Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
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Les auteurs sont très reconnaissants de l’assistance technique d’Ayse Öztürk et Eva Albertini. Les souris utilisées pour la génération de tissu hépatique ont été maintenues sous la supervision de Univ.-Doz. Dr Pidder Jansen-Dürr (Institut de recherche biomédicale sur le vieillissement de l’Université d’Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Autriche).

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles. Le rein de porc a été obtenu frais du supermarché local. Des tissus hépatiques ont été prélevés sur des souris de type sauvage C57BL6 conservées à l’Institut de recherche biomédicale sur le vieillissement de l’Université d’Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Autriche, sous la supervision de l’Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, couvert par l’autorisation éthique en tant que chef de projet délivrée en ...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype.">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization,+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins.">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification.">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).</li><li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins:+Between+meaning+and+different+methods).">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li><li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes.">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(SDS-PAGE).">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li><li>. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011)</li><li>S&#248;rensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

Étapes critiques du protocole Il est essentiel de suivre les directives communes pour la manipulation des protéines, comme le travail sur la glace et à des conditions de pH et de sel modérées. L’utilisation d’inhibiteurs de la protéase est bénéfique pour la méthode, tandis que l’utilisation d’inhibiteurs du protéasome est fortement recommandée. La congélation et la décongélation de l’échantillon peuvent toujours entraîner une précipitation protéique (au moins partielle), de...

La protéine 1 eucaryote contenant le domaine FAH (FAHD1) agit sous forme d’oxaloacétate bifonctionnel (OAA), decarboxylase (ODx)1 et d’hydrolase acylpyruvate (ApH)2. Il est localisé dans les mitochondries2 et appartient à la vaste superfamille faH des enzymes 1,2,3,4,5,6. Bien que son activité ApH ne soit que d’une pertinence mineure, l’activité ODx de FAHD1 est impliquée dans la régulation du flux de cycle TCA 1,7,8,9. L’OAA est non seulement nécessaire pour la réaction centrale de la citrate synthase dans le cycle de l’acide tricarboxylique, mais agit également comme un inhibiteur compétitif de la succinate déshydrogénase dans le cadre du système de transport d’électrons et comme métabolite cataplérotique. La régulation négative de l’expression du gène FAHD1 dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) a entraîné une réduction significative du taux de prolifération cellulaire10 et une inhibition significative du potentiel de la membrane mitochondriale, associée à un passage concomitant à la glycolyse. Le modèle de travail fait référence à la sénescence associée au dysfonctionnement mitochondrial (MiDAS)phénotype 8 de type MiDAS,11, où les niveaux d’OAA mitochondrial sont étroitement régulés par l’activité FAHD1 1,8,9.
La protéine recombinante est plus facile à obtenir par l’expression et la purification à partir de bactéries12 plutôt que de tissus. Cependant, une protéine exprimée dans les bactéries peut être biaisée par l’absence possible de modifications post-traductionnelles, ou peut simplement être problématique (c.-à-d. en raison de la perte de plasmides, des réponses au stress bactérien, des liaisons disulfures déformées / non formées, de l’absence ou d’une mauvaise sécrétion, de l’agrégation des protéines, du clivage protéolytique, etc.). Pour certaines applications, la protéine doit être obtenue à partir de lysat cellulaire ou de tissu, afin d’inclure de telles modifications et/ou d’exclure d’éventuels artefacts. Les protéines purifiées des tissus favorisent le développement d’anticorps de haute qualité et/ou d’inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques pour certaines enzymes, comme pour FAHD113.
Ce manuscrit présente une série de méthodes pour l’extraction et la purification de FAHD1 à partir de reins de porcs et de foies de souris. Les méthodes décrites nécessitent une chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC), mais utilisent autrement un équipement de laboratoire commun. D’autres méthodes peuvent être trouvées ailleurs 14,15,16,17. Après l’extraction des protéines totales, le protocole proposé comprend une phase d’essai, au cours de laquelle les sous-protocoles de précipitation du sulfate d’ammonium et de chromatographie par échange ionique sont discutés (figure 1). Après avoir défini ces sous-protocoles, la protéine d’intérêt est extraite via une stratégie séquentielle utilisant l’échange ionique et la chromatographie d’exclusion de taille avec FPLC. Sur la base de ces lignes directrices, le protocole final peut être adapté individuellement à d’autres protéines d’intérêt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> Figure 1 : La stratégie globale de ce protocole. De haut en bas : Les protéines sont extraites des tissus. L’homogénat tissulaire est préparé, centrifugé et filtré. Pour chaque paire d’échantillons surnageants et d’échantillons dérivés de granulés, des tests de précipitation de sulfate d’ammonium et de chromatographie par échange ionique (FPLC) doivent être effectués pour sonder les conditions optimales. Après avoir établi ces sous-protocoles, la protéine peut être extraite par une procédure séquentielle de précipitation du sulfate d’ammonium, de chromatographie par échange ionique et de chromatographie d’exclusion de taille répétitive (FPLC) à des concentrations variables de pH et de sel. Toutes les étapes doivent être contrôlées par transfert western. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

La protéine 1 contenant le domaine de l’hydrolase fumarylacétoacétate (FAHD1) est le premier membre identifié de la superfamille FAH chez les eucaryotes, agissant comme oxaloacétate décarboxylase dans les mitochondries. Cet article présente une série de méthodes pour l’extraction et la purification de FAHD1 à partir de reins de porcs et de foies de souris. Les méthodes couvertes sont la chromatographie par échange ionique avec chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC), la filtration sur gel préparatif et analytique avec FPLC et les approches protéomiques. Après l’extraction des protéines totales, la précipitation du sulfate d’ammonium et la chromatographie par échange ionique ont été explorées, et FAHD1 a été extrait via une stratégie séquentielle utilisant la chromatographie par échange ionique et par exclusion de taille. Cette approche représentative peut être adaptée à d’autres protéines d’intérêt (exprimées à des niveaux significatifs) et modifiée pour d’autres tissus. Les protéines purifiées des tissus peuvent favoriser le développement d’anticorps de haute qualité et/ou d’inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques.

La protéine FAHD1 a été extraite du rein du porc et du foie de souris à l’aide du protocole présenté. Pour les tissus de souris, plusieurs organes sont nécessaires pour obtenir plusieurs μg après l’étape finale de purification. Pour cette raison, cet article se concentre sur l’extraction de FAHD1 à partir de reins de porcs, ce qui est une expérience beaucoup plus exemplaire. L’extraction de FAHD1 du foie de souris est effectuée pour présenter les difficultés et les pièges possibles de ce protocole...

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Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Ce protocole décrit comment extraire la protéine 1 contenant le domaine de l’hydrolase fumarylacétoacétate (FAHD1) du rein et du foie de souris. Les méthodes énumérées peuvent être adaptées à d’autres protéines d’intérêt et modifiées pour d’autres tissus.

Extraction et purification de la protéine FAHD1 du rein de porc et du foie de souris

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

La purification des protéines recombinantes des bactéries est une méthode bien établie. Cependant, plusieurs problèmes peuvent survenir lors de l’utilisation de ces techniques. Avoir des méthodes pour extraire les protéines des tissus est certainement attrayant.Le principal avantage de cette méthode est que l’on peut extraire la protéine sous sa forme physiologique, y compris tous les effets mutuels qui peuvent avoir un impact sur son repliement et son activité catalytique. Cette approche peut être adaptée à d’autres protéines d’intérêt et modifiée pour d’autres tissus. Les protéines purifiées des tissus peuvent soutenir le développement d’anticorps et d’inhibiteurs pharmacologiques de haute qualité.Pour commencer, préparez un tampon de lyse des protéines en mélangeant 250 millilitres de PBS avec du fluorure de sodium de 50 millimolaires, un millimolaire de fluorure de phénylméthylsulfonyle, deux microgrammes par millilitre d’aprotinine et un orthovanadate activé millimolaire. Filtrer la solution à l’aide d’une unité de filtration de seringue de 0,22 micromètre. Préparez des tubes avec deux millilitres de tampon de lyse par gramme de tissu et placez-les sur de la glace.Pour préparer l’échantillon de tissu, disséquez le tissu d’environ 100 milligrammes chacun sur une plaque de verre pré-nettoyée placée sur de la glace dans une boîte en mousse de polystyrène. Transférer les morceaux de tissu dans les tubes préparés pour une lyse ultérieure. Pour préparer une solution saturée de sulfate d’ammonium, chauffer 500 millilitres d’eau double distillée à 70 degrés Celsius.En remuant, ajouter progressivement la poudre de sulfate d’ammonium jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sulfate d’ammonium dissous. Refroidir cette solution saturée à température ambiante et la conserver à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour homogénéiser les tissus rénaux porcins, soniquer la suspension de préférence par une sonde à ultrasons tout en gardant l’échantillon sur de la glace.Dans le cas des tissus hépatiques de souris, utilisez un homogénéisateur électrique et lavez-le régulièrement dans du PBS pour éviter le colmatage tout en gardant les échantillons sur la glace. Prélevez 20 microlitres des échantillons et vérifiez au microscope si les cellules du tissu homogénéisé sont correctement détruites. Sinon, répétez l’homogénéisation.Centrifugez les tubes à 10 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillez le surnageant dans un tube frais et placez-le sur de la glace. Ensuite, filtrez le surnageant à l’aide d’unités de filtre de seringue de 0,45 micromètre et 0,22 micromètre.Aliquotez le surnageant en lots de 10 millilitres et congelez-les à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à court terme ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage plus long. Préparez un échantillon de 50 microlitres pour l’analyse SDS-PAGE ou Western blot en ajoutant 10 microlitres de cinq fois le tampon d’échantillon SDS à 40 microlitres du surnageant, puis en faisant bouillir à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Préparez un gel SDS-PAGE de polyacrylamide discontinu à 12,5% conformément aux instructions du fabricant.Pour effectuer l’analyse SDS-PAGE, chargez ensuite les puits du gel avec une échelle de marqueurs protéiques, cinq nanogrammes de protéine recombinante FAHD1 humaine comme témoin positif, 20 microlitres de l’échantillon à analyser et les puits restants avec 20 microlitres de tampon d’échantillon SDS-PAGE préparé. Exécutez les gels SDS-PAGE à 125 volts à l’aide de la mémoire tampon de fonctionnement SDS. Une fois SDS-PAGE terminé, effectuez une analyse par transfert Western, sondez les membranes à l’aide de l’anticorps disponible soulevé contre FAHD1.Après avoir préparé des aliquotes surnageantes comme décrit précédemment, soit traiter après décongélation, soit traiter directement après l’extraction des protéines sans congeler l’échantillon. Filtrer l’échantillon à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 micromètre pour exclure les précipités possibles après décongélation. Préparez six tubes de 1,5 millilitre sur de la glace, puis transférez 250 microlitres d’échantillon dans chaque tube.Préparer une série de dilution de sulfate d’ammonium dans les tubes préparés et porter le volume final à 1 000 microlitres avec un tampon de lyse des protéines. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un rotateur tubulaire. À l’aide d’une centrifugeuse de table, centrifugez à 10 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et transférez soigneusement tous les surnageants dans des tubes séparés.Sécher à l’air libre les granulés obtenus et remettre en suspension chacun d’eux dans 1 000 microlitres d’eau double distillée. Pour chaque paire de granulés et de surnageants remis en suspension de l’étape précédente, mélanger 40 microlitres avec 10 microlitres de cinq fois le tampon de l’échantillon SDS et faire bouillir à 95 degrés Celsius avec des couvercles ouverts jusqu’à ce que la majeure partie du liquide se soit vaporisée. Ensuite, remettez en suspension la pastille dans un mélange de sulfoxyde de diméthyle à 50% dans de l’eau distillée double.Effectuer SDS-PAGE en chargeant les échantillons dérivés des granulés remis en suspension et du surnageant par paires, suivi d’une analyse par transfert Western. Cependant, faites fonctionner les gels à 80 volts pendant trois heures. Configurez le système FPLC avec la colonne d’échange anionique ou cationique.Lavez la colonne avec cinq volumes de colonne d’éthanol à 20 % dans de l’eau distillée double, suivis de cinq volumes de colonne d’eau distillée double. Appliquez l’échantillon sur la colonne soit par injection, soit à l’aide d’une pompe à échantillon et prélevez le débit. Lavez la colonne avec un volume de colonne du tampon à faible teneur en sel.Configurez une élution de gradient linéaire allant d’un tampon à faible teneur en sel à 100 % d’un tampon à sel élevé dans trois volumes de colonnes. Collectez en continu une fraction millilitre. Une fois le gradient terminé, continuez à fonctionner avec un tampon de sel élevé jusqu’à ce qu’aucun autre pic associé aux protéines ne soit détecté dans le chromatogramme sur la plage d’un volume de colonne.Appliquer un millilitre de FDS à 25 % dissous dans de l’hydroxyde de sodium à 0,5 molaire et de l’eau distillée double pour nettoyer la colonne. Laver consécutivement la colonne avec trois volumes de colonne d’eau distillée double et trois volumes de colonne d’éthanol à 20% dans de l’eau double distillée. Collectez les échantillons SDS-PAGE de toutes les fractions de crête et du débit.Congelez les fractions collectées dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Après les avoir sondés par transfert Western, décongelez et mettez en commun les fractions contenant les protéines d’intérêt et jetez les autres. Pour effectuer l’étape de purification, réduisez le volume de la solution protéique à deux millilitres à l’aide d’unités de filtration ultra centrifugation.Filtrer séquentiellement la solution avec des unités de filtre de seringue de 0,45 micromètre et 0,22 micromètre pour éliminer toute microprécipitation. Équilibrer la colonne de chromatographie d’exclusion de taille avec un volume de colonne de tampon courant contenant un millimolaire de dithiothréitol. Chargez l’échantillon sur la colonne et exécutez l’unité de chromatographie jusqu’à ce que toutes les protéines soient éluées comme décrit précédemment.Préparez 50 échantillons de microlitres pour l’analyse SDS-PAGE et Western blot décrite précédemment. Laver consécutivement la colonne avec un volume de colonne d’eau double distillée et un volume de colonne d’éthanol à 20% dans de l’eau double distillée. Après avoir effectué l’analyse Western blot, regroupez toutes les fractions contenant FAHD1.Réduisez le volume de la solution protéique à deux millilitres à l’aide d’unités de filtration ultra centrifugation. Le dépistage par transfert western montre la présence de FAHD1 porcin dans le surnageant avec une bande de 25 kilodaltons tandis que le témoin positif marqué court à 34 kilodaltons. Le porc FAHD1 du lysat a été purifié par chromatographie par échange anionique et les protéines de liaison ont été éliminées par élution.Les fractions contenant du FAHD1 porcin ont été identifiées par analyse par transfert western, regroupées et concentrées. Les échantillons de protéines ont été purifiés par sec et identifiés par l’analyse par transfert Western. Le rendement de la protéine FAHD1 du porc était d’environ un milligramme avec un niveau de pureté de 80%.L’analyse par transfert Western a détecté la protéine FAHD1 de la souris dans le flux avec d’autres protéines. Le flow-through a été appliqué pour la chromatographie d’exclusion de taille. Les fractions contenant FAHD1 ont été regroupées, concentrées et appliquées à l’analyse SDS-PAGE.Cependant, le rendement en protéines n’était pas très élevé. L’activité enzymatique spécifique du porc FAHD1 augmente avec le niveau de pureté en augmentant la quantité relative de FAHD1 par protéine totale. Des concentrations plus élevées de sulfate d’ammonium provoquent l’effet sourire, qui peut être résolu à une tension plus faible.D’autres protéines ont été trouvées dans le lysat et le surnageant à une concentration de 15%. Cependant, à des concentrations plus élevées, les échantillons peuvent précipiter et ne peuvent pas être détectés. Le protocole présenté ici exige que la protéine soit soluble.Les conditions optimales de précipitation et d’ajustement du pH ou de la taille pour la chromatographie doivent être testées et définies. L’étude de la fonction enzymatique, l’étude de la structure des protéines et le développement d’anticorps sont grandement soutenus lorsque des protéines sont extraites de tissus plutôt que de bactéries.

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