Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Forfatterne er meget taknemmelige for den tekniske bistand fra Ayse Öztürk og Eva Albertini. Mus, der blev brugt til generering af levervæv, blev opretholdt under tilsyn af Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institut for Biomedicinsk Aldringsforskning ved Innsbruck Universitet, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Østrig).

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer. Svinenyre blev opnået frisk fra det lokale supermarked. Levervæv blev høstet fra C57BL6 vildtypemus opretholdt ved Institut for Biomedicinsk Aldringsforskning ved Innsbruck Universitet, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Østrig under tilsyn af Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, omfattet af etisk tilladelse som projektleder udstedt i 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Vedligeholdelse og brug af musene til projektet er omfattet af etisk t...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).</li><li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor.">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis.">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype.">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization,+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins.">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification.">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).</li><li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins:+Between+meaning+and+different+methods).">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li><li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes.">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(SDS-PAGE).">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li><li>. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011)</li><li>S&#248;rensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

Kritiske trin i protokollen At følge fælles retningslinjer for håndtering af proteiner er afgørende, såsom at arbejde på is og ved moderate pH- og saltforhold. Anvendelsen af proteasehæmmere er gavnlig for metoden, mens brugen af proteasomhæmmere anbefales stærkt. Frysning og optøning af prøven kan altid resultere i proteinudfældning (i det mindste delvist), så enhver optøet alikvot initialproteinlysat (trin 2) skal behandles kontinuerligt uden pause. Centrifugering og filtrering efter o...

Det eukaryote FAH-domæneholdige protein 1 (FAHD1) virker som bifunktionelt oxaloacetanat (OAA) decarboxylase (ODx)1 og acylpyruvathydrolase (ApH)2. Det er lokaliseret i mitokondrier2 og tilhører den brede FAH-superfamilie af enzymer 1,2,3,4,5,6. Mens dens ApH-aktivitet kun er af mindre relevans, er ODx-aktiviteten af FAHD1 involveret i reguleringen af TCA-cyklusfluxen 1,7,8,9. OAA er ikke kun nødvendig for den centrale citratsyntasereaktion i tricarboxylsyrecyklussen, men fungerer også som en konkurrencedygtig hæmmer af succinatdehydrogenase som en del af elektrontransportsystemet og som en kataplerotisk metabolit. Nedregulering af FAHD1-genekspression i humane navlestrengsendotelceller (HUVEC) resulterede i en signifikant reduktion i hastigheden af celleproliferation10 og signifikant hæmning af mitokondriemembranpotentiale forbundet med en samtidig skift til glykolyse. Arbejdsmodellen refererer til mitokondriel dysfunktion associeret ældning (MiDAS)11-lignende fænotype8, hvor mitokondrielle OAA-niveauer er tæt reguleret af FAHD1-aktivitet 1,8,9.
Rekombinant protein er lettere at opnå via ekspression og oprensning fra bakterier12 snarere end fra væv. Imidlertid kan et protein udtrykt i bakterier være forudindtaget af mulig mangel på post-translationelle modifikationer eller kan simpelthen være problematisk (dvs. på grund af plasmidtab, bakterielle stressresponser, forvrængede / uformede disulfidbindinger, ingen eller dårlig sekretion, proteinaggregering, proteolytisk spaltning osv.). Til visse anvendelser skal protein udtages fra cellelysat eller væv for at inkludere sådanne ændringer og/eller for at udelukke mulige artefakter. Oprenset protein fra væv understøtter udviklingen af antistoffer af høj kvalitet og/eller potente og specifikke farmakologiske hæmmere for udvalgte enzymer, f.eks. for FAHD113.
Dette manuskript præsenterer en række metoder til ekstraktion og oprensning af FAHD1 fra svinenyre og muselever. De beskrevne metoder kræver hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC), men bruger ellers almindeligt laboratorieudstyr. Alternative metoder kan findes andre steder 14,15,16,17. Efter total proteinekstraktion involverer den foreslåede protokol en testfase, hvor underprotokoller for ammoniumsulfatudfældning og ionbytningskromatografi diskuteres (figur 1). Efter at have defineret disse underprotokoller ekstraheres proteinet af interesse via en sekventiel strategi ved hjælp af ionisk udveksling og størrelsesudelukkelseskromatografi med FPLC. På grundlag af disse retningslinjer kan slutprotokollen tilpasses individuelt til andre proteiner af interesse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> Figur 1: Den overordnede strategi for denne protokol. Fra top til bund: Protein ekstraheres fra væv. Vævshomogenat fremstilles, centrifugeres og filtreres. For hvert par prøver af supernatant og pelletsafledte skal der udføres test for ammoniumsulfatudfældning og ionisk udvekslingskromatografi (FPLC) for at undersøge optimale betingelser. Efter fastlæggelse af disse underprotokoller kan proteinet ekstraheres via en sekventiel procedure for ammoniumsulfatudfældning, ionisk udvekslingskromatografi og repetitiv størrelseseksklusionskromatografi (FPLC) ved varierende pH- og saltkoncentrationer. Alle trin skal styres af western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

Fumarylacetoacetathydrolasedomæneholdigt protein 1 (FAHD1) er det første identificerede medlem af FAH-superfamilien i eukaryoter, der fungerer som oxaloacetatdecarboxylase i mitokondrier. Denne artikel præsenterer en række metoder til ekstraktion og oprensning af FAHD1 fra svinenyre og muselever. Omfattede metoder er ionisk udvekslingskromatografi med hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC), præparativ og analytisk gelfiltrering med FPLC og proteomiske tilgange. Efter total proteinekstraktion blev ammoniumsulfatudfældning og ionisk udvekslingskromatografi undersøgt, og FAHD1 blev ekstraheret via en sekventiel strategi ved anvendelse af ionisk udveksling og størrelsesudelukkelseskromatografi. Denne repræsentative tilgang kan tilpasses andre proteiner af interesse (udtrykt i signifikante niveauer) og modificeres til andre væv. Oprenset protein fra væv kan understøtte udviklingen af antistoffer af høj kvalitet og/eller potente og specifikke farmakologiske hæmmere.

FAHD1-protein blev ekstraheret fra svinenyre og muselever ved hjælp af den præsenterede protokol. For musevæv kræves flere organer for at opnå flere μg efter det endelige oprensningstrin. Af denne grund fokuserer denne artikel på udvinding af FAHD1 fra svinenyrer, hvilket er et meget mere eksemplarisk eksperiment. Ekstraktionen af FAHD1 fra museleveren udføres for at præsentere vanskelighederne og mulige faldgruber i denne protokol. Det anbefales generelt at bruge organer, der viser et højt ekspressionsniveau a...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Denne protokol beskriver, hvordan man ekstraherer fumarylacetoacetathydrolasedomæneholdigt protein 1 (FAHD1) fra svinenyre og muselever. De anførte metoder kan tilpasses andre proteiner af interesse og modificeres til andre væv.

Ekstraktion og oprensning af FAHD1-protein fra svinenyre og muselever

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Oprensning af rekombinant protein fra bakterier er en veletableret metode. Der kan dog opstå flere problemer, når du bruger disse teknikker. At have metoder til at udtrække protein fra væv er helt sikkert tiltalende.Den største fordel ved denne metode er, at man kan udtrække proteinet i dets fysiologiske form, herunder alle gensidige virkninger, der kan påvirke dets foldning og katalytiske aktivitet. Denne fremgangsmåde kan tilpasses andre proteiner af interesse og modificeres til andet væv. Oprenset protein fra væv kan understøtte udviklingen af antistoffer af høj kvalitet og farmakologiske hæmmere.Til at begynde med skal du forberede proteinlysebuffer ved at blande 250 ml PBS med 50 millimolært natriumfluorid, en millimolær phenylmethylsulfonylfluorid, to mikrogram pr. Milliliter aprotinin og en millimolær aktiveret orthovanadat. Filtrer opløsningen ved hjælp af en 0,22 mikrometer sprøjtefilterenhed. Forbered rør med to milliliter lysisbuffer pr. Gram væv og læg dem på is.For at forberede vævsprøven skal vævet på ca. 100 mg hver på en forrenset glasplade anbragt på is i en polystyrenskumkasse. Overfør vævsstykkerne til de forberedte rør til efterfølgende lysis. For at fremstille en mættet ammoniumsulfatopløsning opvarmes 500 ml dobbelt destilleret vand til 70 grader Celsius.Under omrøring tilsættes gradvist ammoniumsulfatpulver, indtil der ikke er opløst mere ammoniumsulfat. Afkøl denne mættede opløsning til stuetemperatur og opbevar den ved fire grader Celsius natten over. For at homogenisere svinenyrevævet sonikere suspensionen fortrinsvis af en ultralydssonde, mens prøven holdes på is.I tilfælde af muselevervæv skal du bruge en elektrisk homogenisator og vaske den regelmæssigt i PBS for at forhindre tilstopning, mens prøverne holdes på is. Tag 20 mikroliter ud af prøverne og kontroller under mikroskopet, om cellerne i det homogeniserede væv er korrekt ødelagt. Ellers gentag homogeniseringen.Centrifuger rørene ved 10.000 gange G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Saml supernatanten i et frisk rør og læg det på is. Filtrer derefter supernatanten ved hjælp af 0,45 mikrometer og 0,22 mikrometer sprøjtefilterenheder.Aliquot supernatanten i 10 ml batches og frys dem ved minus 20 grader Celsius til kortvarig opbevaring eller ved minus 80 grader Celsius for længere opbevaring. Forbered en 50 mikroliter prøve til SDS-PAGE eller Western blot analyse ved at tilsætte 10 mikroliter af fem gange SDS prøvebufferen til 40 mikroliter af supernatanten og derefter koge ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Forbered en diskontinuerlig 12,5% polyacrylamid SDS-PAGE gel i henhold til producentens anvisninger.For at udføre SDS-PAGE-analyse skal gelens brønde efterfølgende fyldes med en proteinmarkørstige, fem nanogram humant FAHD1-rekombinant protein som en positiv kontrol, 20 mikroliter af prøven, der skal analyseres, og de resterende brønde med 20 mikroliter forberedt SDS-PAGE prøvebuffer. Kør SDS-PAGE gelerne ved 125 volt ved hjælp af SDS-løbebufferen. Når SDS-PAGE er afsluttet, skal du udføre en Western blot-analyse, undersøge membranerne ved hjælp af det tilgængelige antistof hævet mod FAHD1.Efter tilberedning af supernatante aliquoter som beskrevet tidligere, enten proces efter optøning eller proces direkte efter proteinekstraktion uden frysning af prøven. Prøven filtreres ved hjælp af en 0,22 mikrometer filterenhed for at udelukke mulige bundfald efter optøning. Forbered seks 1,5 milliliter rør på is, og overfør derefter 250 mikroliter prøve ind i hvert rør.Forbered en fortyndingsserie af ammoniumsulfat i de tilberedte rør og kru op for det endelige volumen til 1.000 mikroliter med proteinlysebuffer. Inkuber prøverne ved fire grader Celsius natten over på en rørrotator. Brug en bordpladecentrifuge, centrifuge ved 10.000 gange G i 30 minutter ved fire grader Celsius og overfør forsigtigt alle supernatanterne til separate rør.Lufttør de resulterende pellets og resuspend hver af dem i 1.000 mikroliter dobbelt destilleret vand. For hvert par resuspended pellet og supernatant fra det foregående trin blandes 40 mikroliter med 10 mikroliter fem gange SDS-prøvebufferen og koges ved 95 grader Celsius med åbne låg, indtil det meste af væsken er fordampet. Derefter resuspenderes pelleten i en blanding af 50% dimethylsulfoxid i dobbelt destilleret vand.Udfør SDS-PAGE ved at indlæse prøverne afledt af de resuspenderede pellets og supernatant parvis, efterfulgt af en Western blot-analyse. Kør dog gelerne ved 80 volt i tre timer. Konfigurer FPLC-systemet med kolonnen anionisk eller kationisk udveksling.Kolonnen vaskes med fem kolonnevolumener af 20 % ethanol i dobbeltdestilleret vand efterfulgt af fem kolonnevolumener dobbeltdestilleret vand. Prøven påføres kolonnen enten ved injektion eller ved hjælp af en prøvepumpe, og gennemstrømningen opsamles. Vask søjlen med et kolonnevolumen af den lave saltbuffer.Opret en lineær gradienteluering fra 100 % lav saltbuffer til 100 % høj saltbuffer inden for tre kolonnevolumener. Saml kontinuerligt en milliliter fraktioner. Når gradienten er afsluttet, skal du fortsætte med at køre med en høj saltbuffer, indtil der ikke påvises flere proteinrelaterede toppe i kromatogrammet over området med et kolonnevolumen.Påfør en milliliter 25% SDS opløst i 0,5 molært natriumhydroxid og dobbelt destilleret vand for at rense kolonnen. Kolonnen vaskes kontinuerligt med tre kolonnevolumener af dobbeltdestilleret vand og tre kolonnevolumener på 20% ethanol i dobbelt destilleret vand. Saml SDS-PAGE-prøverne af alle spidsfraktioner og gennemstrømningen.Snap fryse de opsamlede fraktioner i flydende nitrogen og opbevar dem ved minus 80 grader Celsius. Efter at have undersøgt dem via Western blot, tø op og pool de fraktioner, der indeholder proteinerne af interesse og kassere de andre. For at udføre rensningstrinnet reduceres volumenet af proteinopløsningen ned til to milliliter ved hjælp af ultracentrifugeringsfilterenheder.Filtrer opløsningen sekventielt med 0,45 mikrometer og 0,22 mikrometer sprøjtefilterenheder for at fjerne enhver mikrofældning. Ligevægt kolonnen til størrelsesudelukkelseskromatografi med et kolonnevolumen af løbende buffer indeholdende en millimolær dithiothreitol. Læg prøven på kolonnen, og kør kromatografienheden, indtil alle proteinerne er elueret som beskrevet tidligere.Forbered 50 mikroliterprøver til SDS-PAGE og Western blot analyse beskrevet tidligere. Kolonnen vaskes kontinuerligt med et kolonnevolumen af dobbeltdestilleret vand og et kolonnevolumen på 20% ethanol i dobbelt destilleret vand. Efter at have udført Western blot-analyse, skal du samle alle FAHD1, der indeholder fraktioner.Reducer volumenet af proteinopløsningen ned til to milliliter ved hjælp af ultracentrifugeringsfilterenheder. Western blot screening viser tilstedeværelsen af svin FAHD1 i supernatanten med et bånd på 25 kilodaltoner, mens den mærkede positive kontrol kører på 34 kilodaltons. Svinet FAHD1 fra lysat blev renset ved anionisk udvekslingskromatografi, og bindingsproteinerne blev fjernet ved eluering.Fraktioner indeholdende svin FAHD1 blev identificeret ved Western blot-analyse, samlet og koncentreret. Proteinprøver blev renset af SEC og identificeret ved Western blot-analyse. Udbyttet af svine FAHD1-protein var ca. et milligram med et renhedsniveau på 80%.Western blot-analyse påviste musens FAHD1-protein i gennemstrømningen sammen med andre proteiner. Gennemstrømningen blev anvendt til størrelsesudelukkelseskromatografi. Fraktioner indeholdende FAHD1 blev samlet, koncentreret og anvendt på SDS-PAGE-analyse.Udbyttet af protein var imidlertid ikke særlig højt. Den specifikke enzymatiske aktivitet af svinet FAHD1 stiger med renhedsniveauet ved forøgelse af den relative mængde FAHD1 pr. Total protein. Højere koncentrationer af ammoniumsulfat forårsager smileeffekten, som kan løses ved lavere spænding.Yderligere protein blev fundet i lysatet og supernatanten ved 15% koncentration. Ved højere koncentrationer kan prøverne imidlertid udfældes og kan ikke påvises. Protokollen, der præsenteres her, kræver, at proteinet er opløseligt.Optimale betingelser for nedbør og pH- eller størrelsesjustering for kromatografi skal testes og defineres. Undersøgelsen af enzymatisk funktion, undersøgelsen af proteinstruktur og udviklingen af antistof understøttes i høj grad, når protein ekstraheres fra væv snarere end ekstraheres fra bakterier.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Instrueret Protein Emballage inden ydermembranvesikler fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion og oprensning

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rensning af hepatocytter og sinusformet endotelceller fra mus lever Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein udvinding, enzymatisk aktivitet og genekspression af koffein syntase fra plante celle suspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein oprensning og kinetisk analyse via ilt elektrode til at studere DesB Dioxygenase aktivitet og hæmning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Expression, Fast Protein Rensning Protokoller og krystallisering af wild type og mutant former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosidekstraktion, rensning og profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Ekstraktion og visualisering af proteinaggregater efter behandling af Escherichia coli med en proteotoxisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...