Name: using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Национального института диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек RO1DK091623 и P30DK079312 (до B.A.M.). Мы благодарим сотрудников Genomics Core Facility Центра поддержки исследовательских технологий (RTSF) в Университете штата Мичиган за проведение анализа Nanostring.

<ol>
	<li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Indiana+O'Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis.">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li><li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney:+a+micropuncture+study.">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology.">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats.">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li><li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex:+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains.">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li><li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+rat+homologue+of+podocin:+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli.">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice.">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li><li>Schie&#223;l, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+nephrons+in+BALB/c+and+C57BL/6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney.">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499 (2013).</li><li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction:+a+new+look+at+an+old+model.">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li><li>Yang, H. -. C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+kidney+disease.">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li><li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags.">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li><li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy.">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li><li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2.">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330 (2016).</li><li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model.">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li><li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die:+Is+there+any+cell+death+in+podocytes.">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li><li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease.">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte &amp; Blood Pressure E &amp; BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li><li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis.">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).</li><li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD.">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li><li>M&#252;hlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome.">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).</li><li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periostin:+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells.">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li><li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2/M.">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats.">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells:+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states.">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+bottom+and+using+it:+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy.">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674 (2014).</li><li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus:+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling.">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li><li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus.">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li><li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus.">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li><li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis.">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов.

Изучение клубочковой физиологии видело много различных подходов, в первую очередь использование микропунктуры, перфузии изолированных клубочков и микроскопии. Наличие поверхностных клубочков у мюнхенских крыс Wistar, штаммов Фромтера и Симонсена позволило проводить динамические исследования in vivo . Одним из важных замечаний для исследователей, применяющих эту технологию, является необходимость установки параметров сбора для поддержания последовательных изображений между исследованиями, поэтому автофлуоресценция в ткани остается последовательной. Использование двухпроходного флуоресцеинового / родаминового эпифлуоресцентного куба и настройка параметров усиления на зеленый и красный каналы излучения для имитации на экране компьютера того, что видно через окуляры, обеспечит постоянную цветовую сигнатуру в автофлуоресценции даже между различными системами микроскопов.
Штамм Фромтера широко использовался, поскольку он имеет уменьшенное количество общих клубочков, ~ 75% нормальных, и у мужчин спонтанно развивается гипертония в возрасте около 12 недель, с прогрессирующей протеинурией и последующим фокальным клубочковым склерозом, в конечном итоге умирающим от почечной недостаточности12. Использование этих крыс и добавление 2-фотонной микроскопии с ее уменьшенной фототоксичностью, улучшенной глубиной проникновения и возможностью одновременного просмотра нескольких флуоресцентных зондов проложили путь к новым открытиям 1,4,5. С развитием компьютерного оборудования и программного обеспечения количественные данные теперь являются стандартом для всех 2-фотонных лабораторий. Разработаны и применены многочисленные количественные методы к клубочковым, проксимальным канальцам, сосудистым и интерстициальным процессам в физиологических и болезненных условиях 1,4,5,27,28,29,30.
Трансгенные мышиные генерирующие средства добавили новое измерение к изучению физиологии и патологии почек, и это был только вопрос времени, когда это было объединено с 2-фотонной микроскопией, чтобы еще больше очертить важность конкретных генных продуктов в структуре и функции почек. Однако мышиные клубочки, за исключением очень молодых мышей, расположены на расстоянии более 100 мкм от поверхности почки9. Двухфотонную микроскопию лучше всего проводить на глубине от 20 до 50 мкм в качестве разрешения, и интенсивность флуоресценции быстро уменьшается после этого из-за рассеяния света излучаемого света и поглощения от взаимодействия с гемоглобином. Поэтому необходимо было индуцировать поверхностные клубочки. Обычно используется подход, представляющий собой длительную одностороннюю модель обструкции в течение 12 недель. Поскольку эти модели не позволяют определить исходные условия, отделение эффектов UUO от изучаемого процесса невозможно.
Используя крыс MWF, можно сравнить базовую клубочковую функцию с следующей UUO. Эта модель UUO, как известно, вызывает воспаление и быструю скорость фиброза и использовалась для изучения ХБП и фиброза 10,11,12. Как и ожидалось, наблюдалось увеличение поверхностных клубочков как у MWF, так и у крыс SD. Более того, количественные результаты, полученные после UUO для крыс MWF и SD, были очень сопоставимы. Ранее сообщалось о снижении кровотока, зарегистрированном здесь, при сравнении микроскопических данных после UUO с данными микропунктуры3. Также было хорошо известно, что канальцевая и интерстициальная гистология заметно изменена, а ПТ в основном нефункциональны, как сообщается здесь, с отсутствием эндоцитоза альбумина. Исследования на рисунках 2 и 3 показывают резкое снижение скорости потока эритроцитов в клубочковых и перитубулярных капиллярах и усиление адгезии лейкоцитов. Снижение потока, вероятно, связано с закупоркой капилляров от адгезии WBC и образований руло.
Чтобы дополнительно оценить воспаление, мы количественно оценили проницаемость альбумина и показали, что она увеличивается в десять раз. Кроме того, изолированные клубочки показали, что экспрессия мРНК увеличилась для многих генов, которые, как ранее сообщалось, были увеличены при воспалении почек в различных состояниях заболевания почек 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Увеличение клубочковой поверхностной плотности и проницаемости альбумина было прогрессирующим, как показали 12-недельные данные UUO. Представленные данные являются первыми, которые непосредственно показывают, что клубочки подвергаются значительным структурным повреждениям, воспалению и молекулярным изменениям в модели UUO. Результаты согласуются с более ранним исследованием целой почечной ткани, в котором анализировались биопсии почек овец после UUO, обнаружив, что множественные маркеры воспаления повышенына 19. Настоящие результаты показывают, что в клубочках существует выраженное воспаление, ранее известное только для кортикальной ткани.
Настоящие данные отличаются от более ранних исследований на мышах, где не было обнаружено никаких изменений в экспрессии молекул адгезии, отложении комплемента и инфильтрации нейтрофилов между 12-недельными постгидронефротическими и нормальными клубочками31. Кроме того, лаборатория Хикки использовала 12-недельную модель UUO для изучения иммунных реакций у клубочков мышей. Они не обнаружили различий в инфильтрации нейтрофилов между четырехнедельными клубочками мыши и постобструктивными клубочками32,33. Эти более поздние исследования были проведены после того, как таз закупоренной почки был выведен из мочи. Мы этого не сделали, так как хотели определить влияние UUO на клубочковую функцию, как это было бы in vivo, без искусственного удаления жидкости, вызывающей обструкцию. Наконец, использование UUO у мышей заменяется визуализацией клубочков на глубине более 100 мкм под поверхностью. Хотя это возможно, существует компромисс в разрешении и интенсивности, которые значительно снижаются по мере того, как один из них выходит за пределы 50 мкм34.
Представленные результаты не удивительны, если собрать воедино данные из существующей литературы по гистологическим изменениям, образованию клубочков, воспалению, фиброзу, гемодинамике 10,11,12. Представленные данные, включая адгезию WBC, образования руло, клубочковые молекулярные маркеры воспаления и повышенную проницаемость альбумина, дополнительно указывают на обширное воспаление, которое продолжается в этой модели UUO даже через пять недель, а также присутствует через двенадцать недель. Очевидно, что хронический UUO не является физиологическим состоянием, и использование UUO для индуцирования поверхностных клубочков представляет собой модель травмы. Крысы MWF, которые имеют поверхностные клубочки в физиологических условиях, могут быть продольно изучены по мере получения травмы. Можно генерировать трансгенных крыс, и многочисленные исследователи создают их с помощью биосенсоров, чтобы задавать конкретные вопросы. В частности, Медицинский колледж Висконсина теперь имеет колонию крыс MWF и сделал трансгенных крыс с целью изучения клубочковых процессов в физиологических и патологических условиях. Эти крысы MWF предлагают прекрасную возможность для изучения клубочковых процессов у нормальных, больных и генетически измененных крыс.

Понимание клубочковых процессов, особенно биологии подоцитов, было целью на протяжении более 50 лет. Мюнхенские крысы Wistar с поверхностными клубочками сыграли центральную роль в этих исследованиях, включая исследования микропунктуры, чтобы понять многочисленные аспекты физиологических и патологических процессов 1,2,3. Использование микроскопии для изучения клубочковых компонентов прижизненно было ограничено из-за эффектов фототоксичности до появления 2-фотонной микроскопии, которая минимизировала это токсическое воздействие и увеличила глубину проникновения 1,2. Наряду с быстрым прогрессом в компьютерном оборудовании и программном обеспечении, это позволило проводить трехмерные (3D) и четырехмерные (время) исследования в течение нескольких часов в одной обстановке 1,4,5.
Количественная оценка клубочкового капиллярного кровотока, вазоконстрикции и дилатации в ответ на лекарства, проницаемость и влияние заряда на проницаемость и воспаление - это лишь некоторые из клубочковых процессов, которые были изучены. Кроме того, сегмент S1 проксимального канальца идентифицируется, а различия в поведении трубчатого эпителия S1 и S2 могут быть количественно определены 1,4. Исследования на мышах, особенно с повсеместной доступностью мышиных трансгенных средств, привели к быстрому прогрессу в понимании молекулярной биологии процессов клубочковых заболеваний. Отдельные белки отвечают за клубочковую дисфункцию в нокаут-исследованиях, особенно в отношении протеинурии 6,7,8. Тем не менее, использование мышиных моделей для исследований клубочковой визуализации было ограничено, поскольку клубочки находятся более чем на 100 мкм ниже поверхности в многочисленных изученных штаммах9.
Это привело исследователей к разработке и использованию мышиных моделей, приводящих к поверхностным клубочкам, которые можно изучать. Наиболее распространенной моделью является использование полного UUO 10,11,12. В конце расширенного периода UUO в почках мышей появляются многочисленные поверхностные клубочки, которые могут быть и были изучены13,14. В этих исследованиях на мышах не было базового или контрольного исследования для определения влияния длительного UUO на клубочковую биологию. Поскольку это тяжелая и длительная модель повреждения, приводящая к быстрому фиброзу и разрушению коры 10,11,12, мы предположили, что это повлияет на клубочковые процессы и функцию. Чтобы ответить на этот вопрос, мюнхенские крысы Wistar Fromter (MWF) с поверхностными клубочками были использованы для изучения контрольных / исходных параметров, а исходный результат сравнивали с клубочковыми исследованиями на крысах MWF после пяти недель UUO. Мы также изучили крыс Sprague Dawley (SD), у которых нет поверхностных клубочков после UUO. Полученные данные показывают, что 5 недель UUO у крыс MWF и SD действительно увеличивают количество поверхностных клубочков. Однако это были аномальные клубочки с выраженными изменениями клубочкового кровотока, воспалением, проницаемостью и размером макромолекул.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Note: Version 7.1r1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Dissecting Scissors</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 78180-1C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph Image processing Software</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>Cat# 78266-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corportation</td>
			<td>2007 version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reptitherm Undertank Heater</td>
			<td>Zoomed</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11-889-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 70665-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes

Применение новых методов микроскопии к подходящим моделям болезней животных для изучения динамической физиологии почек остается проблемой. Крысы с поверхностными клубочками предоставляют уникальную возможность исследовать физиологические и патофизиологические процессы с помощью прижизненной 2-фотонной микроскопии. Количественная оценка клубочкового капиллярного кровотока и вазоконстрикции и дилатации в ответ на лекарства, проницаемость и воспаление — это лишь некоторые из процессов, которые можно изучить. Кроме того, трансгенные крысы, то есть подоциты, помеченные флуоресцентными красителями и другими подходами к молекулярным биомаркерам, обеспечивают повышенную разрешающую способность для непосредственного мониторинга и количественной оценки белково-белковых взаимодействий и эффектов конкретных молекулярных изменений.
У мышей, у которых отсутствуют поверхностные клубочки после четырехнедельного возраста, односторонняя мочеточниковая обструкция (UUO) в течение нескольких недель использовалась для индуцирования поверхностных клубочков. Поскольку эта индукционная модель не позволяет проводить базовые исследования, мы количественно оценили влияние UUO на клубочковые процессы в модели UUO у мюнхенских крыс Wistar Frömter (MWF), которые имеют поверхностные клубочки в физиологических условиях. Модель UUO в течение пяти недель или более вызывала значительные изменения в грубой морфологии почек, перитубулярном и клубочковом микроциркуляторном русле, а также структуре и функции канальцевого эпителия. Поток клубочковых и перитубулярных эритроцитов (эритроцитов) значительно снизился (р< 0,01), вероятно, из-за значительного увеличения приверженности лейкоцитов (ЛЕЙК) в клубочковых и перитубулярных капиллярах. Коэффициент клубочкового просеивания альбумина увеличился с 0,015 ± 0,002 у необработанных MWF до 0,045 ± 0,05 у 5-недельных крыс UUO MWF. Двенадцать недель UUO привели к дальнейшему увеличению поверхностной клубочковой плотности и коэффициента клубочкового просеивания (GSC) для альбумина. Флуоресцентный альбумин, отфильтрованный через клубочки, не реабсорбировался проксимальными канальцами. Эти данные свидетельствуют о том, что использование UUO для индуцирования поверхностных клубочков ограничивает способность изучать и интерпретировать нормальные клубочковые процессы и изменения заболевания.

Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Здесь мы представляем протокол с использованием 2-фотонной микроскопии у мюнхенских крыс Wistar Fromter с поверхностными клубочками для количественной оценки влияния длительной обструкции мочеточника на клубочковую динамику и функцию.

Использование 2-фотонной микроскопии для количественной оценки влияния хронической односторонней обструкции мочеточника на клубочковые процессы

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

Данные, представленные в этом исследовании, показывают драматические последствия односторонней обструкции мочеточника на функцию почек, воспаление и фиброз. Это помогает нам понять патофизиологические механизмы односторонней обструкции мочеточника. Основным преимуществом этого метода является способность изучать клеточно-клеточные взаимодействия, субклеточные события и динамически связывать структуру и функцию в функционирующей почке.Демонстрация мочеточниковой процедуры будет сделана доктором Сильвией Кампос-Бильдербек, которая является хирургом в нашей лаборатории. Для начала обезболивайте крысу, затем сделайте разрез вдоль средней линии и найдите левую почку, чтобы отделить ее от окружающих брюшиных органов. После локализации почечной ножки, включающей почечную артерию, почечную вену и мочеточник, отделите мочеточник, не повреждая деликатную структуру.Используйте щипцы, чтобы зациклить и завязать 3-0 шов вокруг мочеточника, затем завяжите узел на несколько миллиметров по обе стороны от первого узла, чтобы обеспечить полную обструкцию. Как только мочеточник будет перевязан, аккуратно закройте последовательные мышечные слои, затем полностью закройте живот. Закройте внешнюю кожу хирургическими скобами.Для хирургической подготовки поместите анестезированную крысу с внутренней венозной линией доступа на бок с выбритым левым боком лицом вверх плоско и прямо на столе. Убедитесь, что передние лапы крысы касаются друг друга, как и задние лапы. Как только крыса будет позиционирована, пальпируйте левый бок чуть ниже ребер, чтобы пощупать почку и определить естественное положение в брюшной полости, затем проведите линию, используя постоянный маркер вдоль бритой области, разделив центр почек пополам в ориентации нос к хвосту.Используйте пару зубчатых щипцов, чтобы схватить и поднять кожу вверх и зажать постоянную маркерную линию с помощью пары гемостатов, чтобы раздавить подлежащую сосудистую систему и предотвратить кровотечение. Повторите процедуру для тонкого наружного мышечного слоя, чтобы свести к минимуму кровотечение. Чтобы сделать окончательный разрез тонкого внутреннего мышечного слоя брюшной полости, прощупайте почку, чтобы оценить размер и положение, и поднимите внутренний мышечный слой парой щипцов, затем раздавите линию, которая делит кожу пополам над почкой с помощью гемостатов, что составляет примерно 1/3 предполагаемого размера почки.Сохраняя захват мышечного слоя щипцами, сделайте окончательный разрез. Затем используйте щипцы в каждой руке, чтобы захватить и удерживать почечный жир на нижнем полюсе почки с техникой «рука-через руку», работающей вниз. Крепко схватив жир одной рукой, потяните жир и очень аккуратно сожмите почку через разрез.Если почка не проходит насквозь, легко расширяйте разрез. Чтобы идентифицировать белые кровяные клетки или лейкоциты, застрявшие в капиллярных петлях, вводят ядерное пятно Hoechst 33342 со скоростью 8 микрограммов на килограмм веса крысы через внутреннюю венозную линию доступа. На микроскоп поместите открытую почку к краю чашки с небольшим вращением, чтобы брюшная сторона почки соприкасалась с крышкой, а спинная сторона была обращена в сторону от края.Чтобы еще больше свести к минимуму движение, упакуйте две стерильные марлевые подушечки 2 на 2, смоченные физиологическим раствором против спинной стороны почки, усиливая контакт брюшной стороны почки с краем. Когда образец позиционируется, посмотрите через окуляр микроскопа при эпифлуоресцентном освещении с помощью двухпроходного кубика родамина FITC. Если движение обнаружено в положении образца, внесите незначительные коррективы, отрегулировав марлю, гарантируя, что она не проталкивается под почку.Слегка переверните крысу, чтобы грудная клетка была дальше от тарелки. Сканируйте поверхность почки с помощью эпифлуоресцентного освещения и отмечайте положения клубочков с помощью программного обеспечения, связанного с моторизованным контроллером стадии. Для каждого цветового канала под 2-фотонной подсветкой возьмите неглубокий 3D-объем верхней части каждого отмеченного клубочка, чтобы служить фоновым изображением.В опции отображения программного обеспечения для визуализации используйте псевдоцветную палитру для визуализации слабых интенсивностей фоновой флуоресценции клубочковых капиллярных петель. Используя поверхностный кровеносный сосуд в качестве фокусной точки, медленно вводят флуоресцентный сывороточный альбумин Texas Red RAP или TRRSA, наблюдая за подъемом и падением флуоресценции из-за системного распределения, пока интенсивность в перитубулярной сосудистой и капиллярной петлях не будет чуть ниже насыщения. Через 10 минут приобретите 3D-объемы для всех отмеченных и изображенных клубочков с интервалом в 1 микрометр.Найдите подходящий сосуд, капиллярную петлю или перитубулярный сосуд, затем поверните изображение, используя функцию Rotate, поскольку функция линейного сканирования в программном обеспечении для получения изображений требует, чтобы сосуд был перпендикулярным. После того, как сосуд повернут и лежит ровно, выберите функцию XT в меню «Приобретение» и настройте его на сканирование 4000 строк. Поместите линию поперек исследуемого сосуда с фокальной плоскостью на максимальный диаметр отрезка.Затем щелкните левой кнопкой мыши на цветном составном изображении и выберите вкладку «Сделать снимок», чтобы создать эталонное изображение области, где было выполнено сканирование линии. Немедленно нажмите кнопку Пуск, чтобы захватить линейное сканирование судна. Позже импортируйте сканы линий в программное обеспечение для обработки изображений, чтобы определить скорость потока RBC.В раскрывающемся меню Измерение откройте диалоговое окно Показать статистику региона и выберите инструмент «Рисование одной линии», чтобы нарисовать линию, соответствующую наклону теней RBC. Отметив ширину и высоту линии, используйте уравнение для расчета скорости, а затем получите в среднем пять вычислений, чтобы сообщить о скорости для каждого сканирования строки. Центрируйте клубочек в поле визуализации и принимайте набор 3D-данных, начиная с клубочковой поверхности и заканчивая 30-35 микрометрами.Используйте шаг размером 1 микрометр в направлении Z. Идентифицируйте ЛЕЙК, сравнивая синий канал Хёхста с каналом техасского красного альбумина, ища исключение красного красителя в капиллярной петле и соответствующего ядерного пятна. Если WBC кажутся статичными на трех оптических секциях, определите ячейки как приклеенные, а затем сообщите значения как вхождение по 10 оптическим секциям от верхней части клубочка, взятым с интервалом в 1 микрометр.Количество клубочков на поле у мюнхенских крыс Wistar Fromter или MWF было увеличено в 5-недельной группе UUO, чем у необработанных крыс. Крысы Sprague-Dawley, или крысы SD, перешли от отсутствия поверхностных клубочков к 2,02 на поле после пяти недель односторонней обструкции мочеточника. Наблюдались трехмерные реконструированные изображения для просмотра почечной поверхности.5-недельная односторонняя обструкция урета у крыс SD не привела к областям, напоминающим нормальный канальцевый эпителий, как видно у MWF, необработанных и частично у 5-недельных крыс UUO MWF. При исследовании динамики почечных сосудов почечный кровоток был достоверно снижен в 5-недельных группах UUO MWF и SD по сравнению с необработанными крысами. Скорость RBC в клубочковых капиллярных петлях была значительно снижена у 5-недельных крыс UUO MWF и SD по сравнению с необработанными крысами MWF.Кроме того, у необработанных крыс MWF было меньше ЛЕЙК на 10 оптических участков сверху, в то время как число увеличилось у 5-недельных UUO MWF и 5-недельных UUO SD крыс. При односторонней обструкции уретола наблюдалось увеличение проницаемости альбумина. Накопление альбумина в пространстве Боумена было интенсивным после односторонней обструкции уретола.Эндоцитоз сегмента S1 в больших количествах альбумина наблюдается при физиологических условиях у необработанных КРЫС MWF. Такое же поглощение не наблюдалось у крыс MWF или SD после 5 недель односторонней обструкции уретала. Многие различные методы, такие как повторная визуализация для изучения процесса с течением времени, фиксация определенной области для визуализации и последующее использование фиксированной ткани для проведения микроскопии с более высоким разрешением, могут быть выполнены в сочетании с этим методом.Техника считается разрушительной технологией. Это позволило следователям ответить на многие новые вопросы. При этом были предоставлены новые идеи и получены данные о смене парадигмы.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Contusive модели Односторонние шейки Травма спинного мозга с помощью бесконечного Ударный Horizon

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Количественная клубочковой проницаемости Флуоресцентные макромолекул Используя 2-фотонной микроскопии в Мюнхене крыс Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

Мышиной модели необратимые и обратимые одностороннего мочеточника непроходимости

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; ДБ</sup&gt; Мышь Модель сахарного диабета 2 типа: поджелудочной Островок изоляции и живых клеток 2-Фотон изображений интактных островков

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Использование ламинирование Методика Выполните конфокальной микроскопией Человеческой склеры


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Анализируя Благотворное влияние пищевых добавок на Кишечный Эпителиальное барьерные функции Во время экспериментального колита

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Нервосберегающая Середина-уретральная обструкция (Nemo) у самок мелких грызунов

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Измерение воздействия бактерий и химических веществ на кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...