Name: using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 og P30DK079312 (til BAM). Vi takker de ansatte ved Genomics Core Facility of Research Technology Support Facility (RTSF) ved Michigan State University for å utføre Nanostring-analysen.

<ol>
	<li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Indiana+O'Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis.">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li><li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney:+a+micropuncture+study.">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology.">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats.">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li><li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex:+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains.">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li><li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+rat+homologue+of+podocin:+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli.">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice.">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li><li>Schie&#223;l, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+nephrons+in+BALB/c+and+C57BL/6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney.">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499 (2013).</li><li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction:+a+new+look+at+an+old+model.">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li><li>Yang, H. -. C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+kidney+disease.">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li><li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags.">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li><li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy.">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li><li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2.">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330 (2016).</li><li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model.">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li><li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die:+Is+there+any+cell+death+in+podocytes.">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li><li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease.">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte &amp; Blood Pressure E &amp; BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li><li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis.">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).</li><li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD.">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li><li>M&#252;hlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome.">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).</li><li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periostin:+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells.">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li><li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2/M.">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats.">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells:+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states.">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+bottom+and+using+it:+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy.">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674 (2014).</li><li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus:+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling.">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li><li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus.">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li><li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus.">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li><li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis.">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Studien av glomerulær fysiologi har sett mange forskjellige tilnærminger, særlig bruk av mikropunktering, perfusjon av isolert glomeruli og mikroskopi. Tilgjengeligheten av overflate glomeruli i München Wistar rotter, Fromter og Simonsen stammer, har tillatt in vivo dynamiske studier. Et viktig notat til etterforskere som vedtar denne teknologien, er behovet for å sette oppkjøpsparametere for å opprettholde konsistente bilder mellom studier, slik at autofluorescensen i vev forblir konsistent. Ved å bruke en dual-pass fluorescein / rhodamin epifluorescenskube og justere forsterkningsinnstillingene til de grønne og røde utslippskanalene for å etterligne på dataskjermen, vil det som ses gjennom okularene, sikre en konsistent fargesignatur i autofluorescensen selv mellom forskjellige mikroskopsystemer.
Fromter-stammen har blitt brukt mye da den har et redusert antall totale glomeruli, ~ 75% normal, og mennene utvikler spontant hypertensjon ved rundt 12 ukers alder, med progressiv proteinuri og påfølgende fokal glomerulær sklerose, og dør til slutt av nyresvikt12. Bruken av disse rottene og tilsetningen av 2-fotonmikroskopi med redusert fototoksisitet, forbedret penetrasjonsdybde og evnen til å se flere fluorescerende sonder samtidig banet vei for nye funn 1,4,5. Med utviklingen av maskinvare og programvare er kvantitative data nå standarden for alle 2-fotonlaboratorier. Flere kvantitative teknikker er utviklet og anvendt på glomerulære, proksimale tubuli, vaskulære og interstitielle prosesser under fysiologiske og sykdomstilstander 1,4,5,27,28,29,30.
Transgene musegenererende anlegg ga en ny dimensjon til studiet av nyrefysiologi og patologi, og det var bare et spørsmål om tid før dette ble kombinert med 2-fotonmikroskopi for ytterligere å avgrense betydningen av spesifikke genprodukter i nyrestruktur og funksjon. Imidlertid ligger museglomeruli, unntatt hos svært unge mus, over 100 μm fra overflaten av nyrene9. To-fotonmikroskopi utføres best på en dybde på mellom 20 og 50 μm som oppløsning, og fluorescensintensiteten avtar raskt deretter på grunn av lysspredning av utsendt lys og absorpsjon fra interaksjon med hemoglobin. Derfor var det nødvendig å indusere overflate glomeruli. Tilnærmingen som vanligvis brukes er en langvarig ensidig obstruksjonsmodell i 12 uker. Siden disse modellene ikke tillater baselinebestemmelser, er det ikke mulig å skille effektene av UUO fra prosessen som studeres.
Ved hjelp av MWF-rotter kan man sammenligne baseline glomerulær funksjon med den følgende UUO. Denne UUO-modellen er kjent for å indusere betennelse og en rask fibrosefrekvens og har blitt brukt til å studere CKD og fibrose10,11,12. Som forventet var det en økning i overflateglomeruli hos både MWF- og SD-rotter. Videre var de kvantitative resultatene oppnådd etter UUO for MWF- og SD-rotter svært sammenlignbare. Reduksjonen i blodstrømmen registrert her var tidligere rapportert å sammenligne mikroskopiske data etter UUO med mikropunksjonsdata3. Det var også velkjent at tubulær og interstitiell histologi er markant endret, og PT-ene er for det meste ikke-funksjonelle, som rapportert her, med mangel på albumin endocytose. Studiene i figur 2 og figur 3 viser en dramatisk reduksjon i RBC-strømningshastighet i glomerulære og peritubulære kapillærer og forbedret WBC-adhesjon. Reduksjonene i strømning skyldes sannsynligvis kapillærblokkering fra WBC-adhesjons- og rouleauxformasjoner.
For ytterligere å evaluere betennelse, kvantifiserte vi albuminpermeabilitet og viste at den økte ti ganger. I tillegg viste isolerte glomeruli at mRNA-ekspresjon økte for mange gener som tidligere var kjent for å være økt i nyrebetennelse i en rekke nyresykdomstilstander 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Økningene i glomerulær overflatetetthet og albuminpermeabilitet var progressive, som vist av 12-ukers UUO-data. De foreliggende dataene er de første som direkte viser at glomeruli gjennomgår betydelig strukturell skade, betennelse og molekylære endringer i UUO-modellen. Resultatene er i samsvar med en tidligere studie av hele nyrevev som analyserte sauenyrebiopsier etter UUO, og fant flere betennelsesmarkører forhøyet19. De foreliggende resultatene indikerer at det eksisterer markert betennelse i glomeruli, tidligere bare kjent for kortikalt vev.
De foreliggende dataene skiller seg fra tidligere studier hos mus hvor det ikke ble funnet endringer i adhesjonsmolekyluttrykk, komplementavsetning og nøytrofil infiltrasjon mellom 12-ukers posthydronefrotisk og normal glomeruli31. I tillegg brukte Hickey-laboratoriet 12-ukers UUO-modellen for å studere immunreaksjoner i glomeruli hos mus. De fant ingen forskjeller i nøytrofil infiltrasjon mellom fire uker gamle museglomeruli og postobstruktiv glomeruli32,33. Disse senere studiene ble utført etter at bekkenet til den blokkerte nyren ble drenert av urin. Vi gjorde ikke dette da vi ønsket å bestemme effekten av UUO på glomerulær funksjon som det ville være in vivo, uten kunstig å fjerne væsken som forårsaker obstruksjonen. Endelig blir bruken av UUO hos mus erstattet av imaging glomeruli på mer enn 100 μm under overflaten. Selv om det er mulig, er det en avveining mellom oppløsning og intensitet, begge reduseres betydelig når man går over 50 μm34.
Resultatene som presenteres er ikke overraskende hvis man setter sammen dataene fra eksisterende litteratur om histologiske endringer, dannelse av atubulær glomeruli, betennelse, fibrose, hemodynamikk10,11,12. Dataene som presenteres, inkludert WBC-adhesjon, rouleaux-formasjoner, glomerulære molekylære betennelsesmarkører og økt albuminpermeabilitet, indikerer ytterligere den omfattende betennelsen som pågår i denne UUO-modellen selv etter fem uker og også tilstede ved tolv uker. Det er klart at kronisk UUO ikke er en fysiologisk tilstand, og bruken av UUO for å indusere overflateglomeruli representerer en skademodell. MWF-rottene, som har overflateglomeruli under fysiologiske forhold, kan studeres i lengderetningen etter hvert som skade oppstår. Det er mulig å generere transgene rotter, og mange etterforskere lager dem med biosensorer for å stille spesifikke spørsmål. Spesielt har Medical College of Wisconsin nå en koloni av MWF-rotter og har laget transgene rotter med det formål å studere glomerulære prosesser under fysiologiske og patologiske forhold. Disse MWF-rottene gir en flott mulighet til å studere glomerulære prosesser hos normale, syke og genetisk endrede rotter.

Å forstå glomerulære prosesser, spesielt podocytbiologi, har vært et mål i over 50 år. München Wistar-rotter med overflateglomeruli har spilt en sentral rolle i disse studiene, inkludert mikropunkturstudier, for å forstå mange aspekter av fysiologiske og patologiske prosesser 1,2,3. Bruken av mikroskopi for å studere glomerulære komponenter intravitalt var begrenset på grunn av effekten av fototoksisitet til fremkomsten av 2-fotonmikroskopi som minimerte denne giftige eksponeringen og økte penetrasjonsdybden 1,2. Sammen med raske fremskritt innen maskinvare og programvare, har dette gitt mulighet for tredimensjonale (3D) og firedimensjonale (tid) studier i flere timer i en enkelt innstilling 1,4,5.
Kvantifiseringen av glomerulær kapillær blodstrøm, vasokonstriksjon og dilatasjon som respons på medisiner, permeabilitet og effekten av ladning på permeabilitet og betennelse er bare noen av de glomerulære prosessene som har blitt studert. I tillegg er S1-segmentet av den proksimale tubuli identifiserbar, og forskjellene i oppførselen til S1 og S2 rørformet epitel kan kvantifiseres 1,4. Studier på mus, spesielt med universell tilgjengelighet av mustransgene fasiliteter, har ført til raske fremskritt i forståelsen av molekylærbiologien til glomerulære sykdomsprosesser. Individuelle proteiner er ansvarlige for glomerulær dysfunksjon i knockoutstudier, spesielt med hensyn til proteinuri 6,7,8. Imidlertid har bruken av musemodeller for glomerulære avbildningsstudier vært begrenset, da glomeruli er mer enn 100 μm under overflaten i de mange stammene som er studert9.
Dette har ført til at forskere har utviklet og brukt musemodeller som resulterer i overflateglomeruli som kan studeres. Den vanligste modellen er bruken av komplett UUO10,11,12. På slutten av den utvidede UUO-perioden er det mange overflateglomeruli i mus nyrer som kan være og har blitt studert13,14. Det har ikke vært noen baseline- eller kontrollstudie i disse musestudiene for å bestemme effekten av langvarig UUO på glomerulær biologi. Siden dette er en alvorlig og langvarig skademodell som resulterer i rask fibrose og kortikal destruksjon10,11,12, antok vi at det ville være effekter på glomerulære prosesser og funksjon. For å svare på dette spørsmålet ble München Wistar Fromter (MWF) rotter med overflateglomeruli brukt til å studere kontroll/baseline-parametere, og baseline-funnet ble sammenlignet med glomerulære studier på MWF-rotter etter fem uker med UUO. Vi studerte også Sprague Dawley (SD) rotter som ikke har overflate glomeruli etter UUO. Funnene indikerer at 5 uker med UUO i MWF og SD-rotter faktisk øker antall overflateglomeruli. Disse var imidlertid unormale glomeruli med markerte endringer i glomerulær blodstrøm, inflammasjon og makromolekylpermeabilitet og størrelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Note: Version 7.1r1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Dissecting Scissors</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 78180-1C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph Image processing Software</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>Cat# 78266-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corportation</td>
			<td>2007 version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reptitherm Undertank Heater</td>
			<td>Zoomed</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11-889-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 70665-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes

Å bruke nye mikroskopimetoder til egnede dyresykdomsmodeller for å utforske nyrens dynamiske fysiologi er fortsatt en utfordring. Rotter med overflateglomeruli gir en unik mulighet til å undersøke fysiologiske og patofysiologiske prosesser ved hjelp av intravital 2-fotonmikroskopi. Kvantifisering av glomerulær kapillær blodstrøm og vasokonstriksjon og dilatasjon som respons på narkotika, permeabilitet og betennelse er bare noen av prosessene som kan studeres. I tillegg gir transgene rotter, dvs. podocytter merket med fluorescerende fargestoffer og andre molekylære biomarkørtilnærminger, økt oppløsning for direkte å overvåke og kvantifisere protein-protein-interaksjoner og effekten av spesifikke molekylære endringer.
Hos mus, som mangler overflateglomeruli etter fire ukers alder, har unilateral ureteral obstruksjon (UUO) i flere uker blitt brukt til å indusere overflateglomeruli. Siden denne induksjonsmodellen ikke tillater baselinestudier, kvantifiserte vi effekten av UUO på glomerulære prosesser i UUO-modellen i München Wistar Frömter (MWF) rotter, som har overflateglomeruli under fysiologiske forhold. UUO-modellen i fem uker eller mer induserte signifikante endringer i brutto nyremorfologi, peritubulær og glomerulær mikrovaskulatur, samt struktur og funksjon av tubulær epitel. Glomerulær og peritubulær røde blodcellestrøm (RBC) ble signifikant redusert (p < 0,01), sannsynligvis på grunn av signifikant økning i etterlevelsen av hvite blodlegemer (WBC) i glomerulære og peritubulære kapillærer. Den glomerulære siktkoeffisienten for albumin økte fra 0,015 ± 0,002 i ubehandlede MWFer til 0,045 ± 0,05 hos 5 uker gamle UUO MWF-rotter. Tolv uker med UUO resulterte i ytterligere økning i overflateglomerulær tetthet og glomerulær siktkoeffisient (GSC) for albumin. Fluorescerende albumin filtrert over glomeruli ble ikke reabsorbert av de proksimale tubuli. Disse dataene antyder at bruk av UUO for å indusere overflateglomeruli begrenser evnen til å studere og tolke normale glomerulære prosesser og sykdomsendringer.

Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Her presenterer vi en protokoll ved hjelp av 2-fotonmikroskopi i München Wistar Fromter rotter med overflate glomeruli for å kvantifisere effekten av langvarig ureteral obstruksjon på glomerulær dynamikk og funksjon.

Bruk av 2-fotonmikroskopi for å kvantifisere effekten av kronisk ensidig ureteral obstruksjon på glomerulære prosesser

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

I dataene som presenteres i denne studien viser de dramatiske effektene av ensidig ureteral obstruksjon på nyrefunksjon, betennelse og fibrose. Det hjelper oss å forstå de patofysiologiske mekanismene for ensidig ureteral obstruksjon. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å studere celle-celle interaksjoner, subcellulære hendelser, og knytte struktur og funksjon på en dynamisk måte innenfor en fungerende nyre.Demonstrere ureteral prosedyren vil bli gjort av Dr.Silvia Campos-Bilderback som er kirurg i vårt laboratorium. For å begynne, bedøve rotten, gjør deretter et snitt langs midtlinjen og finn venstre nyre for å skille den fra de omkringliggende peritoneale organene. Etter å ha funnet nyrepedicleen, som består av nyrearterien, nyrevenen og urineren, skiller urineren uten å skade den delikate strukturen.Bruk tang til å sløyfe og knytte en 3-0 sutur rundt urineren, og bind deretter en knute noen millimeter på hver side av den første knuten for å sikre fullstendig hindring. Når urineren er bundet, lukk forsiktig de påfølgende muskellagene, og lukk deretter magen helt. Lukk den ytre huden med kirurgiske stifter.For kirurgisk forberedelse, plasser den bedøvede rotten med en inneliggende venøs tilgangslinje på siden med den barberte venstre flanken vendt opp flatt og rett på bordet. Sørg for at rotteens fremre poter berører hverandre, det samme skal bakpotene. Når rotta er plassert, palperer du venstre flanke like under ribbenene for å føle for nyrene og bestemme den naturlige posisjonen i magen, og tegn deretter en linje ved hjelp av en permanent markør langs det barberte området, og skjær nyresenteret i en nese-til-hale orientering.Bruk et par tannede tang for å gripe og løfte huden oppover og klemme den permanente markørlinjen med et par hemostater for å knuse den underliggende vaskulaturen og forhindre blødning. Gjenta prosedyren for det tynne ytre muskellaget for å minimere blødning. For å gjøre det endelige snittet av det tynne indre bukmuskellaget, palpere nyrene for å estimere størrelsen og posisjonen og løft det indre muskellaget med et par tang, og knus deretter en linje som skjærer huden over nyrene med hemostatene som er omtrent 1/3 den estimerte størrelsen på nyrene.Mens du opprettholder grepet på muskellaget med tangen, gjør du det endelige snittet. Deretter bruker du tang i hver hånd for å gripe og holde nyrefettet på den nedre polen av nyrene med en hånd-over-hånd-teknikk som arbeider nedover. Ha et fast grep om fettet med den ene hånden, trekk fettet og klem forsiktig nyrene gjennom snittet.Hvis nyrene ikke passerer gjennom, må du enkelt utvide snittet. For å identifisere de hvite blodcellene eller WBC-ene som ligger i kapillærsløyfene, administrer Hoechst 33342 kjernefysisk flekk ved 8 mikrogram per kilo rottevekt via en inneliggende venøs tilgangslinje. På mikroskopet, plasser den eksponerte nyren mot kanten av parabolen med en liten rotasjon, slik at buksiden av nyrene kommer i kontakt med dekselet og dorsalsiden vender bort fra kanten.For ytterligere å minimere bevegelse, pakk to sterile 2-til-2 gasbind pads fuktet med saltvann mot dorsalsiden av nyrene som forsterker kontakten til buksiden av nyrene til kanten. Når prøven er plassert, se gjennom mikroskopokularet under epifluorescensbelysning ved hjelp av en dual-pass rhodamin FITC-kube. Hvis det oppdages en bevegelse i prøveposisjonen, må du gjøre mindre justeringer ved å justere gasbindet slik at det ikke skyver under nyrene.Rull rotta litt over slik at thoraxen er lenger unna retten. Skann overflaten av nyrene ved hjelp av epifluorescensbelysning og merk glomeruliposisjonene ved hjelp av programvaren som er forbundet med den motoriserte scenekontrolleren. For hver fargekanal under 2-foton belysning, ta et grunt 3D-volum av den øvre delen av hver merket glomerulus for å tjene som bakgrunnsbilde.I visningsalternativet til bildebehandlingsprogramvaren bruker du en pseudofargepalett for å visualisere de svake intensitetene i bakgrunnsfluorescensen til de glomerulære kapillærløkkene. Ved å bruke et overfladisk blodkar som fokuspunkt, må du sakte infisere det fluorescerende Texas Red RAP-serumalbuminet eller TRRSA mens du observerer økning og fall av fluorescens på grunn av den systemiske fordelingen til en intensitet i peritubulær vaskulatur og kapillærsløyfer er like under metning. Etter 10 minutter, skaff 3D-volumer for alle merkede og avbildede glomeruli med 1 mikrometer intervaller.Finn et passende fartøy, enten en kapillærsløyfe eller et peritubulært fartøy, og roter deretter bildet ved hjelp av Rotate-funksjonen, da Line Scan-funksjonen i bildeinnsamlingsprogramvaren krever at fartøyet er vinkelrett. Når fartøyet er rotert og ligger flatt, velger du XT-funksjonen på anskaffelsesmenyen og setter den opp til å skanne 4 000 linjer. Plasser linjen over fartøyet som skal undersøkes med fokalplanet ved segmentets maksimale diameter.Deretter venstreklikker du på fargekomposittbildet og velger kategorien Ta øyeblikksbilde for å generere et referansebilde av området der linjeskanningen ble tatt. Klikk umiddelbart på Start-knappen for å fange linjeskanningen av fartøyet. Senere importerer du linjeskanningene til bildebehandlingsprogramvaren for å bestemme RBC-strømningshastigheten.Under rullegardinmenyen Mål åpner du dialogboksen Vis områdestatistikk og velger tegneverktøyet med én linje for å tegne en linje som samsvarer med helningen til RBC-skyggene. Etter å ha notert bredden og høyden på linjen, bruk en ligning for å beregne hastigheten, og få deretter et gjennomsnitt på fem beregninger for å rapportere hastigheten for hver linjeskanning. Senter en glomerulus i bildefeltet og ta et 3D-datasett som starter på glomerulær overflate og slutter ved 30 til 35 mikrometer.Bruk en trinnstørrelse på 1 mikrometer i Z-retningen. Identifiser WBC-ene ved å sammenligne den blå Hoechst-kanalen med Texas Red-albuminkanalen ved å se etter utelukkelse av rødt fargestoff i kapillærsløyfen og en tilsvarende kjernefysisk flekk. Hvis WBC-ene vises statiske over tre optiske seksjoner, definerer du cellene som vedlagt, og rapporterer deretter verdiene som forekomst per 10 optiske seksjoner fra toppen av glomerulus tatt med 1-mikrometerintervaller.Antall glomerulære per felt i München Wistar Fromter eller MWF rotter økte i 5-ukers UUO-gruppen enn hos ubehandlede rotter. Sprague-Dawley-rotter, eller SD-rotter, gikk fra å ikke ha noen overflateglomeruli til 2,02 per felt etter fem uker med ensidig ureteral obstruksjon. Tredimensjonale rekonstruerte bilder ble observert for å se nyreoverflaten.5-ukers unilateral uretalobstruksjon hos SD-rotter resulterte ikke i områder som lignet normalt tubulært epitel som sett i MWF, ubehandlet og delvis hos 5-ukers UUO MWF-rotter. I studien av renal vaskulær dynamikk ble nyreblodstrømmen signifikant redusert i 5-ukers UUO MWF og SD-gruppene sammenlignet med ubehandlede rotter. RBC-hastigheten i de glomerulære kapillærsløyfene ble signifikant redusert i 5-ukers UUO MWF, og SD-rotter sammenlignet med ubehandlede MWF-rotter.I tillegg hadde ubehandlede MWF-rotter færre WBC-er per 10 optiske seksjoner fra toppen, mens antallet økte i 5-ukers UUO MWF og 5-ukers UUO SD-rotter. Ved unilateral uretalobstruksjon ble det sett en økning i albuminpermeabilitet. En albuminakkumulering i Bowman-rommet var intens etter ensidig uretalobstruksjon.S1-segmentet endocytose store mengder albumin som observert med fysiologiske forhold hos ubehandlede MWF-rotter. Det samme opptaket kunne ikke ses hos MWF- eller SD-rotter etter 5 uker med unilateral uretalobstruksjon. Mange forskjellige metoder som gjentatt avbildning for å studere en prosess over tid, fiksering av et bestemt område for avbildning, og påfølgende utnyttelse av det faste vevet for å utføre mikroskopi med høyere oppløsning kan gjøres i forbindelse med denne teknikken.Teknikken regnes som forstyrrende teknologi. Det er gjort det mulig for etterforskere å svare på mange nye spørsmål. Ved å gjøre dette har ny innsikt blitt gitt og paradigmeskiftende data er oppnådd.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

En Contusive Modell av Unilateral Cervical ryggmargsskade Bruke Infinite Horizon impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantifisere Glomerular permeabilitet i Fluorescent Macromolecules Bruke 2-Photon Mikroskopi i München Wistar rotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

En Muse Modell av Irreversible og Reversibel Ensidig ureter Obstruksjon

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mus Modell av Type 2 Diabetes: Bukspyttkjertel Islet Isolasjon og Live-celle 2-Photon Imaging av intakte holmer

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Ved hjelp av en Laminering teknikk for å utføre Konfokalmikroskopi av Human Sclera


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analysere gunstige effektene av kosttilskudd på Intestinal Epitelial barrierefunksjoner Under Experimental kolitt

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Nerve-sparing Midt-urethral obstruksjon (Nemo) i Female smågnagere

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Måle effekten av bakterier og kjemikalier på intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...