Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
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Die Autoren sind sehr dankbar für die technische Unterstützung durch Ayse Öztürk und Eva Albertini. Mäuse, die zur Erzeugung von Lebergewebe verwendet wurden, wurden unter der Aufsicht von Univ.-Doz gepflegt. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institut für Biomedizinische Alternsforschung an der Universität Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Österreich).

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Die Schweineniere wurde frisch aus dem örtlichen Supermarkt bezogen. Lebergewebe wurde von C57BL6-Wildtyp-Mäusen entnommen, die am Institut für Biomedizinische Alternsforschung der Universität Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Österreich, unter der Aufsicht von Univ.-Doz aufbewahrt wurden. Dr. Pidder Jansen-Dürr, 2013 als Projektleiter ethisch zugelassen (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Die Wartung und Verwendung der ...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

Kritische Schritte im Protokoll Die Einhaltung gemeinsamer Richtlinien für den Umgang mit Proteinen ist unerlässlich, wie z.B. die Arbeit auf Eis und bei moderaten pH- und Salzbedingungen. Die Verwendung von Proteasehemmern ist für die Methode von Vorteil, während die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren dringend empfohlen wird. Das Einfrieren und Auftauen der Probe kann immer zu einer Proteinausfällung (zumindest teilweise) führen, daher sollte jedes aufgetaute Aliquot des anfänglichen Protein...

Das eukaryotische FAH-domänenhaltige Protein 1 (FAHD1) wirkt als bifunktionelle Oxalacetat (OAA)-Decarboxylase (ODx)1 und Acylpyruvathydrolase (ApH)2. Es ist in Mitochondrien 2 lokalisiert und gehört zur breiten FAH-Superfamilie der Enzyme 1,2,3,4,5,6. Während seine ApH-Aktivität nur von geringer Relevanz ist, ist die ODx-Aktivität von FAHD1 an der Regulation des TCA-Zyklusflusses 1,7,8,9 beteiligt. OAA wird nicht nur für die zentrale Citratsynthase-Reaktion im Tricarbonsäurezyklus benötigt, sondern wirkt auch als kompetitiver Inhibitor der Succinat-Dehydrogenase als Teil des Elektronentransportsystems und als kataplerotischer Metabolit. Die Herunterregulierung der FAHD1-Genexpression in menschlichen Nabelvenendothelzellen (HUVEC) führte zu einer signifikanten Verringerung der Zellproliferation10 und einer signifikanten Hemmung des mitochondrialen Membranpotentials, verbunden mit einem gleichzeitigen Wechsel zur Glykolyse. Das Arbeitsmodell bezieht sich auf den mitochondrialen Dysfunktions-assoziierten Seneszenz (MiDAS)11-ähnlichen Phänotyp 8, bei dem die mitochondrialen OAA-Spiegel durch die FAHD1-Aktivität 1,8,9 streng reguliert werden.
Rekombinantes Protein ist leichter durch Expression und Reinigung von Bakterien12 als von Gewebe zu erhalten. Ein in Bakterien exprimiertes Protein kann jedoch durch mögliches Fehlen posttranslationaler Modifikationen verzerrt sein oder einfach problematisch sein (d. H. Aufgrund von Plasmidverlust, bakteriellen Stressreaktionen, verzerrten / ungeformten Disulfidbindungen, keiner oder schlechter Sekretion, Proteinaggregation, proteolytischer Spaltung usw.). Für bestimmte Anwendungen muss Protein aus Zelllysat oder Gewebe gewonnen werden, um solche Modifikationen einzuschließen und/oder mögliche Artefakte auszuschließen. Gereinigtes Protein aus Gewebe unterstützt die Entwicklung hochwertiger Antikörper und/oder potenter und spezifischer pharmakologischer Inhibitoren für ausgewählte Enzyme, wie z.B. für FAHD113.
Dieses Manuskript stellt eine Reihe von Methoden zur Extraktion und Reinigung von FAHD1 aus Schweineniere und Mausleber vor. Die beschriebenen Methoden erfordern eine schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC), verwenden aber ansonsten gängige Laborgeräte. Alternative Methoden können an anderer Stellegefunden werden 14,15,16,17. Nach der Gesamtproteinextraktion umfasst das vorgeschlagene Protokoll eine Testphase, in der Teilprotokolle für die Ammoniumsulfatfällung und die Chromatographie des Ionenaustauschs diskutiert werden (Abbildung 1). Nach der Definition dieser Subprotokolle wird das interessierende Protein über eine sequentielle Strategie unter Verwendung von Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie mit FPLC extrahiert. Basierend auf diesen Richtlinien kann das endgültige Protokoll individuell für andere Proteine von Interesse angepasst werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> Abbildung 1: Die Gesamtstrategie dieses Protokolls. Von oben nach unten: Protein wird aus Geweben extrahiert. Gewebehomogenat wird hergestellt, zentrifugiert und filtriert. Für jedes Paar von überstehenden und aus Pellets gewonnenen Proben müssen Tests zur Ammoniumsulfatfällung und zur Ionenaustauschchromatographie (FPLC) durchgeführt werden, um optimale Bedingungen zu untersuchen. Nach der Festlegung dieser Subprotokolle kann das Protein durch ein sequentielles Verfahren der Ammoniumsulfatfällung, der Ionenaustauschchromatographie und der repetitiven Größenausschlusschromatographie (FPLC) bei unterschiedlichen pH- und Salzkonzentrationen extrahiert werden. Alle Schritte müssen von Western Blot kontrolliert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

Fumarylacetoacetathydrolase-Domänen-haltiges Protein 1 (FAHD1) ist das erste identifizierte Mitglied der FAH-Superfamilie in Eukaryoten und wirkt als Oxalacetat-Decarboxylase in Mitochondrien. Dieser Artikel stellt eine Reihe von Methoden zur Extraktion und Reinigung von FAHD1 aus Schweineniere und Mausleber vor. Abgedeckte Methoden sind die Ionenaustauschchromatographie mit schneller Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC), die präparative und analytische Gelfiltration mit FPLC und proteomische Ansätze. Nach der Gesamtproteinextraktion wurden die Ammoniumsulfatfällung und die Chromatographie des Ionenaustauschs untersucht, und FAHD1 wurde über eine sequentielle Strategie unter Verwendung der Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie extrahiert. Dieser repräsentative Ansatz kann an andere Proteine von Interesse angepasst werden (in signifikanten Mengen exprimiert) und für andere Gewebe modifiziert werden. Gereinigtes Protein aus Gewebe kann die Entwicklung hochwertiger Antikörper und/oder potenter und spezifischer pharmakologischer Inhibitoren unterstützen.

Das FAHD1-Protein wurde mit dem vorgestellten Protokoll aus Schweineniere und Mausleber extrahiert. Für Mausgewebe sind mehrere Organe erforderlich, um nach dem letzten Reinigungsschritt mehrere μg zu erhalten. Aus diesem Grund konzentriert sich dieser Artikel auf die Extraktion von FAHD1 aus Schweinenieren, was ein viel exemplarischeres Experiment ist. Die Extraktion von FAHD1 aus der Mausleber wird durchgeführt, um die Schwierigkeiten und möglichen Fallstricke dieses Protokolls darzustellen. Es wird allgemein empfo...

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Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Dieses Protokoll beschreibt, wie das domänenhaltige Fumarylacetoacetat-Hydrolase-haltige Protein 1 (FAHD1) aus Schweineniere und Mausleber extrahiert werden kann. Die aufgeführten Methoden können an andere Proteine von Interesse angepasst und für andere Gewebe modifiziert werden.

Extraktion und Reinigung von FAHD1-Protein aus Schweineniere und Mausleber

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Die Reinigung von rekombinantem Protein aus Bakterien ist eine etablierte Methode. Bei der Verwendung dieser Techniken können jedoch mehrere Probleme auftreten. Methoden zu haben, um Protein aus Gewebe zu extrahieren, ist sicherlich ansprechend.Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass das Protein in seiner physiologischen Form extrahiert werden kann, einschließlich aller gegenseitigen Wirkungen, die sich auf seine Faltung und katalytische Aktivität auswirken können. Dieser Ansatz kann an andere Proteine von Interesse angepasst und für anderes Gewebe modifiziert werden. Gereinigtes Protein aus Gewebe kann die Entwicklung hochwertiger Antikörper und pharmakologischer Inhibitoren unterstützen.Bereiten Sie zunächst den Proteinlysepuffer vor, indem Sie 250 Milliliter PBS mit 50 Millimolar Natriumfluorid, einem millimolaren Phenylmethylsulfonylfluorid, zwei Mikrogramm pro Milliliter Aprotinin und einem millimolar aktivierten Orthovanadat mischen. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheit. Bereiten Sie Röhrchen mit zwei Millilitern Lysepuffer pro Gramm Gewebe vor und legen Sie sie auf Eis.Um die Gewebeprobe vorzubereiten, sezieren Sie das Gewebe von jeweils etwa 100 Milligramm auf einer vorgereinigten Glasplatte, die auf Eis in einer Styroporschaumbox platziert ist. Die Gewebestücke zur anschließenden Lyse in die vorbereiteten Röhrchen überführen. Um eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung herzustellen, erhitzen Sie 500 Milliliter doppelt destilliertes Wasser auf 70 Grad Celsius.Während des Rührens fügen Sie allmählich Ammoniumsulfatpulver hinzu, bis kein Ammoniumsulfat mehr gelöst ist. Kühlen Sie diese gesättigte Lösung auf Raumtemperatur ab und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Um das Schweinenierengewebe zu homogenisieren, beschallen Sie die Suspension vorzugsweise mit einer Ultraschallsonde, während Sie die Probe auf Eis halten.Verwenden Sie im Falle von Mauslebergewebe einen elektrischen Homogenisator und waschen Sie ihn regelmäßig in PBS, um Verstopfungen zu vermeiden, während die Proben auf Eis gehalten werden. Nehmen Sie 20 Mikroliter aus den Proben und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen des homogenisierten Gewebes richtig zerstört werden. Andernfalls wiederholen Sie die Homogenisierung.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in einer frischen Tube und legen Sie ihn auf Eis. Filtern Sie anschließend den Überstand mit 0,45 Mikrometer und 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheiten.Aliquot den Überstand in 10-Milliliter-Chargen und bei minus 20 Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung oder bei minus 80 Grad Celsius für längere Lagerung einfrieren. Bereiten Sie eine 50-Mikroliter-Probe für die SDS-PAGE- oder Western-Blot-Analyse vor, indem Sie 10 Mikroliter des Fünffachen des SDS-Probenpuffers zu 40 Mikrolitern des Überstands hinzufügen und dann 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius sieden. Bereiten Sie ein diskontinuierliches 12,5% Polyacrylamid SDS-PAGE Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.Um die SDS-PAGE-Analyse durchzuführen, laden Sie die Vertiefungen des Gels anschließend mit einer Proteinmarkerleiter, fünf Nanogramm humanem FAHD1-rekombinantem Protein als Positivkontrolle, 20 Mikrolitern der zu analysierenden Probe und den verbleibenden Vertiefungen mit 20 Mikrolitern vorbereitetem SDS-PAGE-Probenpuffer. Führen Sie die SDS-PAGE-Gele mit 125 Volt unter Verwendung des SDS-Laufpuffers aus. Nachdem SDS-PAGE abgeschlossen ist, führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch und untersuchen Sie die Membranen mit dem verfügbaren Antikörper, der gegen FAHD1 erhoben wird.Nach der Herstellung von überstehenden aliquoten, wie zuvor beschrieben, entweder nach dem Auftauen oder direkt nach der Proteinextraktion ohne Einfrieren der Probe verarbeiten. Filtern Sie die Probe mit einer 0,22 Mikrometer großen Filtereinheit, um mögliche Ausfällungen nach dem Auftauen auszuschließen. Bereiten Sie sechs 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis vor und übertragen Sie dann 250 Mikroliter Probe in jedes Röhrchen.Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von Ammoniumsulfat in den vorbereiteten Röhrchen vor und machen Sie das endgültige Volumen auf 1.000 Mikroliter mit Proteinlysepuffer aus. Inkubieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Röhrenrotator. Mit einer Tischzentrifuge bei 10.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und alle Überstände vorsichtig in separate Röhrchen überführen.Die resultierenden Pellets an der Luft trocknen und jedes von ihnen in 1.000 Mikroliter doppelt destilliertem Wasser resuspendieren. Mischen Sie für jedes Paar resuspendiertes Pellet und Überstand aus dem vorherigen Schritt 40 Mikroliter mit 10 Mikrolitern des Fünffachen des SDS-Probenpuffers und kochen Sie bei 95 Grad Celsius mit offenen Deckeln, bis der größte Teil der Flüssigkeit verdampft ist. Dann suspendiert das Pellet in einer Mischung aus 50% Dimethylsulfoxid in doppelt destilliertem Wasser.Führen Sie SDS-PAGE durch, indem Sie die Proben aus den resuspendierten Pellets und dem Überstand paarweise laden, gefolgt von einer Western Blot-Analyse. Lassen Sie die Gele jedoch drei Stunden lang mit 80 Volt laufen. Richten Sie das FPLC-System mit der anionischen oder kationischen Austauschsäule ein.Waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina von 20% Ethanol in doppelt destilliertem Wasser, gefolgt von fünf Säulenvolumina doppelt destilliertem Wasser. Tragen Sie die Probe entweder durch Injektion oder mit einer Probenpumpe auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule mit einem Säulenvolumen des niedrigen Salzpuffers.Richten Sie eine lineare Gradientenelution von 100 % niedrigem Salzpuffer zu 100 % hohem Salzpuffer innerhalb von drei Säulenvolumina ein. Sammeln Sie kontinuierlich einen Milliliter Fraktionen. Nachdem der Gradient beendet ist, laufen Sie mit einem hohen Salzpuffer weiter, bis keine proteinassoziierten Peaks mehr im Chromatogramm über den Bereich eines Säulenvolumens nachgewiesen werden.Tragen Sie einen Milliliter 25% SDS auf, gelöst in 0,5 molaren Natriumhydroxid und doppelt destilliertem Wasser, um die Säule zu reinigen. Waschen Sie die Säule nacheinander mit drei Säulenvolumina aus doppelt destilliertem Wasser und drei Säulenvolumina aus 20% Ethanol in doppelt destilliertem Wasser. Sammeln Sie die SDS-PAGE-Proben aller Spitzenfraktionen und des Durchflusses.Die gesammelten Fraktionen in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Nachdem Sie sie über Western Blot untersucht haben, tauen und sammeln Sie die Fraktionen, die die Proteine von Interesse enthalten, und verwerfen Sie die anderen. Um den Reinigungsschritt durchzuführen, reduzieren Sie das Volumen der Proteinlösung mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten auf zwei Milliliter.Filtern Sie die Lösung nacheinander mit 0,45 Mikrometer und 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheiten, um Mikrofällungen zu entfernen. Gleichen Sie die Größenausschlusschromatographiespalte mit einem Spaltenvolumen des laufenden Puffers aus, das ein millimolares Dithiothreitol enthält. Laden Sie die Probe auf die Säule und führen Sie die Chromatographieeinheit aus, bis alle Proteine wie zuvor beschrieben eluiert sind.Bereiten Sie 50-Mikroliter-Proben für die zuvor beschriebene SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse vor. Waschen Sie die Kolonne nacheinander mit einem Säulenvolumen doppelt destilliertem Wasser und einem Säulenvolumen von 20% Ethanol in doppelt destilliertem Wasser. Nach der Western Blot-Analyse werden alle FAHD1-haltigen Fraktionen gepoolt.Reduzieren Sie das Volumen der Proteinlösung mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten auf zwei Milliliter. Western Blot Screening zeigt das Vorhandensein von Schweinen FAHD1 im Überstand mit einem Band bei 25 Kilodalton, während die markierte Positivkontrolle bei 34 Kilodalton läuft. Das Schwein FAHD1 aus Lysat wurde durch anionische Austauschchromatographie gereinigt und die Bindungsproteine durch Elution entfernt.Fraktionen, die Schweine FAHD1 enthielten, wurden durch Western Blot-Analyse identifiziert, gepoolt und konzentriert. Proteinproben wurden von der SEC gereinigt und durch westliche Blot-Analyse identifiziert. Die Ausbeute an Schweine-FAHD1-Protein betrug etwa ein Milligramm mit einem Reinheitsgrad von 80%.Die Western-Blot-Analyse wies das FAHD1-Protein der Maus im Durchfluss zusammen mit anderen Proteinen nach. Der Durchfluss wurde für die Größenausschlusschromatographie angewendet. Fraktionen, die FAHD1 enthielten, wurden gepoolt, konzentriert und auf die SDS-PAGE-Analyse angewendet.Die Ausbeute an Protein war jedoch nicht sehr hoch. Die spezifische enzymatische Aktivität des Schweins FAHD1 steigt mit dem Reinheitsgrad, wenn die relative Menge an FAHD1 pro Gesamtprotein erhöht wird. Höhere Konzentrationen von Ammoniumsulfat verursachen den Smile-Effekt, der bei niedrigerer Spannung aufgelöst werden kann.Weiteres Protein wurde im Lysat und Überstand in einer Konzentration von 15% gefunden. Bei höheren Konzentrationen können Proben jedoch ausfallen und können nicht nachgewiesen werden. Das hier vorgestellte Protokoll verlangt, dass das Protein lösbar ist.Optimale Bedingungen für Niederschlag und pH- oder Größenanpassung für die Chromatographie müssen getestet und definiert werden. Die Untersuchung der enzymatischen Funktion, die Untersuchung der Proteinstruktur und die Entwicklung von Antikörpern werden stark unterstützt, wenn Protein aus Gewebe extrahiert und nicht aus Bakterien extrahiert wird.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Forschung

Biochemie

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein-Extraktion, enzymatische Aktivität und Genexpression von Koffein-Synthase aus Anlage Zellsuspensionen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

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Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

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PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

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Extraktion und Visualisierung von Proteinaggregaten nach Behandlung von Escherichia coli mit einem proteotoxischen Stressor

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The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

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