Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

والمؤلفان ممتنان جدا للمساعدة التقنية التي قدمتها آيسي أوزتورك وإيفا ألبرتيني. تم الحفاظ على الفئران المستخدمة لتوليد أنسجة الكبد تحت إشراف Uniiv.-Doz. الدكتور بيدر يانسن دور (معهد أبحاث الشيخوخة الطبية الحيوية في جامعة إنسبروك ، Rennweg 10 ، 6020 Innsbruck ، النمسا).

وأجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تم الحصول على كلية الخنازير طازجة من السوبر ماركت المحلي. تم حصاد أنسجة الكبد من الفئران من النوع البري C57BL6 التي تم الاحتفاظ بها في معهد أبحاث الشيخوخة الطبية الحيوية في جامعة إنسبروك ، Rennweg 10 ، 6020 Innsbruck ، النمسا تحت إشراف Uniiv.-Doz. الدكتور ?...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).</li><li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor.">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis.">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype.">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization,+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins.">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification.">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).</li><li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins:+Between+meaning+and+different+methods).">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li><li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes.">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(SDS-PAGE).">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li><li>. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011)</li><li>S&#248;rensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

الخطوات الحاسمة في البروتوكول يعد اتباع الإرشادات الشائعة للتعامل مع البروتينات أمرا ضروريا ، مثل العمل على الجليد وفي ظروف معتدلة من الأس الهيدروجيني والملح. استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني مفيد لهذه الطريقة ، في حين يوصى بشدة باستخدام مثبطات البروتيازوم. قد يؤدي تجميد الع?...

يعمل البروتين 1 (FAHD1) المحتوي على مجال FAH حقيقيات النواة كثنائي الوظيفة من أوكسالواسيتات (OAA) ديكاربوكسيلاز (ODx)1 وهيدرولاز أسيلبيروفات (ApH)2. وهي مترجمة في الميتوكوندريا 2 وتنتمي إلى عائلة FAH الفائقة الواسعة من الإنزيمات1،2،3،4،5،6. في حين أن نشاط ApH الخاص به ليس له أهمية تذكر فقط ، فإن نشاط ODx الخاص ب FAHD1 يشارك في تنظيم تدفق دورة TCA1،7،8،9. OAA ليس مطلوبا فقط لتفاعل سينثاز السترات المركزي في دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل ولكنه يعمل أيضا كمثبط تنافسي لنازعة هيدروجيناز السكسينات كجزء من نظام نقل الإلكترون وكمستقلب كاتابليروتي. أدى انخفاض تنظيم التعبير الجيني FAHD1 في الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية (HUVEC) إلى انخفاض كبير في معدل تكاثر الخلايا10 ، وتثبيط كبير لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، المرتبط بالتحول المصاحب إلى تحلل السكر. يشير نموذج العمل إلى خلل الميتوكوندريا المرتبط بالشيخوخة (MiDAS) 11 الشبيه بالنمط الظاهري 8 ، حيث يتم تنظيم مستويات OAA الميتوكوندريا بإحكام بواسطة نشاط FAHD1 1,8,9.
من الأسهل الحصول على البروتين المؤتلف عن طريق التعبير والتنقية من البكتيريا12 بدلا من الأنسجة. ومع ذلك ، قد يكون البروتين المعبر عنه في البكتيريا متحيزا بسبب احتمال عدم وجود تعديلات ما بعد الترجمة ، أو قد يكون ببساطة مشكلة (أي بسبب فقدان البلازميد ، واستجابات الإجهاد البكتيري ، وروابط ثاني كبريتيد المشوهة / غير المشوهة ، وعدم وجود إفراز أو سوء إفراز ، وتجميع البروتين ، والانقسام البروتيني ، وما إلى ذلك). بالنسبة لبعض التطبيقات ، يجب الحصول على البروتين من تحلل الخلايا أو الأنسجة ، من أجل تضمين مثل هذه التعديلات و / أو استبعاد القطع الأثرية المحتملة. يدعم البروتين النقي من الأنسجة تطوير أجسام مضادة عالية الجودة ، و / أو مثبطات دوائية قوية ومحددة لإنزيمات مختارة ، مثل FAHD113.
تقدم هذه المخطوطة سلسلة من الطرق لاستخراج وتنقية FAHD1 من كبد الخنازير والفئران. تتطلب الطرق الموصوفة كروماتوغرافيا سائلة سريعة البروتين (FPLC) ولكنها تستخدم معدات مختبرية شائعة. يمكن العثور على طرق بديلة في أماكن أخرى14،15،16،17. بعد الاستخراج الكلي للبروتين ، يتضمن البروتوكول المقترح مرحلة اختبار ، حيث تتم مناقشة البروتوكولات الفرعية لهطول الأمطار بكبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني (الشكل 1). بعد تحديد هذه البروتوكولات الفرعية ، يتم استخراج البروتين محل الاهتمام عبر استراتيجية متسلسلة باستخدام التبادل الأيوني وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع FPLC. وبناء على هذه المبادئ التوجيهية، يمكن تكييف البروتوكول النهائي بشكل فردي مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> الشكل 1: الاستراتيجية العامة لهذا البروتوكول. من أعلى إلى أسفل: يتم استخراج البروتين من الأنسجة. يتم إعداد تجانس الأنسجة وطردها مركزيا وترشيحها. لكل زوج من العينات الفائقة والمستمدة من الكريات ، يجب إجراء اختبارات لهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني (FPLC) للتحقيق في الظروف المثلى. بعد إنشاء هذه البروتوكولات الفرعية ، يمكن استخراج البروتين عن طريق إجراء متسلسل لهطول الأمطار بكبريتات الأمونيوم ، وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم المتكرر (FPLC) عند تركيزات متفاوتة من الأس الهيدروجيني والملح. يجب التحكم في جميع الخطوات بواسطة اللطخة الغربية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

فوماريلاسيتواتواتات هيدرولاز يحتوي على البروتين 1 (FAHD1) هو أول عضو محدد في عائلة FAH الفائقة في حقيقيات النوى ، حيث يعمل كأوكسالواسيتات ديكاربوكسيلاز في الميتوكوندريا. تقدم هذه المقالة سلسلة من الطرق لاستخراج وتنقية FAHD1 من كبد الخنازير والفئران. الطرق المغطاة هي كروماتوغرافيا التبادل الأيوني مع كروماتوغرافيا سائلة سريعة البروتين (FPLC) ، وترشيح هلام تحضيري وتحليلي مع FPLC ، ونهج بروتينية. بعد استخراج البروتين الكلي ، تم استكشاف هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وتم استخراج FAHD1 عبر استراتيجية متسلسلة باستخدام التبادل الأيوني وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يمكن تكييف هذا النهج التمثيلي مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية (التي يتم التعبير عنها بمستويات كبيرة) وتعديلها للأنسجة الأخرى. قد يدعم البروتين النقي من الأنسجة تطوير أجسام مضادة عالية الجودة ، و / أو مثبطات دوائية قوية ومحددة.

تم استخراج بروتين FAHD1 من كبد الخنازير والفئران باستخدام البروتوكول المعروض. بالنسبة لأنسجة الفأر ، يلزم وجود أعضاء متعددة للحصول على عدة ميكروغرام بعد خطوة التنقية النهائية. لهذا السبب ، تركز هذه المقالة على استخراج FAHD1 من كلى الخنازير ، وهي تجربة أكثر مثالية. يتم استخراج FAHD1 من كبد الفأر ل...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

يصف هذا البروتوكول كيفية استخراج البروتين 1 (FAHD1) المحتوي على مجال هيدرولاز fumarylacetoacetate من كبد الخنازير والفئران. يمكن تكييف الطرق المذكورة مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية وتعديلها للأنسجة الأخرى.

استخراج وتنقية بروتين FAHD1 من كبد الخنازير والكلى والفئران

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

تنقية البروتين المؤتلف من البكتيريا هي طريقة راسخة. ومع ذلك، قد تحدث العديد من المشاكل عند استخدام هذه التقنيات. وجود طرق لاستخراج البروتين من الأنسجة أمر جذاب بالتأكيد.الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن للمرء استخراج البروتين في شكله الفسيولوجي بما في ذلك جميع التأثيرات المتبادلة التي قد تؤثر على نشاطه القابل للطي والتحفيز. يمكن تكييف هذا النهج مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية وتعديله للأنسجة الأخرى. البروتين النقي من الأنسجة قد يدعم تطوير الأجسام المضادة عالية الجودة والمثبطات الدوائية.للبدء ، قم بإعداد مخزن مؤقت لتحلل البروتين عن طريق خلط 250 ملليلتر من PBS مع فلوريد الصوديوم 50 ملليمولار ، وفلوريد فينيل ميثيل سلفونيل واحد ، وميكروغرام لكل ملليلتر أبروتينين ، وواحد ملليمولير تنشيط أورثوفانادات. قم بتصفية الحل باستخدام وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر. تحضير أنابيب مع اثنين ملليلتر من المحلل التحلل لكل غرام من الأنسجة ووضعها على الجليد.لإعداد عينة الأنسجة ، قم بتشريح الأنسجة التي يبلغ حجمها حوالي 100 ملليغرام على صفيحة زجاجية نظيفة مسبقا موضوعة على الجليد في صندوق رغوة البوليسترين. انقل قطع الأنسجة إلى الأنابيب المعدة للتحلل اللاحق. لإعداد محلول كبريتات الأمونيوم المشبع ، قم بتسخين 500 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج إلى 70 درجة مئوية.أثناء التحريك ، أضف تدريجيا مسحوق كبريتات الأمونيوم حتى لا يذوب المزيد من كبريتات الأمونيوم. قم بتبريد هذا المحلول المشبع إلى درجة حرارة الغرفة وتخزينه عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. لتجانس أنسجة الكلى الخنازير ، سونيك التعليق ويفضل أن يكون ذلك عن طريق مسبار بالموجات فوق الصوتية مع الحفاظ على العينة على الجليد.في حالة أنسجة كبد الفأر ، استخدم مجانسا كهربائيا واغسله بانتظام في PBS لمنع الانسداد مع الحفاظ على العينات على الجليد. خذ 20 ميكرولتر من العينات وتحقق تحت المجهر مما إذا كانت خلايا الأنسجة المتجانسة قد دمرت بشكل صحيح. خلاف ذلك ، كرر التجانس.الطرد المركزي للأنابيب في 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. جمع supernatant في أنبوب جديد ووضعه على الجليد. قم لاحقا بتصفية supernatant باستخدام وحدات مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر.Aliquot supernatant في دفعات 10 ملليلتر وتجميدها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين على المدى القصير أو عند ناقص 80 درجة مئوية للتخزين لفترة أطول. قم بإعداد عينة 50 ميكرولتر ل SDS-PAGE أو تحليل اللطخة الغربية عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من خمسة أضعاف مخزن عينة SDS إلى 40 ميكرولتر من supernatant ثم غليها عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تحضير هلام متقطع 12.5٪ بولي أكريلاميد SDS-PAGE وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.لإجراء تحليل SDS-PAGE ، قم بتحميل آبار الجل لاحقا بسلم علامة البروتين ، وخمسة نانوغرام من البروتين المؤتلف FAHD1 البشري كعنصر تحكم إيجابي ، و 20 ميكرولتر من العينة المراد تحليلها ، والآبار المتبقية مع 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE المحضر. قم بتشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE عند 125 فولت باستخدام المخزن المؤقت SDS قيد التشغيل. بعد اكتمال SDS-PAGE ، قم بإجراء تحليل لطخة غربية ، وقم بفحص الأغشية باستخدام الجسم المضاد المتاح المرفوع ضد FAHD1.بعد تحضير الأليكوتات الفائقة كما هو موضح سابقا ، إما العملية بعد الذوبان أو المعالجة مباشرة بعد استخراج البروتين دون تجميد العينة. قم بتصفية العينة باستخدام وحدة مرشح 0.22 ميكرومتر لاستبعاد الرواسب المحتملة بعد الذوبان. قم بإعداد ستة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر على الجليد ، ثم انقل 250 ميكرولتر من العينة إلى كل أنبوب.إعداد سلسلة تخفيف من كبريتات الأمونيوم في الأنابيب المحضرة وتشكيل الحجم النهائي إلى 1،000 ميكرولتر مع المخزن المؤقت لتحلل البروتين. احتضان العينات عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها على دوار الأنبوب. باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة ، جهاز طرد مركزي بسرعة 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ونقل جميع المواد الفائقة بعناية إلى أنابيب منفصلة.قم بتجفيف الكريات الناتجة بالهواء وإعادة تعليق كل منها في 1000 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. لكل زوج من الكريات المعاد تعليقها و supernatant من الخطوة السابقة ، امزج 40 ميكرولتر مع 10 ميكرولترات من خمسة أضعاف المخزن المؤقت لعينة SDS واغلي عند 95 درجة مئوية مع أغطية مفتوحة حتى يتبخر معظم السائل. ثم أعد تعليق الكريات في خليط من 50٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد في ماء مقطر مزدوج.قم بإجراء SDS-PAGE عن طريق تحميل العينات المشتقة من الكريات المعاد تعليقها و supernatant في أزواج ، متبوعة بتحليل لطخة غربية. ومع ذلك ، قم بتشغيل المواد الهلامية عند 80 فولت لمدة ثلاث ساعات. قم بإعداد نظام FPLC باستخدام عمود التبادل الأنيوني أو الكاتيوني.اغسل العمود بخمسة أحجام عمود من 20٪ إيثانول في ماء مقطر مزدوج ، متبوعا بخمسة أحجام عمود من الماء المقطر المزدوج. ضع العينة على العمود إما عن طريق الحقن أو باستخدام مضخة عينة وجمع التدفق من خلالها. اغسل العمود بحجم عمود واحد من المخزن المؤقت منخفض الملح.قم بإعداد إزالة التدرج الخطي من مخزن مؤقت منخفض الملح بنسبة 100٪ إلى مخزن مؤقت عالي الملح بنسبة 100٪ ضمن ثلاثة أحجام أعمدة. جمع باستمرار واحد ملليلتر الكسور. بعد انتهاء التدرج ، استمر في التشغيل باستخدام مخزن مؤقت عالي الملح حتى لا يتم اكتشاف المزيد من القمم المرتبطة بالبروتين في الكروماتوجرام على نطاق حجم عمود واحد.ضع ملليلتر واحد من 25٪ SDS المذاب في 0.5 هيدروكسيد الصوديوم المولي والماء المقطر المزدوج لتنظيف العمود. اغسل العمود على التوالي بثلاثة أحجام عمود من الماء المقطر المزدوج وثلاثة أحجام عمود من الإيثانول بنسبة 20٪ في الماء المقطر المزدوج. اجمع عينات SDS-PAGE لجميع كسور الذروة والتدفق.قم بتجميد الأجزاء المجمعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد فحصها عن طريق اللطخة الغربية ، قم بإذابة وتجميع الكسور التي تحتوي على البروتينات ذات الأهمية وتجاهل الآخرين. لتنفيذ خطوة التنقية ، قلل من حجم محلول البروتين إلى ملليلترين باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي الفائقة.قم بتصفية المحلول بالتتابع باستخدام وحدات تصفية حقنة 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر لإزالة أي هطول مجهري. قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع حجم عمود واحد من المخزن المؤقت الجاري الذي يحتوي على ثنائي ثيوثريتول مللي مولار واحد. قم بتحميل العينة على العمود وقم بتشغيل وحدة الكروماتوغرافيا حتى يتم التخلص من جميع البروتينات كما هو موضح سابقا.قم بإعداد عينات 50 ميكرولتر ل SDS-PAGE وتحليل البقع الغربية الموصوفة سابقا. اغسل العمود على التوالي بحجم عمود واحد من الماء المقطر المزدوج وحجم عمود واحد من 20٪ من الإيثانول في الماء المقطر المزدوج. بعد إجراء تحليل اللطخة الغربية ، قم بتجميع جميع FAHD1 التي تحتوي على كسور.قلل حجم محلول البروتين إلى ملليلترين باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي الفائقة. يظهر فحص اللطخة الغربية وجود الخنازير FAHD1 في supernatant مع شريط عند 25 كيلودالتون بينما يعمل التحكم الإيجابي الموسوم عند 34 كيلودالتون . تم تنقية الخنازير FAHD1 من lysate بواسطة كروماتوغرافيا التبادل الأنيوني وتمت إزالة البروتينات الملزمة عن طريق الاستخلاص.تم تحديد الكسور التي تحتوي على الخنازير FAHD1 من خلال تحليل اللطخة الغربية ، مجمعة ومركزة. تم تنقية عينات البروتين من قبل SEC وتم تحديدها من خلال تحليل اللطخة الغربية. كان محصول بروتين FAHD1 الخنازير حوالي ملليغرام واحد مع مستوى 80٪ من النقاء.كشف تحليل اللطخة الغربية عن بروتين FAHD1 للفأر في التدفق جنبا إلى جنب مع البروتينات الأخرى. تم تطبيق التدفق من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. تم تجميع الكسور التي تحتوي على FAHD1 وتركيزها وتطبيقها على تحليل SDS-PAGE.ومع ذلك ، فإن غلة البروتين لم تكن عالية جدا. يزداد النشاط الأنزيمي المحدد للخنازير FAHD1 مع مستوى النقاء عند زيادة الكمية النسبية ل FAHD1 لكل بروتين كلي. تركيزات أعلى من كبريتات الأمونيوم تسبب تأثير الابتسامة ، والتي يمكن حلها في الجهد المنخفض.تم العثور على مزيد من البروتين في lysate و supernatant بتركيز 15٪. ومع ذلك ، عند تركيزات أعلى ، قد تترسب العينات ولا يمكن اكتشافها. يتطلب البروتوكول المعروض هنا أن يكون البروتين قابلا للحل.يجب اختبار وتحديد الظروف المثلى لهطول الأمطار ودرجة الحموضة أو تعديل الحجم للكروماتوغرافيا. يتم دعم دراسة الوظيفة الأنزيمية ، والتحقيق في بنية البروتين وتطوير الأجسام المضادة بشكل كبير عند استخراج البروتين من الأنسجة بدلا من استخراجه من البكتيريا.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

استخراج الكافيين والنشاط الأنزيمي والتعبير الجيني ل Synthase الكافيين من تعليق خلية النبات

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR موتاجينيسيس، الاستنساخ، التعبير، بروتوكولات تنقية البروتين السريع وتبلور النوع البري وأشكال متحولة من التربتوفان سينتاس

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

استخراج جانجليوسيد وتنقيته وتوصيفه

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية مع الإجهاد البروتيوكسي

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...