Name: using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 och P30DK079312 (till B.A.M.). Vi tackar personalen vid Genomics Core Facility vid Research Technology Support Facility (RTSF) vid Michigan State University för att ha utfört Nanostring-analysen.

<ol>
	<li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Indiana+O'Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis.">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li><li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney:+a+micropuncture+study.">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology.">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats.">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li><li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex:+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains.">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li><li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+rat+homologue+of+podocin:+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli.">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice.">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li><li>Schie&#223;l, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+nephrons+in+BALB/c+and+C57BL/6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney.">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499 (2013).</li><li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction:+a+new+look+at+an+old+model.">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li><li>Yang, H. -. C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+kidney+disease.">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li><li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags.">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li><li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy.">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li><li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2.">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330 (2016).</li><li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model.">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li><li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die:+Is+there+any+cell+death+in+podocytes.">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li><li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease.">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte &amp; Blood Pressure E &amp; BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li><li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis.">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).</li><li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD.">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li><li>M&#252;hlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome.">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).</li><li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periostin:+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells.">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li><li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2/M.">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats.">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells:+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states.">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+bottom+and+using+it:+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy.">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674 (2014).</li><li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus:+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling.">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li><li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus.">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li><li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus.">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li><li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis.">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter.

Studien av glomerulär fysiologi har sett många olika tillvägagångssätt, framför allt användningen av mikropunktur, perfusion av isolerade glomeruli och mikroskopi. Tillgången på ytglomeruli hos München Wistar-råttor, Fromter- och Simonsen-stammar, har möjliggjort dynamiska in vivo-studier . En viktig anmärkning för utredare som använder denna teknik är behovet av att ställa in förvärvsparametrar för att upprätthålla konsekventa bilder mellan studier, så att autofluorescensen i vävnad förblir konsekvent. Genom att använda en dubbelpassfluorescein / rhodaminepifluorescenskub och justera förstärkningsinställningarna till de gröna och röda emissionskanalerna för att efterlikna på datorskärmen vad som ses genom okularen kommer att säkerställa en konsekvent färgsignatur i autofluorescensen även mellan olika mikroskopsystem.
Fromter-stammen har använts i stor utsträckning eftersom den har ett minskat antal totala glomeruli, ~ 75% normala, och männen utvecklar spontant högt blodtryck vid cirka 12 veckors ålder, med progressiv proteinuri och efterföljande fokal glomerulär skleros, så småningom dör av njursvikt12. Användningen av dessa råttor och tillsatsen av 2-fotonmikroskopi med dess reducerade fototoxicitet, förbättrade penetrationsdjup och förmågan att se flera fluorescerande sonder samtidigt banade väg för nya upptäckter 1,4,5. Med utvecklingen av datorhårdvara och programvara är kvantitativa data nu standarden för alla 2-fotonlaboratorier. Flera kvantitativa tekniker har utvecklats och tillämpats på glomerulära, proximala tubulära, vaskulära och interstitiella processer under fysiologiska och sjukdomsförhållanden 1,4,5,27,28,29,30.
Transgena musgenererande anläggningar tillförde en ny dimension till studien av njurfysiologi och patologi, och det var bara en tidsfråga tills detta kombinerades med 2-fotonmikroskopi för att ytterligare avgränsa betydelsen av specifika genprodukter i njurstruktur och funktion. Musglomeruli, utom hos mycket unga möss, ligger emellertid över 100 μm från njurens yta9. Tvåfotonmikroskopi utförs bäst på ett djup av mellan 20 och 50 μm som upplösning, och fluorescensintensiteten minskar snabbt därefter på grund av ljusspridning av utemitterat ljus och absorption från interaktion med hemoglobin. Därför var det nödvändigt att inducera ytglomeruli. Det tillvägagångssätt som vanligtvis används är en långvarig ensidig obstruktionsmodell i 12 veckor. Eftersom dessa modeller inte tillåter baslinjebestämningar är det inte möjligt att separera effekterna av UUO från den process som studeras.
Med hjälp av MWF-råttor kan man jämföra baslinjens glomerulära funktion med den följande UUO. Denna UUO-modell är känd för att inducera inflammation och en snabb frekvens av fibros och har använts för att studera CKD och fibros10,11,12. Som förväntat var det en ökning av ytglomeruli hos både MWF- och SD-råttorna. Dessutom var de kvantitativa resultat som erhölls efter UUO för MWF- och SD-råttor mycket jämförbara. Minskningen av blodflödet som registrerats här hade tidigare rapporterats jämföra mikroskopiska data efter UUO med mikropunkturdata3. Det var också välkänt att tubulär och interstitiell histologi är markant förändrad, och PT: erna är mestadels icke-funktionella, som rapporterats här, med brist på albuminendocytos. Studierna i figur 2 och figur 3 visar en dramatisk minskning av RBC-flödeshastigheten i glomerulära och peritubulära kapillärer och förbättrad WBC-vidhäftning. Minskningarna i flödet beror sannolikt på kapillärblockering från WBC-vidhäftning och rouleauxformationer.
För att ytterligare utvärdera inflammation kvantifierade vi albuminpermeabiliteten och visade att den ökade tiofaldigt. Dessutom visade isolerade glomeruli att mRNA-uttrycket ökade för många gener som tidigare var kända för att öka vid njurinflammation i en mängd olika njursjukdomstillstånd 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Ökningarna i glomerulär ytdensitet och albuminpermeabilitet var progressiva, vilket framgår av 12-veckors UUO-data. De nuvarande uppgifterna är de första som direkt visar att glomeruli genomgår betydande strukturella skador, inflammation och molekylära förändringar i UUO-modellen. Resultaten överensstämmer med en tidigare studie av hel njurvävnad som analyserade fårnjurebiopsier efter UU och fann flera inflammationsmarkörer förhöjda19. De nuvarande resultaten indikerar att markant inflammation finns inom glomeruli, tidigare endast känd för kortikal vävnad.
Nuvarande data skiljer sig från tidigare studier på möss där inga förändringar hittades i vidhäftningsmolekyluttryck, komplementavsättning och neutrofil infiltration mellan 12-veckors posthydronefrotisk och normal glomeruli31. Dessutom använde Hickey-laboratoriet 12-veckors UUO-modellen för att studera immunreaktioner hos glomeruli hos möss. De fann inga skillnader i neutrofil infiltration mellan fyra veckor gammal musglomeruli och postobstruktiv glomeruli32,33. Dessa senare studier genomfördes efter att bäckenet i den blockerade njuren dränerades på urin. Vi gjorde inte detta eftersom vi ville bestämma effekten av UUO på glomerulär funktion som det skulle vara in vivo, utan att artificiellt avlägsna vätskan som orsakar hindret. Slutligen ersätts användningen av UUO hos möss med avbildning av glomeruli vid mer än 100 μm under ytan. Även om det är möjligt finns det en avvägning av upplösning och intensitet, båda reduceras avsevärt när en går utöver 50 μm34.
De resultat som presenteras är inte förvånande om man pusslar ihop data från den befintliga litteraturen om histologiska förändringar, bildning av atubulär glomeruli, inflammation, fibros, hemodynamik10,11,12. De data som presenteras, inklusive WBC-vidhäftning, rouleauxformationer, glomerulära molekylära inflammationsmarkörer och ökad albuminpermeabilitet, indikerar ytterligare den omfattande inflammation som pågår i denna UUO-modell även vid fem veckor och som också finns vid tolv veckor. Det är uppenbart att kronisk UUO inte är ett fysiologiskt tillstånd, och användningen av UUO för att inducera ytglomeruli representerar en skademodell. MWF-råttorna, som har ytglomeruli under fysiologiska förhållanden, kan studeras longitudinellt när skada uppstår. Det är möjligt att generera transgena råttor, och många utredare skapar dem med biosensorer för att ställa specifika frågor. I synnerhet har Medical College of Wisconsin nu en koloni av MWF-råttor och har gjort transgena råttor i syfte att studera glomerulära processer under fysiologiska och patologiska förhållanden. Dessa MWF-råttor erbjuder ett utmärkt tillfälle att studera glomerulära processer hos normala, sjuka och genetiskt förändrade råttor.

Att förstå glomerulära processer, särskilt podocytbiologi, har varit ett mål i över 50 år. München Wistar-råttor med ytglomeruli har spelat en central roll i dessa studier, inklusive mikropunkturstudier, för att förstå många aspekter av fysiologiska och patologiska processer 1,2,3. Användningen av mikroskopi för att studera glomerulära komponenter intravitalt var begränsad på grund av effekterna av fototoxicitet fram till tillkomsten av 2-fotonmikroskopi som minimerade denna toxiska exponering och ökade penetrationsdjupet 1,2. Tillsammans med snabba framsteg inom datorhårdvara och programvara har detta möjliggjort tredimensionella (3D) och fyrdimensionella (tids) studier i timmar i en enda inställning 1,4,5.
Kvantifieringen av glomerulärt kapillärblodflöde, vasokonstriktion och dilatation som svar på läkemedel, permeabilitet och effekterna av laddning på permeabilitet och inflammation är bara några av de glomerulära processer som har studerats. Dessutom är S1-segmentet av den proximala tubulen identifierbar, och skillnaderna i beteendet hos S1 och S2 rörformigt epitel kan kvantifieras 1,4. Studier på möss, särskilt med den universella tillgängligheten av mustransgena anläggningar, har lett till snabba framsteg i förståelsen av molekylärbiologin för glomerulära sjukdomsprocesser. Enskilda proteiner är ansvariga för glomerulär dysfunktion i knockoutstudier, särskilt med avseende på proteinuri 6,7,8. Användningen av musmodeller för glomerulära avbildningsstudier har dock varit begränsad eftersom glomeruli är mer än 100 μm under ytan i de många studerade stammarna9.
Detta har lett till att utredare utvecklat och använt musmodeller som resulterar i ytglomeruli som kan studeras. Den vanligaste modellen är användningen av komplett UUO10,11,12. I slutet av den förlängda UUO-perioden finns det många ytglomeruli i möss njurar som kan och har studerats13,14. Det har inte gjorts någon baslinje- eller kontrollstudie i dessa musstudier för att bestämma effekterna av långvarig UUO på glomerulär biologi. Eftersom detta är en allvarlig och långvarig skademodell som resulterar i snabb fibros och kortikal förstörelse10,11,12, antog vi att det skulle finnas effekter på glomerulära processer och funktion. För att besvara denna fråga användes München Wistar Fromter (MWF) råttor med ytglomeruli för att studera kontroll-/baslinjeparametrar, och baslinjefyndet jämfördes med glomerulära studier på MWF-råttor efter fem veckors UUO. Vi studerade också Sprague Dawley (SD) råttor som inte har ytglomeruli efter UUO. Resultaten tyder på att 5 veckors UUO hos MWF- och SD-råttor verkligen ökar antalet ytglomeruli. Dessa var emellertid onormala glomeruli med markanta förändringar i glomerulärt blodflöde, inflammation och makromolekylpermeabilitet och storlek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#421752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 72962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#72930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Note: Version 7.1r1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Dissecting Scissors</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 78180-1C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph Image processing Software</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>Cat# 78266-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corportation</td>
			<td>2007 version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reptitherm Undertank Heater</td>
			<td>Zoomed</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11-889-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat# 70665-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes

Att tillämpa nya mikroskopimetoder på lämpliga djursjukdomsmodeller för att utforska njurens dynamiska fysiologi är fortfarande en utmaning. Råttor med ytglomeruli ger en unik möjlighet att undersöka fysiologiska och patofysiologiska processer med hjälp av intravital 2-fotonmikroskopi. Kvantifiering av glomerulärt kapillärblodflöde och vasokonstriktion och dilatation som svar på läkemedel, permeabilitet och inflammation är bara några av de processer som kan studeras. Dessutom ger transgena råttor, dvs podocyter märkta med fluorescerande färgämnen och andra molekylära biomarkörmetoder, ökad upplösning för att direkt övervaka och kvantifiera protein-proteininteraktioner och effekterna av specifika molekylära förändringar.
Hos möss, som saknar ytglomeruli efter fyra veckors ålder, har ensidig ureteral obstruktion (UUO) i flera veckor använts för att inducera ytglomeruli. Eftersom denna induktionsmodell inte tillåter baslinjestudier kvantifierade vi effekterna av UUO på glomerulära processer i UUO-modellen i München Wistar Frömter (MWF) råttor, som har ytglomeruli under fysiologiska förhållanden. UUO-modellen i fem veckor eller mer inducerade signifikanta förändringar av brutto njurmorfologi, den peritubulära och glomerulära mikrovaskulaturen, liksom strukturen och funktionen hos rörformiga epitel. Flödet av glomerulära och peritubulära röda blodkroppar (RBC) minskade signifikant (p < 0,01), troligen på grund av den signifikanta ökningen av vidhäftningen av vita blodkroppar (WBC) inom glomerulära och peritubulära kapillärer. Den glomerulära siktningskoefficienten för albumin ökade från 0,015 ± 0,002 i obehandlade MWF till 0,045 ± 0,05 hos 5 veckor gamla UUO MWF-råttor. Tolv veckors UUO resulterade i ytterligare ökningar av ytans glomerulära densitet och glomerulär siktningskoefficient (GSC) för albumin. Fluorescerande albumin filtrerat över glomeruli reabsorberades inte av de proximala tubulerna. Dessa data tyder på att användning av UUO för att inducera ytglomeruli begränsar förmågan att studera och tolka normala glomerulära processer och sjukdomsförändringar.

Watch this Scientific Journal Video about Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes at JoVE.com

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Här presenterar vi ett protokoll med 2-fotonmikroskopi i München Wistar Fromter-råttor med ytglomeruli för att kvantifiera effekterna av långvarig ureteral obstruktion på glomerulär dynamik och funktion.

Använda 2-fotonmikroskopi för att kvantifiera effekterna av kronisk ensidig ureteral obstruktion på glomerulära processer

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

I de data som presenteras i denna studie visas de dramatiska effekterna av ensidig ureteral obstruktion på njurfunktion, inflammation och fibros. Det hjälper oss att förstå de patofysiologiska mekanismerna för ensidig ureteral obstruktion. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att studera cell-cellinteraktioner, subcellulära händelser och associera struktur och funktion på ett dynamiskt sätt inom en fungerande njure.Demonstrera det ureterala förfarandet kommer att göras av Dr.Silvia Campos-Bilderback som är kirurg i vårt laboratorium. För att börja, bedöva råttan, gör sedan ett snitt längs mittlinjen och lokalisera den vänstra njuren för att skilja den från de omgivande peritoneala organen. Efter att ha lokaliserat njurpedikeln, som består av njurartären, njurvenen och urinledaren, separera urinledaren utan att skada den känsliga strukturen.Använd tång för att slinga och knyta en 3-0 sutur runt urinledaren, knyt sedan en knut några millimeter på vardera sidan av den första knuten för att säkerställa fullständig obstruktion. När urinledaren är bunden, stäng försiktigt de successiva muskelskikten och stäng sedan buken helt. Stäng den yttre huden med kirurgiska häftklamrar.För kirurgisk förberedelse, placera den bedövade råttan med en inre venös åtkomstlinje på sidan med den rakade vänstra flanken uppåt platt och rakt på bordet. Se till att råttans främre tassar vidrör varandra liksom de bakre tassarna. När råttan är placerad, palpera den vänstra flanken strax under revbenen för att känna för njuren och bestämma den naturliga positionen i buken, rita sedan en linje med en permanent markör längs det rakade området och skär njurcentret i en näsa-till-svans-orientering.Använd ett par tandade pincett för att ta tag i och lyfta huden uppåt och nyp den permanenta markörlinjen med ett par hemostater för att krossa den underliggande kärlen och förhindra blödning. Upprepa proceduren för det tunna yttre muskelskiktet för att minimera blödning. För att göra det sista snittet av det tunna inre bukmuskelskiktet, palpera njuren för att uppskatta storleken och positionen och lyft det inre muskelskiktet med ett par pincett och krossa sedan en linje som skär huden ovanför njuren med hemostater som är ungefär 1/3 den uppskattade storleken på njuren.Medan du behåller greppet på muskelskiktet med pincetten, gör det sista snittet. Använd sedan pincett i varje hand för att greppa och hålla njurfettet vid njurens nedre pol med en hand-över-hand-teknik som arbetar nedåt. Ha ett fast grepp om fettet med en hand, dra fettet och pressa försiktigt njuren genom snittet.Om njuren inte passerar, bredda lätt snittet. För att identifiera de vita blodkropparna eller WBC: erna som sitter i kapillärslingorna, administrera Hoechst 33342 kärnfläck med 8 mikrogram per kg råttvikt via en inre venös åtkomstledning. På mikroskopet placerar du den exponerade njuren mot skålens kant med en liten rotation så att njurens buksida kommer i kontakt med lockglidningen och ryggsidan är vänd bort från kanten.För att ytterligare minimera rörelsen, packa två sterila 2-till-2 gasbindor fuktade med saltlösning mot njurens dorsala sida som förstärker kontakten på njurens buksida till kanten. När provet är placerat, titta igenom mikroskopets okular under epifluorescensbelysning med hjälp av en dubbelpass rhodamin FITC-kub. Om en rörelse detekteras i provläget, gör mindre justeringar genom att justera gasbindningen så att den inte trycker under njuren.Rulla råttan över något så bröstkorgen är längre bort från skålen. Skanna njurens yta med epifluorescensbelysning och markera glomerulipositionerna med hjälp av programvaran som är associerad med den motoriserade stegstyrenheten. För varje färgkanal under 2-fotonbelysning, ta en grund 3D-volym av den övre delen av varje markerad glomerulus för att fungera som bakgrundsbild.I visningsalternativet för bildprogramvaran använder du en pseudofärgpalett för att visualisera de svaga intensiteterna i bakgrundsfluorescensen hos de glomerulära kapillärslingorna. Med hjälp av ett ytligt blodkärl som kontaktpunkt, infusera långsamt det fluorescerande Texas Red RAP -serumalbuminet eller TRRSA medan du observerar fluorescensens uppgång och fall på grund av den systemiska fördelningen tills en intensitet i peritubulär vaskulatur och kapillärslingor är strax under mättnad. Efter 10 minuter, skaffa 3D-volymer för alla markerade och avbildade glomeruli med 1 mikrometers intervall.Hitta ett lämpligt kärl, antingen en kapillärslinga eller ett peritubulärt kärl, och rotera sedan bilden med funktionen Rotera eftersom linjeskanningsfunktionen i bildförvärvsprogramvaran kräver att kärlet är vinkelrätt. När fartyget har roterats och ligger platt väljer du XT-funktionen på menyn Förvärv och ställer in den så att den skannar 4 000 rader. Placera linjen över fartyget som ska undersökas med fokalplanet vid segmentets maximala diameter.Vänsterklicka sedan på den sammansatta färgbilden och välj fliken Ta ögonblicksbild för att skapa en referensbild av området där linjeskanningen togs. Klicka omedelbart på Start för att fånga fartygets linjeskanning. Senare importerar du radskanningarna till bildbehandlingsprogramvaran för att bestämma RBC-flödeshastigheten.Under rullgardinsmenyn Mått öppnar du dialogrutan Visa regionstatistik och väljer verktyget Enkel radritning för att rita en linje som matchar lutningen på RBC-skuggorna. Efter att ha noterat linjens bredd och höjd, använd en ekvation för att beräkna hastigheten och få sedan i genomsnitt fem beräkningar för att rapportera hastigheten för varje linjeskanning. Centrera en glomerulus i bildfältet och ta en 3D-datauppsättning som börjar vid den glomerulära ytan och slutar vid 30 till 35 mikrometer.Använd en stegstorlek på 1 mikrometer i Z-riktningen. Identifiera WBC: erna genom att jämföra den blå Hoechst-kanalen med Texas Red albumin-kanalen genom att leta efter uteslutning av rött färgämne i kapillärslingan och en motsvarande kärnfläck. Om WBC: erna verkar statiska över tre optiska sektioner, definiera cellerna som vidhäftade och rapportera sedan värdena som förekomst per 10 optiska sektioner från toppen av glomerulus tagna med 1-mikrometerintervall.Antalet glomerulära per fält i München Wistar Fromter eller MWF råttor ökade i 5-veckors UUO-gruppen än hos obehandlade råttor. Sprague-Dawley-råttor, eller SD-råttor, gick från att inte ha någon ytglomeruli till 2,02 per fält efter fem veckor av den ensidiga ureterala obstruktionen. Tredimensionella rekonstruerade bilder observerades för att se njurytan.Den 5-veckors ensidiga uretala obstruktionen hos SD-råttorna resulterade inte i områden som liknar normal tubulär epitel som ses i MWF, obehandlad och delvis hos 5-veckors UUO MWF-råttor. I studien av den renala vaskulära dynamiken minskade njurblodflödet signifikant i 5-veckors UUO MWF- och SD-grupperna jämfört med obehandlade råttor. RBC-hastigheten inom de glomerulära kapillärslingorna minskade signifikant i 5-veckors UUO MWF och SD-råttor jämfört med obehandlade MWF-råttor.Dessutom hade obehandlade MWF-råttor färre WBC per 10 optiska sektioner uppifrån medan antalet ökade i 5-veckors UUO MWF och 5-veckors UUO SD-råttor. Med ensidig uretal obstruktion sågs en ökning av albuminpermeabiliteten. En albuminansamling inom Bowman -rummet var intensiv efter ensidig uretal obstruktion.S1-segmentet endocytos stora mängder albumin som observerats med fysiologiska tillstånd hos obehandlade MWF-råttor. Samma upptag kunde inte ses hos MWF- eller SD-råttorna efter 5 veckors ensidig uretal obstruktion. Många olika metoder som upprepad avbildning för att studera en process över tid, fixering av ett specifikt område för avbildning och efterföljande användning av den fasta vävnaden för att utföra mikroskopi med högre upplösning kan göras i samband med denna teknik.Tekniken anses vara störande teknik. Det gör det möjligt för utredarna att svara på många nya frågor. På så sätt har nya insikter tillhandahållits och paradigmskiftande data har erhållits.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

En kontusiva Modell av ensidiga cervikal ryggmärgsskada Använda oändliga Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantifiering glomerulär permeabilitet av fluorescerande makromolekyler Använda 2-foton mikroskopi i München Wistarråttor

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

En mus modell av Irreversible och Vändbar Ensidig ureteric Obstruktion

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Musmodell av typ 2-diabetes: Pancreatic Islet Isolering och Live-cell 2-Photon Imaging av intakt cellöar

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Med hjälp av en lamineringsteknik att utföra konfokalmikroskopi av Human Sclera


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analysera gynnsamma effekterna av Kosttillskott på intestinala epiteliala barriärfunktioner Under experimentell kolit

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Nervsparande Mid-uretral obstruktion (NEMO) hos kvinnliga smågnagare

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Mäta effekterna av bakterier och kemikalier på tarm permeabiliteten hos Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...