Name: using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 en P30DK079312 (aan B.A.M.). We bedanken het personeel van de Genomics Core Facility van de Research Technology Support Facility (RTSF) van de Michigan State University voor het uitvoeren van de Nanostring-analyse.

<ol>
	<li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Indiana+O'Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis.">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li><li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney:+a+micropuncture+study.">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology.">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats.">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li><li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex:+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains.">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li><li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+rat+homologue+of+podocin:+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli.">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice.">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li><li>Schie&#223;l, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+nephrons+in+BALB/c+and+C57BL/6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney.">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499 (2013).</li><li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction:+a+new+look+at+an+old+model.">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li><li>Yang, H. -. C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+kidney+disease.">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li><li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags.">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li><li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy.">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li><li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2.">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330 (2016).</li><li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model.">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li><li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die:+Is+there+any+cell+death+in+podocytes.">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li><li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease.">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte &amp; Blood Pressure E &amp; BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li><li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis.">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).</li><li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD.">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li><li>M&#252;hlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome.">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).</li><li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periostin:+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells.">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li><li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2/M.">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats.">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells:+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states.">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+bottom+and+using+it:+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy.">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674 (2014).</li><li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus:+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling.">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li><li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus.">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li><li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus.">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li><li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis.">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

De studie van glomerulaire fysiologie heeft veel verschillende benaderingen gezien, met name het gebruik van micropunctuur, perfusie van geïsoleerde glomeruli en microscopie. De beschikbaarheid van oppervlakteglomeruli in München Wistar-ratten, Fromter- en Simonsen-stammen heeft in vivo dynamische studies mogelijk gemaakt. Een belangrijke opmerking voor onderzoekers die deze technologie gebruiken, is de noodzaak om acquisitieparameters in te stellen om consistente beelden tussen studies te behouden, zodat de autofluorescentie in weefsel consistent blijft. Het gebruik van een dual-pass fluoresceïne / rhodamine epifluorescentiekubus en het aanpassen van de versterkingsinstellingen aan de groene en rode emissiekanalen om op het computerscherm na te bootsen wat door de oculairs wordt gezien, zorgt voor een consistente kleursignatuur in de autofluorescentie, zelfs tussen verschillende microscoopsystemen.
De Fromter-stam is op grote schaal gebruikt omdat het een verminderd aantal totale glomeruli heeft, ~ 75% normaal, en de mannen ontwikkelen spontaan hypertensie rond de leeftijd van 12 weken, met progressieve proteïnurie en daaropvolgende focale glomerulaire sclerose, uiteindelijk stervend aan nierfalen12. Het gebruik van deze ratten en de toevoeging van 2-fotonmicroscopie met zijn verminderde fototoxiciteit, verbeterde penetratiediepte en de mogelijkheid om meerdere fluorescerende sondes tegelijkertijd te bekijken, maakten de weg vrij voor nieuwe ontdekkingen 1,4,5. Met de ontwikkeling van computerhardware en -software zijn kwantitatieve gegevens nu de standaard voor alle 2-fotonlaboratoria. Meerdere kwantitatieve technieken zijn ontwikkeld en toegepast op glomerulaire, proximale tubuli, vasculaire en interstitiële processen onder fysiologische en ziekteomstandigheden 1,4,5,27,28,29,30.
Transgene muisgeneratiefaciliteiten voegden een nieuwe dimensie toe aan de studie van nierfysiologie en pathologie, en het was slechts een kwestie van tijd totdat dit werd gecombineerd met 2-fotonmicroscopie om het belang van specifieke genproducten in de nierstructuur en -functie verder af te bakenen. Muisglomeruli, behalve bij zeer jonge muizen, bevinden zich echter op meer dan 100 μm van het oppervlak van de nier9. Twee-fotonenmicroscopie kan het beste worden uitgevoerd op een diepte tussen 20 en 50 μm als resolutie, en de fluorescentie-intensiteit neemt daarna snel af als gevolg van lichtverstrooiing van uitgezonden licht en absorptie door interactie met hemoglobine. Daarom was het noodzakelijk om oppervlakteglomeruli te induceren. De meest gebruikte aanpak is een langdurig eenzijdig obstructiemodel gedurende 12 weken. Omdat deze modellen geen basislijnbepalingen mogelijk maken, is het niet mogelijk om de effecten van de UUO te scheiden van het proces dat wordt bestudeerd.
Met behulp van MWF-ratten kan men de glomerulaire functie vergelijken met die na UUO. Van dit UUO-model is bekend dat het ontstekingen en een snelle snelheid van fibrose induceert en is gebruikt om CKD en fibrose 10,11,12 te bestuderen. Zoals verwacht was er een toename van oppervlakteglomeruli bij zowel de MWF- als sd-ratten. Bovendien waren de kwantitatieve resultaten na de UUO voor de MWF- en SD-ratten zeer vergelijkbaar. De hier geregistreerde vermindering van de bloedstroom was eerder gemeld door microscopische gegevens na UUO te vergelijken met micropunctuurgegevens3. Het was ook bekend dat tubulaire en interstitiële histologie duidelijk is veranderd, en de PT's zijn meestal niet-functioneel, zoals hier gemeld, met een gebrek aan albumine-endocytose. De studies in figuur 2 en figuur 3 tonen een dramatische vermindering van de RBC-stroomsnelheid in glomerulaire en peritubulaire capillairen en verbeterde WBC-adhesie. De vermindering van de stroming is waarschijnlijk te wijten aan capillaire blokkade van WBC-adhesie en rouleauxformaties.
Om ontstekingen verder te evalueren, kwantificeerden we de albuminedoorlaatbaarheid en toonden we aan dat deze vertienvoudigde. Bovendien toonde geïsoleerde glomeruli aan dat de mRNA-expressie toenam voor veel genen waarvan eerder bekend was dat ze verhoogd waren bij nierontsteking in een verscheidenheid aan nierziektetoestanden 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . De toename van de glomerulaire oppervlaktedichtheid en albuminedoorlaatbaarheid waren progressief, zoals blijkt uit de 12-weekse UUO-gegevens. De huidige gegevens zijn de eerste die direct aantonen dat glomeruli aanzienlijke structurele schade, ontstekingen en moleculaire veranderingen ondergaan in het UUO-model. De resultaten komen overeen met een eerdere studie van volledig nierweefsel dat schapennierbiopten na UUO analyseerde en meerdere ontstekingsmarkers vond die19 verhoogden. De huidige resultaten wijzen erop dat er een duidelijke ontsteking bestaat in de glomeruli, voorheen alleen bekend om corticale weefsel.
De huidige gegevens verschillen van eerdere studies bij muizen waar geen veranderingen werden gevonden in adhesiemolecuulexpressie, complementafzetting en neutrofiele infiltratie tussen 12 weken posthydronefrrotische en normale glomeruli31. Daarnaast gebruikte het Hickey-laboratorium het 12 weken durende UUO-model om immuunreacties in glomeruli van muizen te bestuderen. Ze vonden geen verschillen in neutrofiele infiltratie tussen vier weken oude muisglomeruli en postobstructieve glomeruli32,33. Deze latere studies werden uitgevoerd nadat het bekken van de geblokkeerde nier was afgevoerd van urine. We hebben dit niet gedaan omdat we het effect van UUO op de glomerulaire functie wilden bepalen zoals het in vivo zou zijn, zonder kunstmatig de vloeistof te verwijderen die de obstructie veroorzaakt. Tot slot wordt het gebruik van UUO bij muizen vervangen door het in beeld brengen van glomeruli op meer dan 100 μm onder het oppervlak. Hoewel mogelijk, is er een afweging in resolutie en intensiteit, die beide aanzienlijk worden verminderd naarmate men verder gaat dan 50 μm34.
De gepresenteerde resultaten zijn niet verrassend als men de gegevens uit de bestaande literatuur over histologische veranderingen, vorming van atubulaire glomeruli, ontsteking, fibrose, hemodynamieksamenvoegt 10,11,12. De gepresenteerde gegevens, waaronder WBC-adhesie, rouleauxformaties, glomerulaire moleculaire ontstekingsmarkers en verhoogde albuminedoorlaatbaarheid, wijzen verder op de uitgebreide ontsteking die in dit UUO-model aan de gang is, zelfs na vijf weken en ook aanwezig is na twaalf weken. Het is duidelijk dat chronische UUO geen fysiologische toestand is en het gebruik van UUO om oppervlakteglomeruli te induceren vertegenwoordigt een verwondingsmodel. De MWF-ratten, die onder fysiologische omstandigheden oppervlakteglomeruli hebben, kunnen longitudinaal worden bestudeerd als er letsel optreedt. Het is mogelijk om transgene ratten te genereren en tal van onderzoekers maken ze met biosensoren om specifieke vragen te stellen. In het bijzonder heeft het Medical College of Wisconsin nu een kolonie MWF-ratten en heeft het transgene ratten gemaakt met als doel glomerulaire processen onder fysiologische en pathologische omstandigheden te bestuderen. Deze MWF-ratten bieden een geweldige kans om glomerulaire processen te bestuderen bij normale, zieke en genetisch veranderde ratten.

Het begrijpen van glomerulaire processen, met name podocytenbiologie, is al meer dan 50 jaar een doel. München Wistar-ratten met oppervlakteglomeruli hebben een centrale rol gespeeld in deze studies, waaronder micropunctuurstudies, om tal van aspecten van fysiologische en pathologische processen te begrijpen 1,2,3. Het gebruik van microscopie om glomerulaire componenten intravitaal te bestuderen was beperkt vanwege de effecten van fototoxiciteit tot de komst van 2-fotonmicroscopie die deze toxische blootstelling minimaliseerde en de penetratiediepte verhoogde 1,2. Samen met de snelle vooruitgang in computerhardware en -software, heeft dit het mogelijk gemaakt om urenlang driedimensionale (3D) en vierdimensionale (tijd) studies te doen in een enkele instelling 1,4,5.
De kwantificering van glomerulaire capillaire bloedstroom, vasoconstrictie en dilatatie als reactie op geneesmiddelen, permeabiliteit en de effecten van lading op permeabiliteit en ontsteking zijn slechts enkele van de glomerulaire processen die zijn bestudeerd. Bovendien is het S1-segment van de proximale tubulus identificeerbaar en kunnen de verschillen in het gedrag van S1- en S2-tubulair epitheel worden gekwantificeerd 1,4. Studies bij muizen, vooral met de universele beschikbaarheid van muistransgene faciliteiten, hebben geleid tot snelle vooruitgang in het begrip van de moleculaire biologie van glomerulaire ziekteprocessen. Individuele eiwitten zijn verantwoordelijk voor glomerulaire disfunctie in knock-outstudies, vooral met betrekking tot proteïnurie 6,7,8. Het gebruik van muismodellen voor glomerulaire beeldvormingsstudies is echter beperkt omdat glomeruli zich meer dan 100 μm onder het oppervlak bevinden in de talrijke bestudeerde stammen9.
Dit heeft ertoe geleid dat onderzoekers muismodellen hebben ontwikkeld en gebruikt die resulteren in oppervlakteglomeruli die kunnen worden bestudeerd. Het meest voorkomende model is het gebruik van complete UUO 10,11,12. Aan het einde van de verlengde UUO-periode zijn er tal van oppervlakteglomeruli in muizennieren die13,14 kunnen en zijn onderzocht. Er is geen baseline- of controlestudie geweest in deze muisstudies om de effecten van langdurige UUO op glomerulaire biologie te bepalen. Omdat dit een ernstig en langdurig model van letsel is dat resulteert in snelle fibrose en corticale vernietiging 10,11,12, veronderstelden we dat er effecten zouden zijn op glomerulaire processen en functie. Om deze vraag te beantwoorden, werden Munich Wistar Fromter (MWF) ratten met oppervlakteglomeruli gebruikt om controle / baselineparameters te bestuderen, en de baselinebevinding werd vergeleken met glomerulaire studies bij MWF-ratten na vijf weken UUO. We bestudeerden ook Sprague Dawley (SD) ratten die geen oppervlakteglomeruli hebben na UUO. De bevindingen geven aan dat 5 weken UUO bij MWF- en SD-ratten inderdaad het aantal oppervlakteglomeruli verhogen. Dit waren echter abnormale glomeruli met duidelijke veranderingen in de glomerulaire bloedstroom, ontsteking en macromolecuuldoorlaatbaarheid en -grootte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Note: Version 7.1r1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Dissecting Scissors</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 78180-1C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph Image processing Software</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>Cat# 78266-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corportation</td>
			<td>2007 version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reptitherm Undertank Heater</td>
			<td>Zoomed</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11-889-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 70665-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes

Het toepassen van nieuwe microscopiemethoden op geschikte dierziektemodellen om de dynamische fysiologie van de nier te verkennen, blijft een uitdaging. Ratten met oppervlakteglomeruli bieden een unieke kans om fysiologische en pathofysiologische processen te onderzoeken met behulp van intravitale 2-fotonenmicroscopie. Kwantificering van glomerulaire capillaire bloedstroom en vasoconstrictie en dilatatie als reactie op geneesmiddelen, permeabiliteit en ontsteking zijn slechts enkele van de processen die kunnen worden bestudeerd. Bovendien bieden transgene ratten, d.w.z. podocyten gelabeld met fluorescerende kleurstoffen en andere moleculaire biomarkerbenaderingen, een verhoogde resolutie om eiwit-eiwitinteracties en de effecten van specifieke moleculaire veranderingen direct te monitoren en te kwantificeren.
Bij muizen, die na vier weken geen oppervlakteglomeruli meer hebben, is unilaterale ureterale obstructie (UUO) gedurende enkele weken gebruikt om oppervlakteglomeruli te induceren. Omdat dit inductiemodel geen basisstudies mogelijk maakt, hebben we de effecten van UUO op glomerulaire processen gekwantificeerd in het UUO-model in München Wistar Frömter (MWF) ratten, die onder fysiologische omstandigheden oppervlakteglomeruli hebben. Het UUO-model gedurende vijf weken of langer veroorzaakte significante veranderingen in de bruto renale morfologie, de peritubulaire en glomerulaire microvasculatuur, evenals de structuur en functie van tubulaire epithelia. De stroom van glomerulaire en peritubulaire rode bloedcellen (RBC) nam significant af (p < 0,01), waarschijnlijk als gevolg van de significante toename van de hechting van witte bloedcellen (WBC's) in glomerulaire en peritubulaire haarvaten. De glomerulaire zeefcoëfficiënt van albumine steeg van 0,015 ± 0,002 in onbehandelde MWF's tot 0,045 ± 0,05 bij 5 weken oude UUO MWF-ratten. Twaalf weken UUO resulteerden in verdere toename van de glomerulaire oppervlaktedichtheid en glomerulaire zeefcoëfficiënt (GSC) voor albumine. Fluorescerend albumine gefilterd over de glomeruli werd niet opnieuw geabsorbeerd door de proximale tubuli. Deze gegevens suggereren dat het gebruik van UUO om oppervlakteglomeruli te induceren het vermogen beperkt om normale glomerulaire processen en ziekteveranderingen te bestuderen en te interpreteren.

Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Hier presenteren we een protocol met behulp van 2-fotonmicroscopie in München Wistar Fromter-ratten met oppervlakteglomeruli om de effecten van langdurige ureterale obstructie op glomerulaire dynamiek en functie te kwantificeren.

2-fotonenmicroscopie gebruiken om de effecten van chronische unilaterale ureterale obstructie op glomerulaire processen te kwantificeren

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

In de gegevens die in deze studie worden gepresenteerd, tonen de dramatische effecten van unilaterale ureterale obstructie op de nierfunctie, ontsteking en fibrose. Het helpt ons om de pathofysiologische mechanismen van unilaterale ureterale obstructie te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om cel-celinteracties, subcellulaire gebeurtenissen te bestuderen en structuur en functie op een dynamische manier te associëren binnen een functionerende nier.Het demonstreren van de ureterale procedure zal worden gedaan door Dr.Silvia Campos-Bilderback, een chirurg in ons laboratorium. Verdoof de rat om te beginnen, maak vervolgens een incisie langs de middellijn en lokaliseer de linker nier om deze te scheiden van de omliggende peritoneale organen. Na het lokaliseren van de nierpikel, bestaande uit de nierslagader, nierader en urineleider, scheidt u de urineleider zonder de delicate structuur te beschadigen.Gebruik een tang om een 3-0 hechting rond de urineleider te lusen en bind vervolgens een knoop van een paar millimeter aan weerszijden van de eerste knoop om volledige obstructie te garanderen. Zodra de urineleider is vastgebonden, sluit u voorzichtig de opeenvolgende spierlagen en sluit u de buik volledig. Sluit de buitenste huid met chirurgische nietjes.Voor chirurgische voorbereiding plaatst u de verdoofde rat met een inwonende veneuze toegangslijn aan de zijkant met de geschoren linkerflank plat en recht op de tafel gericht. Zorg ervoor dat de voorpoten van de rat elkaar raken, net als de achterpoten. Zodra de rat is gepositioneerd, palpeer je de linkerflank net onder de ribben om voor de nier te voelen en de natuurlijke positie in de buik te bepalen, trek dan een lijn met behulp van een permanente marker langs het geschoren gebied, waarbij het niercentrum in een neus-tot-staart oriëntatie wordt doorsneden.Gebruik een getande tang om de huid vast te pakken en op te tillen en knijp de permanente markerlijn samen met een paar hemostaten om de onderliggende vasculatuur te verpletteren en bloedingen te voorkomen. Herhaal de procedure voor de dunne buitenste spierlaag om bloedingen te minimaliseren. Om de uiteindelijke incisie van de dunne binnenste buikspierlaag te maken, palpeert u de nier om de grootte en positie te schatten en tilt u de binnenste spierlaag op met een tang, en verplettert u vervolgens een lijn die de huid boven de nier doorsnijdt met de hemostaten die ongeveer 1/3 van de geschatte grootte van de nier is.Terwijl u de grip op de spierlaag met de tang behoudt, maakt u de laatste incisie. Gebruik vervolgens een tang in elke hand om het niervet aan de onderkant van de nier vast te pakken en vast te houden met een hand-over-handtechniek die naar beneden werkt. Met één hand stevig grip op het vet, trek je aan het vet en knijp je heel voorzichtig de nier door de incisie.Als de nier niet doorgaat, verbreedt u de incisie gemakkelijk. Om de witte bloedcellen of WBC's in de capillaire lussen te identificeren, dient u Hoechst 33342 kernvlek toe met 8 microgram per kilogram rattengewicht via een inwonende veneuze toegangslijn. Plaats op de microscoop de blootgestelde nier met een lichte rotatie tegen de rand van de schaal, zodat de buikzijde van de nier contact maakt met de afdekslip en de dorsale kant weg van de rand is gericht.Om de beweging verder te minimaliseren, pak je twee steriele 2-bij-2 gaasjes in, bevochtigd met zoutoplossing tegen de dorsale kant van de nier, waardoor het contact van de buikzijde van de nier tot aan de rand wordt versterkt. Wanneer het monster is gepositioneerd, kijkt u door het microscoopoculair onder epifluorescentieverlichting met behulp van een dual-pass rhodamine FITC-kubus. Als er een beweging wordt gedetecteerd in de monsterpositie, breng dan kleine aanpassingen aan door het gaas aan te passen zodat het niet onder de nier duwt.Rol de rat iets om zodat de thorax verder van de schaal af staat. Scan het oppervlak van de nier met behulp van epifluorescentieverlichting en markeer de glomeruliposities met behulp van de software die is gekoppeld aan de gemotoriseerde podiumcontroller. Neem voor elk kleurkanaal onder 2-fotonverlichting een ondiep 3D-volume van het bovenste gedeelte van elke gemarkeerde glomerulus om als achtergrondafbeelding te dienen.Gebruik in de weergaveoptie van de beeldvormingssoftware een pseudo-kleurenpalet om de zwakke intensiteiten van de achtergrondfluorescentie van de glomerulaire capillaire lussen te visualiseren. Gebruik een oppervlakkig bloedvat als brandpunt en infundeer langzaam het fluorescerende Texas Red RAP-serumalbumine of TRRSA terwijl u de opkomst en ondergang van fluorescentie als gevolg van de systemische distributie observeert totdat een intensiteit in de peritubulaire vasculatuur en capillaire lussen net onder de verzadiging ligt. Verkrijg na 10 minuten 3D-volumes voor alle gemarkeerde en afgebeelde glomeruli met intervallen van 1 micrometer.Zoek een geschikt vat, een capillaire lus of een peritubulair vat, en roteer vervolgens het beeld met behulp van de functie Roteren, omdat de functie Line Scan in de beeldacquisitiesoftware vereist dat het vat loodrecht staat. Zodra het vat is gedraaid en plat ligt, selecteert u de XT-functie in het menu Acquisitie en stelt u deze in om 4.000 lijnen te scannen. Plaats de lijn over het te onderzoeken vat met het brandpuntsvlak op de maximale diameter van het segment.Klik vervolgens met de linkermuisknop op de samengestelde kleurenafbeelding en selecteer het tabblad Momentopname maken om een referentieafbeelding te genereren van het gebied waar de lijnscan is gemaakt. Klik onmiddellijk op de knop Start om de lijnscan van het schip vast te leggen. Importeer later de lijnscans in de beeldverwerkingssoftware om het RBC-debiet te bepalen.Open in het vervolgkeuzemenu Meten het dialoogvenster Regiostatistieken weergeven en selecteer het gereedschap Tekening met één lijn om een lijn te tekenen die overeenkomt met de helling van de RBC-schaduwen. Nadat u de breedte en hoogte van de lijn hebt genoteerd, gebruikt u een vergelijking om de snelheid te berekenen en vervolgens een gemiddelde van vijf berekeningen te verkrijgen om de snelheid voor elke lijnscan te rapporteren. Centreer een glomerulus in het beeldvormingsveld en neem een 3D-dataset die begint bij het glomerulaire oppervlak en eindigt bij 30 tot 35 micrometer.Gebruik een stapgrootte van 1 micrometer in de Z-richting. Identificeer de WBC's door het blauwe Hoechst-kanaal te vergelijken met het Texas Red-albuminekanaal door te zoeken naar uitsluiting van rode kleurstof in de capillaire lus en een overeenkomstige nucleaire vlek. Als de WBC's statisch lijken over drie optische secties, definieert u de cellen als gehecht en rapporteert u de waarden als voorkomend per 10 optische secties vanaf de bovenkant van de glomerulus genomen met intervallen van 1 micrometer.Het aantal glomerulaire per veld in München Wistar Fromter- of MWF-ratten was verhoogd in de 5-weekse UUO-groep dan in onbehandelde ratten. Sprague-Dawley-ratten, of SD-ratten, gingen van geen oppervlakteglomeruli naar 2,02 per veld na vijf weken van de unilaterale ureterale obstructie. Driedimensionale gereconstrueerde beelden werden waargenomen om het nieroppervlak te bekijken.De unilaterale uretale obstructie van 5 weken bij de SD-ratten resulteerde niet in gebieden die leken op normale buisvormige epithelia zoals gezien in de MWF, onbehandeld en gedeeltelijk bij 5-weekse UUO MWF-ratten. In de studie van de renale vasculaire dynamica was de renale bloedstroom significant verminderd in de 5-weekse UUO MWF- en SD-groepen in vergelijking met onbehandelde ratten. De RBC-snelheid binnen de glomerulaire capillaire lussen was significant afgenomen bij de 5-weekse UUO MWF en SD-ratten in vergelijking met onbehandelde MWF-ratten.Bovendien hadden onbehandelde MWF-ratten minder WBC's per 10 optische secties vanaf de top, terwijl het aantal toenam in 5-weekse UUO MWF- en 5-weekse UUO SD-ratten. Bij unilaterale uretale obstructie werd een toename van de albuminedoorlaatbaarheid waargenomen. Een albumine accumulatie in de Bowman ruimte was intens na unilaterale uretal obstructie.Het S1-segment endocytose grote hoeveelheden albumine zoals waargenomen met fysiologische omstandigheden bij onbehandelde MWF-ratten. Dezelfde opname kon niet worden gezien bij de MWF- of SD-ratten na 5 weken unilaterale uretale obstructie. Veel verschillende methoden zoals herhaalde beeldvorming om een proces in de loop van de tijd te bestuderen, fixatie van een specifiek gebied voor beeldvorming en vervolgens gebruik van het vaste weefsel om microscopie met een hogere resolutie uit te voeren, kunnen in combinatie met deze techniek worden gedaan.De techniek wordt beschouwd als disruptieve technologie. Het stelt onderzoekers in staat om veel nieuwe vragen te beantwoorden. Daarbij zijn nieuwe inzichten verschaft en paradigmaverschuivingsgegevens verkregen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Een Contusive model van eenzijdige cervicale ruggenmerg letsel met behulp van de Oneindige Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

Een muizenmodel van reversibele en irreversibele Eenzijdige Ureteric Obstructie

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Met behulp van een lamineren techniek om te presteren confocale microscopie van de Human Sclera


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Het analyseren van gunstige effecten van voedingssupplementen op darmepitheel Barrier Functies tijdens de Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Zenuwsparende Mid-urethraobstructie (Nemo) in vrouwelijke kleine knaagdieren

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Meten van de effecten van bacteriën en chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen