Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

המחברים מודים מאוד על הסיוע הטכני של אייסה אוזטורק ואווה אלברטיני. עכברים ששימשו ליצירת רקמת כבד נשמרו תחת פיקוחה של אוניברסיטת דוז. ד"ר פידר יאנסן-דור (המכון לחקר ההזדקנות הביו-רפואית באוניברסיטת אינסברוק, Rennweg 10, 6020 אינסברוק, אוסטריה).

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות. כליה חזירית הושגה טרייה מהסופרמרקט המקומי. רקמות כבד נקטפו מעכברים מסוג בר C57BL6 שנשמרו במכון לחקר ההזדקנות הביו-רפואית באוניברסיטת אינסברוק, Rennweg 10, 6020 אינסברוק, אוסטריה תחת פיקוחה של אוניברסיטת דוז. ד"ר פידר יאנסן-דור, מכוסה על ידי אישור אתי כמוביל ...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).</li><li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor.">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis.">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype.">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization,+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins.">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification.">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).</li><li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins:+Between+meaning+and+different+methods).">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li><li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes.">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(SDS-PAGE).">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li><li>. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011)</li><li>S&#248;rensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

שלבים קריטיים בפרוטוקול הקפדה על הנחיות נפוצות לטיפול בחלבונים היא חיונית, כגון עבודה על קרח ובתנאים מתונים של pH ומלח. השימוש במעכבי פרוטאזות מועיל לשיטה, בעוד שהשימוש במעכבי פרוטאזום מומלץ מאוד. הקפאה והפשרה של הדגימה עלולות תמיד לגרום למשקעי חלבון (לפחות באופן חלקי), ולכן כל א...

החלבון האאוקריוטי המכיל את תחום FAH 1 (FAHD1) פועל כאוקסלואצטט דו-תפקודי (OAA) דקרבוקסילאז (ODx)1 ואצילפירובט הידרולאז (ApH)2. הוא מקומי במיטוכונדריה2 ושייך למשפחת העל הרחבה FAH של אנזימים 1,2,3,4,5,6. בעוד שפעילות ה-ApH שלה רלוונטית רק באופן מינורי, פעילות ה-ODx של FAHD1 מעורבת בוויסות של שטף מחזור TCA 1,7,8,9. OAA נדרש לא רק לתגובת הסינתאז המרכזית של ציטראט ציטראט במחזור החומצה הטריקרבוקסילית, אלא גם פועל כמעכב תחרותי של סוקסינט דהידרוגנאז כחלק ממערכת הובלת האלקטרונים וכמטבוליט קטפלרוטי. הפחתה של ביטוי הגנים FAHD1 בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVEC) הביאה לירידה משמעותית בקצב התפשטות התא10, ולעיכוב משמעותי של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדרית, הקשורה למעבר מקביל לגליקוליזה. מודל העבודה מתייחס לתפקוד לקוי של מיטוכונדריאלי הקשורלפנוטיפ דמוי 11 (MiDAS)11, שבו רמות OAA מיטוכונדריאליות מווסתות באופן הדוק על ידי פעילות FAHD1 1,8,9.
קל יותר להשיג חלבון רקומביננטי באמצעות ביטוי וטיהור מחיידקים12 ולא מרקמה. עם זאת, חלבון המתבטא בחיידקים עשוי להיות מוטה על ידי היעדר אפשרי של שינויים לאחר התרגום, או פשוט עשוי להיות בעייתי (כלומר, עקב אובדן פלסמיד, תגובות עקה חיידקיות, קשרים דיסולפידיים מעוותים/לא מעוצבים, הפרשה ללא או הפרשה לקויה, צבירת חלבונים, ביקוע פרוטאוליטי וכו '). עבור יישומים מסוימים, יש לקבל חלבון מליסאט תאי או מרקמה, על מנת לכלול שינויים כאלה ו/או להחריג ממצאים אפשריים. חלבון מטוהר מרקמה תומך בפיתוח נוגדנים באיכות גבוהה, ו/או מעכבים פרמקולוגיים חזקים וספציפיים עבור אנזימים נבחרים, כגון עבור FAHD113.
כתב יד זה מציג סדרה של שיטות למיצוי וטיהור של FAHD1 מכליות חזירים וכבד עכברים. השיטות המתוארות דורשות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון (FPLC) אך משתמשות בציוד מעבדה נפוץ. שיטות חלופיות ניתן למצוא במקומות אחרים 14,15,16,17. לאחר מיצוי חלבונים כולל, הפרוטוקול המוצע כולל שלב בדיקה, שבו נדונים תת-פרוטוקולים עבור משקעי אמוניום גופרתיים וכרומטוגרפיית חילופי יונית (איור 1). לאחר הגדרת תת-פרוטוקולים אלה, החלבון המעניין מופק באמצעות אסטרטגיה רציפה באמצעות חילופי יונית וכרומטוגרפיית אי הכללת גודל עם FPLC. בהתבסס על הנחיות אלה, הפרוטוקול הסופי עשוי להיות מותאם בנפרד לחלבונים אחרים בעלי עניין.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> איור 1: האסטרטגיה הכוללת של פרוטוקול זה. מלמעלה למטה: חלבון מופק מרקמות. רקמות הומוגנטיות מוכנות, צנטריפוגות ותנוססות. עבור כל זוג של דגימות סופרנטנט ודגימות שמקורן בכדור, יש לבצע בדיקות לאיתור משקעי אמוניום סולפט וכרומטוגרפיית חילופי יונית (FPLC) כדי לחקור תנאים אופטימליים. לאחר קביעת תת-פרוטוקולים אלה, ניתן לחלץ את החלבון באמצעות הליך רציף של משקעי אמוניום סולפט, כרומטוגרפיית חילופי יונית וכרומטוגרפיה חוזרת ונשנית של הרחקת גודל (FPLC) בריכוזי pH ומלח משתנים. כל הצעדים צריכים להיות נשלטים על ידי כתם מערבי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

פומארילאצטואצטט הידרולאז המכיל חלבון 1 (FAHD1) הוא החבר המזוהה הראשון במשפחת העל FAH באאוקריוטים, הפועל כאוקסלואצטט דקרבוקסילאז במיטוכונדריה. מאמר זה מציג סדרה של שיטות למיצוי וטיהור של FAHD1 מכליות חזירים וכבד עכברים. השיטות המכוסות הן כרומטוגרפיית חילופי יונית עם כרומטוגרפיה נוזלית של חלבונים מהירים (FPLC), סינון ג'ל הכנה ואנליטי עם FPLC, וגישות פרוטאומיות. לאחר מיצוי החלבון הכולל, נחקרו משקעי אמוניום סולפט וכרומטוגרפיית חילופים יונית, ו-FAHD1 הופק באמצעות אסטרטגיה רציפה באמצעות חילופי יונים וכרומטוגרפיית אי הכללת גודל. גישה מייצגת זו עשויה להיות מותאמת לחלבונים אחרים בעלי עניין (המתבטאים ברמות משמעותיות) ומשתנה עבור רקמות אחרות. חלבון מטוהר מרקמה עשוי לתמוך בפיתוח נוגדנים איכותיים, ו/או מעכבים פרמקולוגיים חזקים וספציפיים.

חלבון FAHD1 הופק מתוך כבד הכליה והעכבר של חזירים באמצעות הפרוטוקול שהוצג. עבור רקמת עכבר, נדרשים מספר איברים כדי להשיג מספר מיקרוגרם לאחר שלב הטיהור הסופי. מסיבה זו, מאמר זה מתמקד במיצוי של FAHD1 מכליות חזירים, שהוא ניסוי הרבה יותר למופת. הפקת FAHD1 מכבד העכבר מבוצעת כדי להציג את הקשיים ואת המלכודו...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחלץ את החלבון 1 המכיל הידרולאז 1 (FAHD1) מכליות החזירים ומכבד העכברים. השיטות המפורטות עשויות להיות מותאמות לחלבונים אחרים בעלי עניין ולשנות אותן עבור רקמות אחרות.

מיצוי וטיהור של חלבון FAHD1 מכבד כליות ועכבר חזירים

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

טיהור של חלבון רקומביננטי מחיידקים היא שיטה מבוססת היטב. עם זאת, מספר בעיות עלולות להתרחש בעת שימוש בטכניקות אלה. לאחר שיטות לחלץ חלבון מן הרקמה הוא בהחלט מושך.היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שניתן לחלץ את החלבון בצורתו הפיזיולוגית, כולל כל ההשפעות ההדדיות שעשויות להשפיע על פעילותו המתקפלת והקטליטית. גישה זו עשויה להיות מותאמת לחלבונים אחרים בעלי עניין ולשנות אותה עבור רקמות אחרות. חלבון מטוהר מרקמה עשוי לתמוך בפיתוח נוגדנים איכותיים ומעכבים פרמקולוגיים.כדי להתחיל, להכין חיץ ליזיס חלבון על ידי ערבוב 250 מיליליטרים של PBS עם 50 מילימולר נתרן פלואוריד, אחד millimolar phenylmethylsulfonyl fluoride, שני מיקרוגרם לכל מיליליטר אפרוטינין, ואחד millimolar מופעל אורתובנדט. סנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. מכינים צינורות עם שני מיליליטרים של חיץ ליזיס לגרם רקמה ומניחים אותם על קרח.כדי להכין את דגימת הרקמה, נתחו את הרקמה של כ-100 מיליגרם כל אחת על צלחת זכוכית מנוקה מראש שהונחה על קרח בקופסת קצף פוליסטירן. להעביר את חתיכות הרקמות לתוך צינורות מוכנים עבור lysis לאחר מכן. כדי להכין תמיסת אמוניום סולפט רוויה, מחממים 500 מיליליטרים של מים מזוקקים כפולים ל -70 מעלות צלזיוס.תוך כדי ערבוב, מוסיפים בהדרגה אבקת אמוניום גופרתי עד שלא ממיסים יותר אמוניום סולפט. מצננים את התמיסה הרוויה הזו לטמפרטורת החדר ומאחסנים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי להפוך את רקמות הכליה של החזירים להומוגניזציה, יש לסלול את ההשעיה עדיף על ידי בדיקה קולית תוך שמירה על הדגימה על הקרח.במקרה של רקמות כבד של עכברים, השתמשו בהומוגנייזר חשמלי ושטפו אותו באופן קבוע ב-PBS כדי למנוע סתימה תוך שמירה על הדגימות על הקרח. קחו 20 מיקרוליטרים מהדגימות ובדקו מתחת למיקרוסקופ אם התאים של הרקמה ההומוגנית מושמדים כראוי. אחרת, חזור על ההומוגניות.צנטריפוגה הצינורות ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את חומר העל בצינור טרי והניחו אותו על קרח. לאחר מכן לסנן את הסופרנטנט באמצעות יחידות מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר.Aliquot את supernatant לתוך 10 אצוות מיליליטר ולהקפיא אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר או במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך יותר. הכינו דגימת מיקרוליטר של 50 עבור ניתוח SDS-PAGE או כתם מערבי על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של פי חמישה ממאגר דגימת ה-SDS ל-40 מיקרוליטרים של הסופרנאטנט ולאחר מכן הרתחה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הכינו ג'ל פוליאקרילאמיד SDS-PAGE לא רציף של 12.5% על פי הוראות היצרן.כדי לבצע ניתוח SDS-PAGE, טען את הבארות של הג'ל לאחר מכן עם סולם סמן חלבון, חמישה ננוגרמים של חלבון רקומביננטי FAHD1 אנושי כבקרה חיובית, 20 מיקרוליטרים של הדגימה שיש לנתח, ואת הבארות הנותרות עם 20 מיקרוליטרים של מאגר דגימות SDS-PAGE מוכן. הפעל את הג'לים של SDS-PAGE ב- 125 וולט באמצעות מאגר הריצה SDS. לאחר השלמת SDS-PAGE, בצע ניתוח כתם מערבי, בדוק את הממברנות באמצעות הנוגדן הזמין שהועלה כנגד FAHD1.לאחר הכנת אליקוטים סופרנאטנטיים כפי שתואר קודם לכן, או לעבד לאחר הפשרה או לעבד ישירות לאחר מיצוי חלבון מבלי להקפיא את הדגימה. סנן את הדגימה באמצעות יחידת מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לא לכלול משקעים אפשריים לאחר ההפשרה. מכינים שישה צינורות 1.5 מיליליטר על קרח, ואז מעבירים 250 מיקרוליטרים של דגימה לכל צינור.הכינו סדרת דילול של אמוניום גופרתי בצינורות המוכנים והרכיבו את הנפח הסופי ל-1, 000 מיקרוליטר עם מאגר ליזה חלבונית. הדגירה של הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה על מסובב צינור. באמצעות צנטריפוגה שולחנית, צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר בזהירות את כל הסופרנאטורים לצינורות נפרדים.אוויר מייבש את הכדורים המתקבלים ומחזיר כל אחד מהם ב-1, 000 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים. עבור כל זוג של כדוריות וסופר-ננטנטים מהשלב הקודם, יש לערבב 40 מיקרוליטרים עם 10 מיקרוליטרים של פי חמישה ממאגר דגימת ה-SDS ולרתוח ב-95 מעלות צלזיוס עם מכסים פתוחים עד שרוב הנוזלים התאדו. לאחר מכן יש להחיות את הכדור בתערובת של 50% דימתיל סולפוקסיד במים מזוקקים כפולים.בצע את SDS-PAGE על ידי טעינת הדגימות הנגזרות מהכדורים המחודשים והסופרנטנטים בזוגות, ולאחר מכן ניתוח כתמים מערביים. עם זאת, הפעל את הג'לים ב 80 וולט במשך שלוש שעות. הגדר את מערכת FPLC עם עמודת החליפין האניונית או הקטיונית.שטפו את העמוד בחמישה נפחי עמודים של 20% אתנול במים מזוקקים כפולים, ואחריהם חמישה נפחי עמודים של מים מזוקקים כפולים. החל את הדגימה על העמודה בהזרקה או באמצעות משאבת דגימה ואסוף את הזרימה.דרך. שטפו את העמודה בנפח עמוד אחד של מאגר המלח הנמוך.הגדר אלוטציה הדרגתית ליניארית מ-100% מאגר מלח נמוך ל-100% מאגר מלח גבוה בתוך שלושה נפחי עמודים. לאסוף ברציפות שברים מיליליטר אחד. לאחר סיום השיפוע, המשיכו לפעול עם מאגר מלח גבוה עד שלא יזוהו עוד פסגות הקשורות לחלבון בכרומטוגרמה בטווח של נפח עמודה אחד.יש למרוח מיליליטר אחד של 25% SDS המומס ב-0.5 נתרן הידרוקסיד טוחן ומים מזוקקים כפולים לניקוי העמודה. ברצף לשטוף את העמוד עם שלושה נפחי עמודים של מים מזוקקים כפולים ושלושה נפחי עמודים של 20% אתנול במים מזוקקים כפולים. אסוף את דגימות ה- SDS-PAGE של כל שברי השיא והזרימה- דרך.הצמד מקפיא את השברים שנאספו בחנקן נוזלי ומאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר בדיקתם באמצעות כתם מערבי, להפשיר ולאחם את השברים המכילים את החלבונים המעניינים ולהשליך את האחרים. כדי לבצע את שלב הטיהור, הפחיתו את נפח תמיסת החלבון לשני מיליליטרים באמצעות יחידות מסנן אולטרה צנטריפוגה.סנן ברצף את הפתרון עם יחידות מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל מיקרו-קירור. שיווי המשקל של עמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל עם נפח עמודה אחד של מאגר רץ המכיל דיתיותריאטול מילימולרי אחד. טען את הדגימה על העמודה והפעל את יחידת הכרומטוגרפיה עד שכל החלבונים יתחמקו כפי שתואר קודם לכן.הכינו 50 דגימות מיקרוליטר לניתוח SDS-PAGE וכתמים מערביים שתוארו קודם לכן. יש לשטוף את העמוד ברצף עם נפח עמוד אחד של מים מזוקקים כפולים ונפח עמודה אחד של 20% אתנול במים מזוקקים כפולים. לאחר ביצוע ניתוח כתמים מערביים, אסוף את כל FAHD1 המכיל שברים.הפחיתו את נפח תמיסת החלבון לשני מיליליטרים באמצעות יחידות מסנן אולטרה צנטריפוגה. הקרנת כתם מערבית מראה את נוכחותם של החזירים FAHD1 בסופרנטנט עם רצועה של 25 קילודלטון בעוד השליטה החיובית המתויגת פועלת על 34 קילודלטון. החזיר FAHD1 מליזאט טוהר על ידי כרומטוגרפיית חילופי אניונים והחלבונים הקושרים הוסרו על ידי אלוטיון.שברים המכילים חזירים FAHD1 זוהו על ידי ניתוח כתמים מערביים, מאוגדים ומרוכזים. דגימות חלבון טוהרו על ידי SEC וזוהו על ידי ניתוח כתמים מערביים. התשואה של חלבון FAHD1 חזירי הייתה בערך מיליגרם אחד עם רמת טוהר של 80%.ניתוח כתמים מערבי זיהה את חלבון FAHD1 של העכבר בזרימה-דרך יחד עם חלבונים אחרים. הזרימה-דרך הוחלה על כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל. שברים המכילים FAHD1 רוכזו, רוכזו ויושמו על ניתוח SDS-PAGE.עם זאת, התשואה של חלבון לא היה גבוה מאוד. הפעילות האנזימטית הספציפית של החזיר FAHD1 עולה עם רמת הטוהר עם הגדלת הכמות היחסית של FAHD1 לכל סך החלבון. ריכוזים גבוהים יותר של אמוניום סולפט גורמים לאפקט החיוך, אשר ניתן לפתור במתח נמוך יותר.חלבון נוסף נמצא בליזאט ובסופרנט בריכוז של 15%. עם זאת, בריכוזים גבוהים יותר, דגימות עשויות לזרז ולא ניתן לזהות אותן. הפרוטוקול המוצג כאן דורש שהחלבון יהיה פתיר.יש לבדוק ולהגדיר תנאים אופטימליים למשקעים ו- pH או התאמת גודל לכרומטוגרפיה. חקר התפקוד האנזימטי, חקירת מבנה החלבון והתפתחות הנוגדן נתמכים מאוד כאשר חלבון מופק מרקמה ולא מופק מחיידקים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...