Name: using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 und P30DK079312 (an B.A.M.) unterstützt. Wir danken den Mitarbeitern der Genomics Core Facility der Research Technology Support Facility (RTSF) der Michigan State University für die Durchführung der Nanostring-Analyse.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Das Studium der glomerulären Physiologie hat viele verschiedene Ansätze gesehen, vor allem die Verwendung von Mikropunktion, Perfusion von isolierten Glomeruli und Mikroskopie. Die Verfügbarkeit von Oberflächenglomeruli in München Wistar-Ratten, Fromter- und Simonsen-Stämmen hat dynamische In-vivo-Studien ermöglicht. Ein wichtiger Hinweis für Forscher, die diese Technologie anwenden, ist die Notwendigkeit, Aufnahmeparameter festzulegen, um konsistente Bilder zwischen den Studien zu erhalten, damit die Autofluoreszenz im Gewebe konsistent bleibt. Die Verwendung eines Dual-Pass-Fluorescein/Rhodamin-Epifluoreszenzwürfels und die Anpassung der Verstärkungseinstellungen an die grünen und roten Emissionskanäle, um auf dem Computerbildschirm nachzuahmen, was durch die Okulare gesehen wird, gewährleistet eine konsistente Farbsignatur in der Autofluoreszenz auch zwischen verschiedenen Mikroskopsystemen.
Der Fromter-Stamm wurde ausgiebig verwendet, da er eine reduzierte Anzahl von Gesamtglomeruli aufweist, ~ 75% normal, und die Männchen entwickeln spontan Bluthochdruck im Alter von etwa 12 Wochen, mit progressiver Proteinurie und anschließender fokaler glomerulärer Sklerose, die schließlich an Nierenversagen sterben12. Die Verwendung dieser Ratten und die Zugabe der 2-Photonenmikroskopie mit ihrer reduzierten Phototoxizität, der verbesserten Eindringtiefe und der Möglichkeit, mehrere fluoreszierende Sonden gleichzeitig zu betrachten, ebneten den Weg für neue Entdeckungen 1,4,5. Mit der Entwicklung von Computerhardware und -software sind quantitative Daten heute der Standard für alle 2-Photonen-Labore. Mehrere quantitative Techniken wurden entwickelt und auf glomeruläre, proximale Tubulus, vaskuläre und interstitielle Prozesse unter physiologischen und Krankheitsbedingungenangewendet 1,4,5,27,28,29,30.
Transgene Mauserzeugungsanlagen fügten dem Studium der Nierenphysiologie und -pathologie eine neue Dimension hinzu, und es war nur eine Frage der Zeit, bis dies mit der 2-Photonenmikroskopie kombiniert wurde, um die Bedeutung spezifischer Genprodukte für die Nierenstruktur und -funktion weiter abzugrenzen. Glomeruli der Maus befinden sich jedoch, außer bei sehr jungen Mäusen, über 100 μm von der Oberfläche der Niereentfernt 9. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie wird am besten in einer Tiefe zwischen 20 und 50 μm als Auflösung durchgeführt, und die Fluoreszenzintensität nimmt danach aufgrund der Lichtstreuung des emittierten Lichts und der Absorption durch Wechselwirkung mit Hämoglobin schnell ab. Daher war es notwendig, Oberflächenglomeruli zu induzieren. Der üblicherweise verwendete Ansatz ist ein verlängertes einseitiges Obstruktionsmodell für 12 Wochen. Da diese Modelle keine Baseline-Bestimmungen zulassen, ist eine Trennung der Wirkungen von UUO vom untersuchten Prozess nicht möglich.
Unter Verwendung von MWF-Ratten kann man die glomeruläre Baseline-Funktion mit der folgenden UUO vergleichen. Dieses UUO-Modell ist dafür bekannt, Entzündungen und eine schnelle Fibroserate zu induzieren und wurde verwendet, um CKD und Fibrose zu untersuchen10,11,12. Wie erwartet, gab es sowohl bei den MWF- als auch bei den SD-Ratten eine Zunahme der Oberflächenglomeruli. Darüber hinaus waren die quantitativen Ergebnisse, die nach UUO für die MWF- und SD-Ratten erzielt wurden, sehr vergleichbar. Die hier aufgezeichnete Verringerung des Blutflusses wurde zuvor berichtet, indem mikroskopische Daten nach UUO mit Mikropunktionsdaten verglichen wurden3. Es war auch bekannt, dass die tubuläre und interstitielle Histologie deutlich verändert ist und die PTs meist nicht-funktional sind, wie hier berichtet, mit einem Mangel an Albumin-Endozytose. Die Studien in Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen eine dramatische Verringerung der RBC-Flussrate in glomerulären und peritubulären Kapillaren und eine verbesserte Leukozytenadhäsion. Die Verringerung der Strömung ist wahrscheinlich auf Kapillarblockaden durch Leukozytenadhäsion und Rouleaux-Formationen zurückzuführen.
Um die Entzündung weiter zu bewerten, quantifizierten wir die Albuminpermeabilität und zeigten, dass sie sich verzehnfacht. Darüber hinaus zeigten isolierte Glomeruli, dass die mRNA-Expression für viele Gene zunahm, von denen bisher bekannt war, dass sie bei Nierenentzündungen in einer Vielzahl von Nierenerkrankungszuständen erhöht waren 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Die Zunahme der glomerulären Oberflächendichte und der Albuminpermeabilität war progressiv, wie die 12-Wochen-UUO-Daten zeigen. Die vorliegenden Daten sind die ersten, die direkt zeigen, dass Glomeruli signifikante strukturelle Schäden, Entzündungen und molekulare Veränderungen im UUO-Modell erfahren. Die Ergebnisse stimmen mit einer früheren Studie des gesamten Nierengewebes überein, die Nierenbiopsien von Schafen nach UUO analysierte und mehrere Entzündungsmarker mit erhöhten19 fand. Die vorliegenden Ergebnisse deuten auf eine ausgeprägte Entzündung innerhalb der Glomeruli hin, die bisher nur für kortikales Gewebe bekannt waren.
Die vorliegenden Daten unterscheiden sich von früheren Studien an Mäusen, bei denen keine Veränderungen in der Adhäsionsmolekülexpression, Komplementablagerung und Neutrophileninfiltration zwischen 12-wöchigen posthydronephrotischen und normalen Glomeruli gefunden wurden31. Darüber hinaus verwendete das Hickey-Labor das 12-wöchige UUO-Modell, um Immunreaktionen in Glomeruli von Mäusen zu untersuchen. Sie fanden keine Unterschiede in der Neutrophileninfiltration zwischen vier Wochen alten Glomeruli der Maus und postobstruktiven Glomeruli32,33. Diese späteren Studien wurden durchgeführt, nachdem das Becken der verstopften Niere vom Urin befreit wurde. Wir haben dies nicht getan, da wir die Wirkung von UUO auf die glomeruläre Funktion in vivo bestimmen wollten, ohne die Flüssigkeit, die die Obstruktion verursacht, künstlich zu entfernen. Schließlich wird die Verwendung von UUO bei Mäusen durch die Bildgebung von Glomeruli bei mehr als 100 μm unter der Oberfläche ersetzt. Obwohl möglich, gibt es einen Kompromiss zwischen Auflösung und Intensität, die beide signifikant reduziert werden, wenn man über 50 μm34 hinausgeht.
Die vorgestellten Ergebnisse sind nicht überraschend, wenn man die Daten aus der vorhandenen Literatur zu histologischen Veränderungen, Bildung von atubulären Glomeruli, Entzündungen, Fibrose, Hämodynamik zusammenfügt10,11,12. Die vorgestellten Daten, einschließlich Leukozytenadhäsion, Rouleaux-Formationen, glomerulären molekularen Entzündungsmarkern und erhöhter Albuminpermeabilität, deuten weiter auf die ausgedehnte Entzündung hin, die in diesem UUO-Modell auch nach fünf Wochen andauert und auch nach zwölf Wochen vorhanden ist. Es ist klar, dass chronische UUO kein physiologischer Zustand ist, und die Verwendung von UUO zur Induktion von Oberflächenglomeruli stellt ein Verletzungsmodell dar. Die MWF-Ratten, die unter physiologischen Bedingungen oberflächliche Glomeruli aufweisen, können longitudinal untersucht werden, wenn eine Verletzung auftritt. Es ist möglich, transgene Ratten zu erzeugen, und zahlreiche Forscher erzeugen sie mit Biosensoren, um spezifische Fragen zu stellen. Insbesondere das Medical College of Wisconsin hat jetzt eine Kolonie von MWF-Ratten und hat transgene Ratten hergestellt, um glomeruläre Prozesse unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Diese MWF-Ratten bieten eine großartige Gelegenheit, glomeruläre Prozesse bei normalen, kranken und genetisch veränderten Ratten zu untersuchen.

Das Verständnis glomerulärer Prozesse, insbesondere der Podozytenbiologie, ist seit über 50 Jahren ein Ziel. Munich Wistar-Ratten mit Oberflächenglomeruli haben in diesen Studien, einschließlich Mikropunktionsstudien, eine zentrale Rolle gespielt, um zahlreiche Aspekte physiologischer und pathologischer Prozesse zu verstehen 1,2,3. Die Verwendung der Mikroskopie zur intravitalen Untersuchung glomerulärer Komponenten war aufgrund der Auswirkungen der Phototoxizität bis zum Aufkommen der 2-Photonenmikroskopie, die diese toxische Exposition minimierte und die Eindringtiefe erhöhte 1,2, begrenzt. Zusammen mit den rasanten Fortschritten in der Computerhardware und -software hat dies dreidimensionale (3D) und vierdimensionale (Zeit) Studien für Stunden in einer einzigen Einstellung ermöglicht 1,4,5.
Die Quantifizierung des glomerulären kapillaren Blutflusses, Vasokonstriktion und Dilatation als Reaktion auf Medikamente, Permeabilität und die Auswirkungen von Ladung auf Permeabilität und Entzündung sind nur einige der glomerulären Prozesse, die untersucht wurden. Darüber hinaus ist das S1-Segment des proximalen Tubulus identifizierbar, und die Unterschiede im Verhalten von S1- und S2-Röhrenepithel können quantifiziert werden 1,4. Studien an Mäusen, insbesondere mit der universellen Verfügbarkeit transgener Einrichtungen der Maus, haben zu schnellen Fortschritten im Verständnis der Molekularbiologie glomerulärer Krankheitsprozesse geführt. Einzelne Proteine sind in Knockout-Studien für glomeruläre Dysfunktion verantwortlich, insbesondere im Hinblick auf Proteinurie 6,7,8. Die Verwendung von Mausmodellen für glomeruläre Bildgebungsstudien war jedoch begrenzt, da Glomeruli in den zahlreichen untersuchten Stämmen mehr als 100 μm unter der Oberfläche liegen9.
Dies hat die Forscher dazu veranlasst, Mausmodelle zu entwickeln und zu verwenden, was zu Oberflächenglomeruli führt, die untersucht werden können. Das gebräuchlichste Modell ist die Verwendung von vollständigem UUO10,11,12. Am Ende der verlängerten UUO-Periode gibt es zahlreiche Oberflächenglomeruli in Mäusenieren, die untersucht werden können und wurden13,14. Es gab keine Baseline- oder Kontrollstudie in diesen Mausstudien, um die Auswirkungen einer verlängerten UUO auf die glomeruläre Biologie zu bestimmen. Da es sich um ein schweres und anhaltendes Verletzungsmodell handelt, das zu einer schnellen Fibrose und kortikalen Zerstörung führt10,11,12, stellten wir die Hypothese auf, dass es Auswirkungen auf glomeruläre Prozesse und Funktionen geben würde. Um diese Frage zu beantworten, wurden Munich Wistar Fromter (MWF) Ratten mit Oberflächenglomeruli verwendet, um Kontroll-/Baseline-Parameter zu untersuchen, und der Baseline-Befund wurde mit glomerulären Studien an MWF-Ratten nach fünf Wochen UUO verglichen. Wir untersuchten auch Sprague Dawley (SD) Ratten, die nach UUO keine Oberflächenglomeruli haben. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass 5 Wochen UUO bei MWF- und SD-Ratten tatsächlich die Anzahl der Oberflächenglomeruli erhöhen. Dies waren jedoch abnormale Glomeruli mit deutlichen Veränderungen des glomerulären Blutflusses, der Entzündung und der Permeabilität und Größe von Makromolekülen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Note: Version 7.1r1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Dissecting Scissors</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 78180-1C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph Image processing Software</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>Cat# 78266-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corportation</td>
			<td>2007 version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reptitherm Undertank Heater</td>
			<td>Zoomed</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11-889-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 70665-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes

Die Anwendung neuartiger Mikroskopiemethoden auf geeignete Tierkrankheitsmodelle zur Erforschung der dynamischen Physiologie der Niere bleibt eine Herausforderung. Ratten mit Oberflächenglomeruli bieten eine einzigartige Möglichkeit, physiologische und pathophysiologische Prozesse mittels intravitaler 2-Photonenmikroskopie zu untersuchen. Die Quantifizierung des glomerulären kapillaren Blutflusses und die Vasokonstriktion und -dilatation als Reaktion auf Medikamente, Permeabilität und Entzündung sind nur einige der Prozesse, die untersucht werden können. Darüber hinaus bieten transgene Ratten, d.h. Podozyten, die mit Fluoreszenzfarbstoffen und anderen molekularen Biomarkeransätzen markiert sind, eine erhöhte Auflösung, um Protein-Protein-Interaktionen und die Auswirkungen spezifischer molekularer Veränderungen direkt zu überwachen und zu quantifizieren.
Bei Mäusen, denen nach einem Alter von vier Wochen Oberflächenglomeruli fehlen, wurde die einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) für mehrere Wochen verwendet, um Oberflächenglomeruli zu induzieren. Da dieses Induktionsmodell keine Baseline-Studien zulässt, quantifizierten wir die Auswirkungen von UUO auf glomeruläre Prozesse im UUO-Modell in München Wistar Frömter (MWF) Ratten, die unter physiologischen Bedingungen Oberflächenglomeruli aufweisen. Das UUO-Modell für fünf Wochen oder länger induzierte signifikante Veränderungen der groben Nierenmorphologie, der peritubulären und glomerulären Mikrovaskulatur sowie der Struktur und Funktion tubulärer Epithelien. Der Fluss der glomerulären und peritubulären roten Blutkörperchen (RBC) nahm signifikant ab (p < 0,01), wahrscheinlich aufgrund der signifikanten Zunahme der Adhärenz weißer Blutkörperchen (WBCs) in glomerulären und peritubulären Kapillaren. Der glomeruläre Siebkoeffizient von Albumin stieg von 0,015 ± 0,002 in unbehandelten MWFs auf 0,045 ± 0,05 bei 5 Wochen alten UUO-MWF-Ratten. Zwölf Wochen UUO führten zu einem weiteren Anstieg der glomerulären Oberflächendichte und des glomerulären Siebkoeffizienten (GSC) für Albumin. Fluoreszierendes Albumin, das über die Glomeruli gefiltert wurde, wurde von den proximalen Tubuli nicht resorbiert. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Verwendung von UUO zur Induktion von Oberflächenglomeruli die Fähigkeit einschränkt, normale glomeruläre Prozesse und Krankheitsveränderungen zu untersuchen und zu interpretieren.

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Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Fromter Ratten mit Oberflächenglomeruli, um die Auswirkungen einer verlängerten Harnleiterobstruktion auf die glomeruläre Dynamik und Funktion zu quantifizieren.

Mit der 2-Photonen-Mikroskopie die Auswirkungen einer chronischen einseitigen Harnleiterobstruktion auf glomeruläre Prozesse quantifizieren

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

In den in dieser Studie vorgestellten Daten zeigen die dramatischen Auswirkungen einer einseitigen Harnleiterobstruktion auf Nierenfunktion, Entzündung und Fibrose. Es hilft uns, die pathophysiologischen Mechanismen der einseitigen Harnleiterobstruktion zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Zell-Zell-Interaktionen, subzelluläre Ereignisse zu untersuchen und Struktur und Funktion dynamisch innerhalb einer funktionierenden Niere zu assoziieren.Die Demonstration des Harnleiterverfahrens wird von Dr. Silvia Campos-Bilderback durchgeführt, die Chirurgin in unserem Labor ist. Um zu beginnen, betäuben Sie die Ratte, machen Sie dann einen Schnitt entlang der Mittellinie und lokalisieren Sie die linke Niere, um sie von den umgebenden Peritonealorganen zu trennen. Nach der Lokalisierung des Nierenstiels, bestehend aus Nierenarterie, Nierenvene und Harnleiter, trennen Sie den Harnleiter, ohne die empfindliche Struktur zu beschädigen.Verwenden Sie eine Pinzette, um eine 3-0-Naht um den Harnleiter zu schlingen und zu binden, und binden Sie dann einen Knoten ein paar Millimeter auf beiden Seiten des ersten Knotens, um eine vollständige Obstruktion zu gewährleisten. Sobald der Harnleiter gebunden ist, schließen Sie vorsichtig die aufeinanderfolgenden Muskelschichten und schließen Sie dann den Bauch vollständig. Verschließen Sie die Außenhaut mit chirurgischen Klammern.Zur chirurgischen Vorbereitung legen Sie die anästhesierte Ratte mit einer venösen Zugangslinie auf die Seite, wobei die rasierte linke Flanke flach und gerade auf den Tisch zeigt. Stellen Sie sicher, dass sich die Vorderpfoten der Ratte berühren, ebenso wie die hinteren Pfoten. Sobald die Ratte positioniert ist, tasten Sie die linke Flanke direkt unter den Rippen ab, um nach der Niere zu tasten und die natürliche Position im Bauch zu bestimmen, dann zeichnen Sie eine Linie mit einem permanenten Marker entlang des rasierten Bereichs und halbieren Sie das Nierenzentrum in einer Nase-zu-Schwanz-Ausrichtung.Verwenden Sie eine Zahnzange, um die Haut zu greifen und nach oben zu heben und die permanente Markerlinie mit einem Paar Hämostaten einzuklemmen, um das darunter liegende Gefäßsystem zu zerquetschen und Blutungen zu verhindern. Wiederholen Sie den Vorgang für die dünne äußere Muskelschicht, um Blutungen zu minimieren. Um den letzten Schnitt der dünnen inneren Bauchmuskelschicht zu machen, tasten Sie die Niere ab, um die Größe und Position abzuschätzen und die innere Muskelschicht mit einer Pinzette anzuheben, dann zerquetschen Sie eine Linie, die die Haut über der Niere mit den Hämostaten halbiert, die etwa 1/3 der geschätzten Größe der Niere ist.Während Sie den Griff auf der Muskelschicht mit der Pinzette beibehalten, machen Sie den letzten Einschnitt. Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette in jeder Hand, um das Nierenfett am unteren Pol der Niere mit einer Hand-über-Hand-Technik nach unten zu greifen und zu halten. Wenn Sie das Fett mit einer Hand fest im Griff haben, ziehen Sie das Fett und drücken Sie die Niere sehr sanft durch den Einschnitt.Wenn die Niere nicht durchgeht, erweitern Sie leicht den Einschnitt. Um die weißen Blutkörperchen oder Leukozyten in den Kapillarschleifen zu identifizieren, verabreichen Sie Hoechst 33342 Kernfärbung bei 8 Mikrogramm pro Kilogramm Rattengewicht über eine verweilvenöse Zugangsleitung. Legen Sie die freiliegende Niere auf dem Mikroskop mit einer leichten Drehung gegen den Rand der Schale, so dass die Bauchseite der Niere den Deckschlitz berührt und die dorsale Seite vom Rand abgewandt ist.Um die Bewegung weiter zu minimieren, packen Sie zwei sterile 2-mal-2-Mullbinden, die mit Kochsalzlösung gegen die dorsale Seite der Niere angefeuchtet sind, um den Kontakt der Bauchseite der Niere zum Rand zu verstärken. Wenn die Probe positioniert ist, schauen Sie durch das Mikroskopokular unter Epifluoreszenzbeleuchtung mit einem Dual-Pass-Rhodamin-FITC-Würfel. Wenn eine Bewegung in der Probenposition erkannt wird, nehmen Sie geringfügige Anpassungen vor, indem Sie die Gaze anpassen, um sicherzustellen, dass sie nicht unter die Niere drückt.Rollen Sie die Ratte leicht um, so dass der Thorax weiter von der Schale entfernt ist. Scannen Sie die Oberfläche der Niere mit Epifluoreszenzbeleuchtung und markieren Sie die Glomeruli-Positionen mit der Software, die dem motorisierten Bühnenregler zugeordnet ist. Nehmen Sie für jeden Farbkanal unter 2-Photonen-Beleuchtung ein flaches 3D-Volumen des oberen Teils jedes markierten Glomerulus, das als Hintergrundbild dient.Verwenden Sie in der Anzeigeoption der Bildgebungssoftware eine Pseudofarbpalette, um die schwachen Intensitäten der Hintergrundfluoreszenz der glomerulären Kapillarschleifen zu visualisieren. Verwenden Sie ein oberflächliches Blutgefäß als Brennpunkt, infundieren Sie langsam das fluoreszierende Texas Red RAP Serumalbumin oder TRRSA, während Sie den Anstieg und Abfall der Fluoreszenz aufgrund der systemischen Verteilung beobachten, bis eine Intensität im peritubulären Gefäßsystem und in den Kapillarschleifen knapp unter der Sättigung liegt. Nach 10 Minuten erfassen Sie 3D-Volumen für alle markierten und abgebildeten Glomeruli in Abständen von 1 Mikrometer.Suchen Sie ein geeignetes Gefäß, entweder eine Kapillarschleife oder ein peritubuläres Gefäß, und drehen Sie das Bild dann mit der Funktion Drehen, da die Zeilenscanfunktion in der Bildakquisitionssoftware erfordert, dass das Gefäß senkrecht steht. Sobald das Schiff gedreht ist und flach liegt, wählen Sie die XT-Funktion im Menü Erfassung und richten Sie es so ein, dass es 4.000 Zeilen scannt. Platzieren Sie die Linie über das zu untersuchende Gefäß mit der Fokusebene am maximalen Durchmesser des Segments.Klicken Sie anschließend mit der linken Maustaste auf das zusammengesetzte Farbbild und wählen Sie die Registerkarte Schnappschuss aufnehmen, um ein Referenzbild des Bereichs zu generieren, in dem der Zeilenscan aufgenommen wurde. Klicken Sie sofort auf die Schaltfläche Start, um den Zeilenscan des Schiffes zu erfassen. Importieren Sie später die Zeilenscans in die Bildverarbeitungssoftware, um die RBC-Durchflussrate zu bestimmen.Öffnen Sie im Dropdown-Menü Messen das Dialogfeld Regionsstatistik anzeigen, und wählen Sie das Einzellinienzeichnungswerkzeug aus, um eine Linie zu zeichnen, die der Neigung der RBC-Schatten entspricht. Nachdem Sie die Breite und Höhe der Linie notiert haben, verwenden Sie eine Gleichung, um die Geschwindigkeit zu berechnen, und erhalten Sie dann durchschnittlich fünf Berechnungen, um die Geschwindigkeit für jeden Zeilenscan zu melden. Zentrieren Sie einen Glomerulus im Bildgebungsfeld und nehmen Sie einen 3D-Datensatz auf, der an der glomerulären Oberfläche beginnt und bei 30 bis 35 Mikrometern endet.Verwenden Sie eine Schrittweite von 1 Mikrometer in Z-Richtung. Identifizieren Sie die WBCs, indem Sie den blauen Hoechst-Kanal mit dem Texas Red-Albuminkanal vergleichen, indem Sie nach dem Ausschluss von rotem Farbstoff in der Kapillarschleife und einem entsprechenden nuklearen Fleck suchen. Wenn die Leukozyten über drei optische Schnitte statisch erscheinen, definieren Sie die Zellen als haftend und melden Sie dann die Werte als Vorkommen pro 10 optische Schnitte von der Oberseite des Glomerulus, die in Abständen von 1 Mikrometer aufgenommen wurden.Die Anzahl der glomerulären pro Feld bei Münchner Wistar Fromter oder MWF-Ratten war in der 5-wöchigen UUO-Gruppe höher als bei unbehandelten Ratten. Sprague-Dawley-Ratten oder SD-Ratten gingen nach fünf Wochen der einseitigen Harnleiterobstruktion von keiner Oberflächenglomeruli auf 2,02 pro Feld über. Dreidimensionale rekonstruierte Bilder wurden beobachtet, um die Nierenoberfläche zu betrachten.Die 5-wöchige einseitige uretale Obstruktion bei den SD-Ratten führte nicht zu Bereichen, die normalen tubulären Epithelien ähnelten, wie sie bei der MWF beobachtet wurden, unbehandelt und teilweise bei 5-wöchigen UUO-MWF-Ratten. In der Untersuchung der renalen Gefäßdynamik war der renale Blutfluss in den 5-wöchigen UUO-MWF- und SD-Gruppen im Vergleich zu unbehandelten Ratten signifikant reduziert. Die RBC-Geschwindigkeit innerhalb der glomerulären Kapillarschleifen war bei den 5-wöchigen UUO-MWF- und SD-Ratten im Vergleich zu unbehandelten MWF-Ratten signifikant verringert.Darüber hinaus hatten unbehandelte MWF-Ratten weniger Leukozyten pro 10 optische Schnitte von oben, während die Anzahl bei 5-wöchigen UUO-MWF- und 5-wöchigen UUO-SD-Ratten anstieg. Bei einseitiger uretaler Obstruktion wurde eine Zunahme der Albuminpermeabilität beobachtet. Eine Albuminakkumulation im Bowman-Raum war nach einseitiger Harnwegsobstruktion intensiv.Die Endozytose des S1-Abschnitts ist eine große Menge an Albumin, wie sie unter physiologischen Bedingungen bei unbehandelten MWF-Ratten beobachtet wurde. Die gleiche Aufnahme konnte bei den MWF- oder SD-Ratten nach 5 Wochen einseitiger urettaler Obstruktion nicht beobachtet werden. Viele verschiedene Methoden wie die wiederholte Bildgebung zur Untersuchung eines Prozesses im Laufe der Zeit, die Fixierung eines bestimmten Bereichs für die Bildgebung und die anschließende Verwendung des fixierten Gewebes zur Durchführung einer höher aufgelösten Mikroskopie können in Verbindung mit dieser Technik durchgeführt werden.Die Technik gilt als disruptive Technologie. Es ermöglicht den Ermittlern, viele neue Fragen zu beantworten. Dabei wurden neue Erkenntnisse gewonnen und Paradigmenwechseldaten gewonnen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Ein Modell von gequetscht Einseitige Cervical Spinal Cord Injury Mit dem Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Forschung

Medizin

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

Ein Mausmodell der irreversiblen und reversiblen Einseitige Ureterobstruktion

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Mit Hilfe einer Laminiertechnik konfokale Mikroskopie der menschlichen Sclera to Perform


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Nerve sparende Mittelharnröhrenobstruktion (NEMO) in Female Kleine Nagetiere

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen