Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Gli autori sono molto grati per l'assistenza tecnica di Ayse Öztürk ed Eva Albertini. I topi utilizzati per la generazione di tessuto epatico sono stati mantenuti sotto la supervisione di Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Istituto per la ricerca sull'invecchiamento biomedico presso l'Università di Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nel rispetto delle linee guida istituzionali. Il rene suino è stato ottenuto fresco dal supermercato locale. I tessuti epatici sono stati raccolti da topi selvatici C57BL6 mantenuti presso l'Istituto per la ricerca sull'invecchiamento biomedico dell'Università di Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria sotto la supervisione di Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, coperto da autorizzazione etica come leader del progetto rilasciata nel 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). La...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).</li><li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor.">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis.">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype.">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization,+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins.">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification.">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).</li><li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins:+Between+meaning+and+different+methods).">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li><li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes.">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(SDS-PAGE).">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li><li>. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011)</li><li>S&#248;rensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

Passaggi critici nel protocollo Seguire le linee guida comuni per la manipolazione delle proteine è essenziale, come lavorare sul ghiaccio e in condizioni di pH e sale moderate. L'uso di inibitori della proteasi è benefico per il metodo, mentre l'uso di inibitori del proteasoma è altamente raccomandato. Il congelamento e lo scongelamento del campione possono sempre comportare la precipitazione proteica (almeno parzialmente), pertanto qualsiasi aliquota scongelata del lisato proteico iniziale (fase ...

La proteina 1 contenente dominio FAH eucariotico (FAHD1) agisce come ossalacetato bifunzionale (OAA) decarbossilasi (ODx)1 e idrolasi acilpropurato (ApH)2. È localizzato nei mitocondri2 e appartiene all'ampia superfamiglia FAH degli enzimi 1,2,3,4,5,6. Mentre la sua attività ApH è solo di minore rilevanza, l'attività ODx di FAHD1 è coinvolta nella regolazione del flusso del ciclo TCA 1,7,8,9. L'OAA non è solo richiesto per la reazione centrale della citrato sintasi nel ciclo dell'acido tricarbossilico, ma agisce anche come inibitore competitivo della succinato deidrogenasi come parte del sistema di trasporto degli elettroni e come metabolita cataplerotico. La downregulation dell'espressione genica di FAHD1 nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) ha determinato una significativa riduzione del tasso di proliferazione cellulare10 e una significativa inibizione del potenziale di membrana mitocondriale, associata a un concomitante passaggio alla glicolisi. Il modello di lavoro si riferisce alla senescenza associata alla disfunzione mitocondriale (MiDAS)11-like fenotipo8, in cui i livelli di OAA mitocondriale sono strettamente regolati dall'attività FAHD1 1,8,9.
La proteina ricombinante è più facile da ottenere attraverso l'espressione e la purificazione dai batteri12 piuttosto che dai tessuti. Tuttavia, una proteina espressa nei batteri può essere influenzata dalla possibile mancanza di modifiche post-traduzionali, o può semplicemente essere problematica (ad esempio, a causa della perdita di plasmidi, risposte allo stress batterico, legami disolfuro distorti / non formati, nessuna o scarsa secrezione, aggregazione proteica, scissione proteolitica, ecc.). Per alcune applicazioni, le proteine devono essere ottenute dal lisato cellulare o dal tessuto, al fine di includere tali modifiche e/o di escludere possibili artefatti. La proteina purificata dai tessuti supporta lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e/o inibitori farmacologici potenti e specifici per enzimi selezionati, come per FAHD113.
Questo manoscritto presenta una serie di metodi per l'estrazione e la purificazione di FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi descritti richiedono una cromatografia liquida proteica veloce (FPLC), ma per il resto utilizzano apparecchiature di laboratorio comuni. Metodi alternativi possono essere trovati altrove 14,15,16,17. Dopo l'estrazione totale delle proteine, il protocollo proposto prevede una fase di test, in cui vengono discussi i sottoprotocolli per la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico (Figura 1). Dopo aver definito questi sotto-protocolli, la proteina di interesse viene estratta attraverso una strategia sequenziale utilizzando lo scambio ionico e la cromatografia di esclusione dimensionale con FPLC. Sulla base di queste linee guida, il protocollo finale può essere adattato individualmente per altre proteine di interesse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> Figura 1: La strategia generale di questo protocollo. Dall'alto verso il basso: le proteine vengono estratte dai tessuti. L'omogeneizzato tissutale viene preparato, centrifugato e filtrato. Per ogni coppia di campioni surnatante e derivati da pellet, è necessario eseguire test per la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico (FPLC) per sondare le condizioni ottimali. Dopo aver stabilito questi sotto-protocolli, la proteina può essere estratta tramite una procedura sequenziale di precipitazione del solfato di ammonio, cromatografia a scambio ionico e cromatografia di esclusione di dimensioni ripetitive (FPLC) a diverse concentrazioni di pH e sale. Tutti i passaggi devono essere controllati da western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

La proteina 1 contenente dominio fumarilacetato idrolasi (FAHD1) è il primo membro identificato della superfamiglia FAH negli eucarioti, che agisce come ossalacetato decarbossilasi nei mitocondri. Questo articolo presenta una serie di metodi per l'estrazione e la purificazione di FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi coperti sono la cromatografia a scambio ionico con cromatografia liquida proteica veloce (FPLC), la filtrazione preparativa e analitica del gel con FPLC e gli approcci proteomici. Dopo l'estrazione totale delle proteine, sono state esplorate la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico e FAHD1 è stato estratto tramite una strategia sequenziale utilizzando lo scambio ionico e la cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo approccio rappresentativo può essere adattato ad altre proteine di interesse (espresse a livelli significativi) e modificato per altri tessuti. Le proteine purificate dai tessuti possono supportare lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e/o inibitori farmacologici potenti e specifici.

La proteina FAHD1 è stata estratta dal rene suino e dal fegato di topo utilizzando il protocollo presentato. Per il tessuto di topo, sono necessari più organi per ottenere diversi μg dopo la fase finale di purificazione. Per questo motivo, questo articolo si concentra sull'estrazione di FAHD1 dai reni suini, che è un esperimento molto più esemplare. L'estrazione di FAHD1 dal fegato di topo viene eseguita per presentare le difficoltà e le possibili insidie di questo protocollo. Si raccomanda generalmente di utilizza...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Questo protocollo descrive come estrarre la proteina 1 contenente dominio della fumarilacetoacetato idrolasi (FAHD1) dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi elencati possono essere adattati ad altre proteine di interesse e modificati per altri tessuti.

Estrazione e purificazione della proteina FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

La purificazione delle proteine ricombinanti dai batteri è un metodo ben consolidato. Tuttavia, possono verificarsi diversi problemi durante l'utilizzo di queste tecniche. Avere metodi per estrarre proteine dai tessuti è sicuramente attraente.Il vantaggio principale di questo metodo è che si può estrarre la proteina nella sua forma fisiologica, compresi tutti gli effetti reciproci che possono influire sul suo ripiegamento e sull'attività catalitica. Questo approccio può essere adattato ad altre proteine di interesse e modificato per altri tessuti. Le proteine purificate dai tessuti possono supportare lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e inibitori farmacologici.Per iniziare, preparare il tampone di lisi proteica mescolando 250 millilitri di PBS con 50 millimolari fluoruro di sodio, un fluoruro di fenilmetilsulfonil millimolare, due microgrammi per millilitro aprotinina e un ortovanadato attivato millimolare. Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante a siringa da 0,22 micrometri. Preparare i tubi con due millilitri di tampone di lisi per grammo di tessuto e metterli sul ghiaccio.Per preparare il campione di tessuto, sezionare il tessuto di circa 100 milligrammi ciascuno su una lastra di vetro pre-pulita posta sul ghiaccio in una scatola di polistirene espanso. Trasferire i pezzi di tessuto nei tubi preparati per la successiva lisi. Per preparare una soluzione satura di solfato di ammonio, riscaldare 500 millilitri di acqua doppia distillata a 70 gradi Celsius.Mentre si mescola, aggiungere gradualmente solfato di ammonio in polvere fino a quando non si scioglie più solfato di ammonio. Raffreddare questa soluzione satura a temperatura ambiente e conservarla a quattro gradi Celsius durante la notte. Per omogeneizzare i tessuti renali suini, sonicare la sospensione preferibilmente con una sonda ad ultrasuoni mantenendo il campione sul ghiaccio.Nel caso di tessuti epatici di topo, utilizzare un omogeneizzatore elettrico e lavarlo regolarmente in PBS per evitare l'intasamento mantenendo i campioni sul ghiaccio. Prelevare 20 microlitri dai campioni e verificare al microscopio se le cellule del tessuto omogeneizzato sono correttamente distrutte. Altrimenti, ripeti l'omogeneizzazione.Centrifugare i tubi a 10.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e metterlo sul ghiaccio. Successivamente filtrare il surnatante utilizzando unità filtranti a siringa da 0,45 micrometri e 0,22 micrometri.Aliquotare il surnatante in lotti da 10 millilitri e congelarli a meno 20 gradi Celsius per la conservazione a breve termine o a meno 80 gradi Celsius per una conservazione più lunga. Preparare un campione di 50 microlitri per l'analisi SDS-PAGE o Western blot aggiungendo 10 microlitri di cinque volte il buffer del campione SDS a 40 microlitri del surnatante e quindi bollendo a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Preparare un gel discontinuo al 12,5% di poliacrilammide SDS-PAGE secondo le istruzioni del produttore.Per eseguire l'analisi SDS-PAGE, caricare successivamente i pozzetti del gel con una scala marcatore proteica, cinque nanogrammi di proteina ricombinante FAHD1 umana come controllo positivo, 20 microlitri del campione da analizzare e i restanti pozzetti con 20 microlitri di tampone campione SDS-PAGE preparato. Eseguire i gel SDS-PAGE a 125 volt utilizzando il buffer di funzionamento SDS. Dopo aver completato SDS-PAGE, eseguire un'analisi Western blot, sondare le membrane utilizzando l'anticorpo disponibile sollevato contro FAHD1.Dopo aver preparato aliquote surnanti come descritto in precedenza, procedere dopo lo scongelamento o processo direttamente dopo l'estrazione delle proteine senza congelare il campione. Filtrare il campione utilizzando un'unità filtrante da 0,22 micrometri per escludere possibili precipitati dopo lo scongelamento. Preparare sei tubi da 1,5 millilitri su ghiaccio, quindi trasferire 250 microlitri di campione in ciascun tubo.Preparare una serie di diluizione di solfato di ammonio nei tubi preparati e portare il volume finale a 1.000 microlitro con tampone di lisi proteica. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte su un rotatore valvolare. Utilizzando una centrifuga da tavolo, centrifugare a 10.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire con cura tutti i supernatanti in tubi separati.Asciugare all'aria i pellet risultanti e risospestarne ciascuno in 1.000 microlitro di acqua doppia distillata. Per ogni coppia di pellet risospeso e surnatante del passaggio precedente, mescolare 40 microlitri con 10 microlitri di cinque volte il tampone del campione SDS e far bollire a 95 gradi Celsius con coperchi aperti fino a quando la maggior parte del liquido non si è vaporizzata. Quindi risospesare il pellet in una miscela di 50% di dimetilsolfossido in acqua doppia distillata.Eseguire SDS-PAGE caricando i campioni derivati dal pellet risospeso e dal surnatante in coppia, seguiti da un'analisi Western blot. Tuttavia, eseguire i gel a 80 volt per tre ore. Impostare il sistema FPLC con la colonna di scambio anionico o cationico.Lavare la colonna con cinque volumi di colonna di etanolo al 20% in acqua a doppia distillazione, seguita da cinque volumi di colonna di acqua a doppia distillazione. Applicare il campione sulla colonna mediante iniezione o utilizzando una pompa campione e raccogliere il flusso attraverso. Lavare la colonna con un volume di colonna del buffer a basso contenuto di sale.Impostare un'eluizione a gradiente lineare dal tampone salino basso al 100% al tampone salino alto 100% all'interno di tre volumi di colonna. Raccogliere continuamente frazioni di un millilitro. Al termine del gradiente, continuare a funzionare con un tampone salino elevato fino a quando non vengono rilevati più picchi associati alle proteine nel cromatogramma nell'intervallo di un volume di colonna.Applicare un millilitro di 25% SDS disciolto in idrossido di sodio molare 0,5 e acqua doppia distillata per pulire la colonna. Lavare consecutivamente la colonna con tre volumi a colonna di acqua doppia distillata e tre volumi a colonna di etanolo al 20% in acqua a doppia distillazione. Raccogliere i campioni SDS-PAGE di tutte le frazioni di picco e il flusso attraverso.Snap congelare le frazioni raccolte in azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Dopo averli sondati tramite Western blot, scongelare e raggruppare le frazioni contenenti le proteine di interesse e scartare le altre. Per eseguire la fase di purificazione, ridurre il volume della soluzione proteica fino a due millilitri utilizzando unità filtranti ultra centrifugazione.Filtrare sequenzialmente la soluzione con unità filtranti a siringa da 0,45 micrometri e 0,22 micrometri per rimuovere qualsiasi microprecipitazione. Equilibrare la colonna di cromatografia di esclusione dimensionale con un volume di colonna di buffer in esecuzione contenente un ditiotreitolo millimolare. Caricare il campione sulla colonna ed eseguire l'unità di cromatografia fino a quando tutte le proteine sono eluite come descritto in precedenza.Preparare 50 campioni di microlitro per l'analisi SDS-PAGE e Western blot descritta in precedenza. Lavare consecutivamente la colonna con un volume di colonna di acqua doppia distillata e un volume di colonna di etanolo al 20% in acqua a doppia distillazione. Dopo aver eseguito l'analisi Western blot, raggruppare tutte le frazioni contenenti FAHD1.Ridurre il volume della soluzione proteica a due millilitri utilizzando unità filtranti ultra centrifugazione. Lo screening Western blot mostra la presenza di FAHD1 suino nel surnatante con una banda a 25 kilodalton mentre il controllo positivo taggato corre a 34 kilodalton. Il fahd1 suino dal lisato è stato purificato mediante cromatografia a scambio anionico e le proteine leganti sono state rimosse mediante eluizione.Le frazioni contenenti FAHD1 suino sono state identificate mediante analisi Western blot, raggruppate e concentrate. I campioni di proteine sono stati purificati dalla SEC e identificati dall'analisi Western blot. La resa della proteina FAHD1 suina era di circa un milligrammo con un livello di purezza dell'80%.L'analisi Western blot ha rilevato la proteina FAHD1 del topo nel flusso attraverso insieme ad altre proteine. Il flow-through è stato applicato per la cromatografia di esclusione dimensionale. Le frazioni contenenti FAHD1 sono state raggruppate, concentrate e applicate all'analisi SDS-PAGE.Tuttavia, la resa delle proteine non era molto alta. L'attività enzimatica specifica del suino FAHD1 aumenta con il livello di purezza aumentando la quantità relativa di FAHD1 per proteina totale. Concentrazioni più elevate di solfato di ammonio causano l'effetto sorriso, che può essere risolto a una tensione inferiore.Ulteriori proteine sono state trovate nel lisato e nel surnatante alla concentrazione del 15%. Tuttavia, a concentrazioni più elevate, i campioni possono precipitare e non possono essere rilevati. Il protocollo qui presentato richiede che la proteina sia risolvibile.Le condizioni ottimali per la precipitazione e la regolazione del pH o delle dimensioni per la cromatografia devono essere testate e definite. Lo studio della funzione enzimatica, lo studio della struttura proteica e lo sviluppo di anticorpi sono notevolmente supportati quando si hanno proteine estratte dai tessuti piuttosto che estratte dai batteri.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Progettazione, produzione e purificazione

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Ricerca

Biochimica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Estrazione di caffeina, l'attività enzimatica e l'espressione genica della sintasi di caffeina da sospensioni di cellule vegetali

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Mutagenesi PCR, clonazione, espressione, protocolli di purificazione rapida delle proteine e cristallizzazione del tipo selvatico e delle forme mutanti di triptofano sintasi

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Estrazione, purificazione e profilatura del ganglioside

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Estrazione e visualizzazione di aggregati proteici dopo il trattamento di Escherichia coli con un fattore di stress proteotossico

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...