulære processer

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

I de data, der præsenteres i denne undersøgelse, viser de dramatiske virkninger af ensidig ureteral obstruktion på nyrefunktion, betændelse og fibrose. Det hjælper os med at forstå de patofysiologiske mekanismer ved ensidig ureteral obstruktion. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at studere celle-celleinteraktioner, subcellulære hændelser og associere struktur og funktion på en dynamisk måde inden for en fungerende nyre.Demonstration af ureteral procedure vil blive udført af Dr.Silvia Campos-Bilderback, som er kirurg i vores laboratorium. Til at begynde med skal du bedøve rotten, derefter lave et snit langs midterlinjen og lokalisere venstre nyre for at adskille den fra de omgivende peritoneale organer. Efter at have lokaliseret nyrepediklen, der omfatter nyrearterien, nyrevenen og urinlederen, adskilles urinlederen uden at beskadige den sarte struktur.Brug tang til at løkke og binde en 3-0 sutur rundt om urinlederen, og bind derefter en knude et par millimeter på hver side af den første knude for at sikre fuldstændig obstruktion. Når urinlederen er bundet, skal du forsigtigt lukke de successive muskellag og derefter lukke maven helt. Luk den ydre hud med kirurgiske hæfteklammer.Til kirurgisk forberedelse skal du placere den bedøvede rotte med en indbygget venøs adgangslinje på siden med den barberede venstre flanke vendt fladt og lige på bordet. Sørg for, at rottens forpoter rører hinanden, ligesom bagpoterne. Når rotten er placeret, palperer du venstre flanke lige under ribbenene for at føle efter nyrerne og bestemme den naturlige position i maven, og tegn derefter en linje ved hjælp af en permanent markør langs det barberede område, der skærer nyrecentret i en næse-til-hale orientering.Brug et par tandpincet til at gribe og løfte huden opad og klemme den permanente markørlinje med et par hæmostater for at knuse den underliggende vaskulatur og forhindre blødning. Gentag proceduren for det tynde ydre muskellag for at minimere blødning. For at gøre det endelige snit af det tynde indre abdominale muskellag palperer nyrerne for at estimere størrelse og position og løfter det indre muskellag med et par tang og knus derefter en linje, der skærer huden over nyrerne med hæmostaterne, der er ca. 1/3 den anslåede størrelse af nyrerne.Mens du opretholder grebet om muskellaget med tangen, skal du foretage det endelige snit. Brug derefter tang i hver hånd til at gribe og holde nyrefedtet ved nyrernes nederste pol med en hånd-over-hånd-teknik, der arbejder nedad. At have et fast greb om fedtet med den ene hånd, træk fedtet og pres meget forsigtigt nyren gennem snittet.Hvis nyren ikke passerer igennem, skal du let udvide snittet. For at identificere de hvide blodlegemer eller WBC'er, der er anbragt i kapillærsløjferne, administreres Hoechst 33342 nuklear plet ved 8 mikrogram pr. kg rottevægt via en indbygget venøs adgangslinje. På mikroskopet skal du placere den udsatte nyre mod kanten af skålen med en let rotation, så mavesiden af nyren kommer i kontakt med dækslip, og den dorsale side vender væk fra kanten.For yderligere at minimere bevægelse skal du pakke to sterile 2-til-2 gazebind fugtet med saltvand mod den dorsale side af nyren, der forstærker kontakten mellem mavesiden af nyrerne til kanten. Når prøven er placeret, skal du se gennem mikroskopets okular under epifluorescensbelysning ved hjælp af en dual-pass rhodamin FITC-terning. Hvis der registreres en bevægelse i prøvepositionen, skal du foretage mindre justeringer ved at justere gazen, så den ikke skubber under nyrerne.Rul rotten lidt over, så brystkassen er længere væk fra fadet. Scan overfladen af nyrerne ved hjælp af epifluorescensbelysning og marker glomerulipositionerne ved hjælp af softwaren, der er forbundet med den motoriserede scenecontroller. For hver farvekanal under 2-fotonbelysning skal du tage et lavt 3D-volumen af den øverste del af hver markeret glomerulus for at tjene som baggrundsbillede.I visningsindstillingen for billedbehandlingssoftwaren skal du bruge en pseudofarvepalet til at visualisere de svage intensiteter af baggrundsfluorescensen af de glomerulære kapillærsløjfer. Brug et overfladisk blodkar som omdrejningspunkt og tilfør langsomt det fluorescerende Texas Red RAP serumalbumin eller TRRSA, mens du observerer stigningen og faldet af fluorescens på grund af den systemiske fordeling, indtil en intensitet i den peritubulære vaskulatur og kapillærsløjfer er lige under mætning. Efter 10 minutter erhverves 3D-volumener for alle markerede og afbildede glomeruli med 1 mikrometerintervaller.Find en passende beholder, enten en kapillærsløjfe eller en peritubulær beholder, og drej derefter billedet ved hjælp af funktionen Roter, da linjescanningsfunktionen i billedoptagelsessoftwaren kræver, at fartøjet er vinkelret. Når fartøjet er roteret og ligger fladt, skal du vælge XT-funktionen i menuen Acquisition og indstille den til at scanne 4.000 linjer. Linjen på tværs af fartøjet, der skal undersøges, anbringes med brændplanet ved segmentets maksimale diameter.Venstreklik derefter på det farvesammensatte billede, og vælg fanen Tag snapshot for at generere et referencebillede af det område, hvor linjescanningen blev taget. Klik straks på Start-knappen for at fange fartøjets linjescanning. Senere skal du importere linjescanningerne til billedbehandlingssoftwaren for at bestemme RBC-strømningshastigheden.Under rullemenuen Måling skal du åbne dialogboksen Vis områdestatistik og vælge værktøjet Enkeltlinjetegning for at tegne en linje, der matcher hældningen på RBC-skyggerne. Når du har noteret linjens bredde og højde, skal du bruge en ligning til at beregne hastigheden og derefter opnå et gennemsnit på fem beregninger for at rapportere hastigheden for hver linjescanning. Centrer en glomerulus i billeddannelsesfeltet, og tag et 3D-datasæt, der starter ved den glomerulære overflade og slutter ved 30 til 35 mikrometer.Brug en trinstørrelse på 1 mikrometer i Z-retningen. Identificer WBC'erne ved at sammenligne den blå Hoechst-kanal med Texas Red albumin-kanalen ved at lede efter udelukkelse af rødt farvestof i kapillærsløjfen og en tilsvarende atomplet. Hvis WBC'erne vises statiske over tre optiske sektioner, skal du definere cellerne som klæbede og derefter rapportere værdierne som forekomst pr. 10 optiske sektioner fra toppen af glomerulus taget med 1 mikrometerintervaller.Antallet af glomerulære pr. mark i München Wistar Fromter eller MWF rotter blev øget i 5-ugers UUO-gruppen end hos ubehandlede rotter. Sprague-Dawley rotter, eller SD rotter, gik fra at have ingen overflade glomeruli til 2,02 per felt efter fem uger af den ensidige ureteral obstruktion. Tredimensionelle rekonstruerede billeder blev observeret for at se nyreoverfladen.Den 5-ugers ensidige uretalobstruktion hos SD-rotterne resulterede ikke i områder, der lignede normal rørformet epitelia, som det ses i MWF, ubehandlet og delvist hos 5-ugers UUO MWF-rotter. I undersøgelsen af renal vaskulær dynamik blev nyreblodgennemstrømningen signifikant reduceret i 5-ugers UUO MWF- og SD-grupper sammenlignet med ubehandlede rotter. RBC-hastigheden inden for de glomerulære kapillærsløjfer blev signifikant reduceret i 5-ugers UUO MWF og SD-rotter sammenlignet med ubehandlede MWF-rotter.Derudover havde ubehandlede MWF-rotter færre WBC'er pr. 10 optiske sektioner fra toppen, mens antallet steg i 5-ugers UUO MWF og 5-ugers UUO SD-rotter. Med ensidig uretal obstruktion blev der set en stigning i albuminpermeabilitet. En albuminakkumulering inden for Bowman-rummet var intens efter ensidig uretal obstruktion.S1-segmentet endocytose store mængder albumin som observeret med fysiologiske tilstande hos ubehandlede MWF-rotter. Den samme optagelse kunne ikke ses hos MWF- eller SD-rotterne efter 5 ugers ensidig uretal obstruktion. Mange forskellige metoder såsom gentagen billeddannelse for at studere en proces over tid, fiksering af et specifikt område til billeddannelse og efterfølgende udnyttelse af det faste væv til at udføre mikroskopi med højere opløsning kan udføres i forbindelse med denne teknik.Teknikken betragtes som forstyrrende teknologi. Det er gjort muligt for efterforskere at besvare mange nye spørgsmål. Dermed er der givet ny indsigt, og der er opnået paradigmeskiftende data.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

En Contusive Model af Unilateral Cervikal Rygmarvsskader Brug af Uendelige Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantificering Glomerular fyldbarhed Fluorescent Macromolecules Brug 2-Photon mikroskopi i München Wistarrotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

En murin model af Irreversible og reversibel Ensidig ureteric Obstruktion

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mus Model af type 2 diabetes: Pancreas Islet Isolering og live-cell 2-Photon Imaging af intakte Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Ved hjælp af en Laminering teknik til at udføre Konfokal mikroskopi af det menneskelige Sclera


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analyse Gavnlige virkninger af kosttilskud på Intestinal epitelbarriere funktioner under Eksperimentel Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Nerve-besparende Mid-urethral obstruktion (NEMO) i kvindelige lille Gnavere

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Måling af virkningerne af bakterier og kemikalier på tarm permeabilitet af Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...