Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
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저자는 Ayse Öztürk와 Eva Albertini의 기술 지원에 매우 감사드립니다. 간 조직의 생성에 사용된 마우스는 Univ.-Doz의 감독 하에 유지되었다. Pidder Jansen-Dürr 박사 (Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria의 생물 의학 노화 연구 연구소).

모든 실험은 제도적 지침에 따라 수행되었다. 돼지 신장은 현지 슈퍼마켓에서 신선하게 얻어졌다. 간 조직은 Univ.-Doz의 감독하에 오스트리아 인스브루크 대학교 렌스벡 10, 6020 인스브루크의 생물의학 노화 연구소에서 유지된 C57BL6 야생형 마우스로부터 수확되었다. Pidder Jansen-Dürr 박사는 2013 년에 발행 된 프로젝트 리더로서 윤리적 허가를 받았습니다 (BMWF-66.008/0007-II/3b / 2013). 이 프로젝트에 대한 ?...

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	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis.">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype.">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization,+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins.">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins:+Between+meaning+and+different+methods).">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li><li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes.">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).</li><li>Gordon, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

프로토콜의 중요한 단계 단백질의 취급에 대한 일반적인 지침을 따르는 것은 얼음 작업과 적당한 pH 및 소금 조건에서 작업하는 것과 같이 필수적입니다. 프로테아제 억제제의 사용은 방법에 유익한 반면, 프로테아좀 억제제의 사용은 매우 권장됩니다. 샘플을 동결 및 해동하면 항상 (적어도 부분적으로) 단백질 침전이 발생할 수 있으므로 초기 단백질 용해물의 해동 분취량 (단계 2...

진핵 FAH 도메인-함유 단백질 1 (FAHD1)은 이관능성 옥살로아세테이트 (OAA) 탈카르복실라제 (ODx)1 및 아실피루베이트 가수분해효소 (ApH)2로서 작용한다. 그것은 미토콘드리아 2에 국한되어 있으며 효소 1,2,3,4,5,6의 광범위한 FAH 수퍼 패밀리에 속합니다. 그의 ApH 활성은 단지 미미한 관련성이 있는 반면, FAHD1의 ODx 활성은 TCA 사이클 플럭스 1,7,8,9의 조절에 관여한다. OAA는 트리카르복실산 사이클에서 중심 시트레이트 합성효소 반응에 필요할 뿐만 아니라 전자 수송 시스템의 일부로서 그리고 카타플레틱 대사산물로서 숙시네이트 데하이드로게나제의 경쟁적 억제제로서 작용한다. 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC)에서 FAHD1 유전자 발현의 하향 조절은 세포 증식 속도의 현저한 감소(10), 및 미토콘드리아 막 전위의 현저한 억제를 초래했으며, 이는 당분해로의 수반되는 전환과 관련되었다. 작업 모델은 미토콘드리아 기능 장애 관련 노화 (MiDAS)11 유사 표현형 8을 말하며, 여기서 미토콘드리아 OAA 수준은 FAHD1 활성 1,8,9에 의해 엄격하게 조절됩니다.
재조합 단백질은 조직보다는 박테리아(12)로부터의 발현 및 정제를 통해 수득하는 것이 더 쉽다. 그러나, 박테리아에서 발현된 단백질은 번역 후 변형의 가능한 부족에 의해 편향될 수 있거나, 또는 단순히 문제가 될 수 있다(즉, 플라스미드 손실, 박테리아 스트레스 반응, 왜곡/형성되지 않은 이황화 결합, 없음 또는 불량한 분비, 단백질 응집, 단백질 분해 절단 등). 특정 적용을 위해, 단백질은 그러한 변형을 포함하고/하거나 가능한 아티팩트를 배제하기 위해 세포 용해물 또는 조직으로부터 수득될 필요가 있다. 조직으로부터 정제된 단백질은 FAHD113과 같은 선택된 효소에 대한 고품질 항체 및/또는 강력하고 특이적인 약리학적 억제제의 개발을 지원한다.
이 원고는 돼지 신장과 마우스 간에서 FAHD1을 추출하고 정제하기위한 일련의 방법을 제시합니다. 기술된 방법에는 빠른 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)가 필요하지만 그렇지 않으면 일반적인 실험실 장비를 사용합니다. 대안적인 방법들은 다른 곳에서 발견될 수 있다(14,15,16,17). 총 단백질 추출 후, 제안된 프로토콜은 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피를 위한 서브프로토콜이 논의되는 테스트 단계를 포함한다(도 1). 이들 서브-프로토콜을 정의한 후에, 관심있는 단백질은 FPLC를 사용한 이온 교환 및 크기-배제 크로마토그래피를 사용하는 순차적 전략을 통해 추출된다. 이들 가이드라인에 기초하여, 최종 프로토콜은 관심있는 다른 단백질에 대해 개별적으로 적응될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> 그림 1: 이 프로토콜의 전반적인 전략. 위에서 아래로: 단백질은 조직에서 추출됩니다. 조직 균질액을 제조하고, 원심분리하고, 여과한다. 각 쌍의 상청액 및 펠렛 유래 샘플에 대해 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피 (FPLC)에 대한 테스트를 수행하여 최적의 조건을 조사해야합니다. 이들 서브프로토콜을 확립한 후, 단백질은 다양한 pH 및 염 농도에서 황산암모늄 침전, 이온 교환 크로마토그래피 및 반복적 크기 배제 크로마토그래피(FPLC)의 순차적 절차를 통해 추출될 수 있다. 모든 단계는 웨스턴 블롯으로 제어해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

푸마리아세토아세테이트 가수분해효소 도메인-함유 단백질 1 (FAHD1)은 진핵생물에서 FAH 수퍼패밀리의 최초로 확인된 구성원이며, 미토콘드리아에서 옥살로아세테이트 데카르복실라제로서 작용한다. 이 기사에서는 돼지 신장 및 마우스 간에서 FAHD1을 추출하고 정제하는 일련의 방법을 제시합니다. 다루는 방법은 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)를 사용한 이온 교환 크로마토그래피, FPLC를 사용한 제조 및 분석 겔 여과 및 프로테오믹 접근법입니다. 총 단백질 추출 후, 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피를 탐구하고, FAHD1은 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 순차적 전략을 통해 추출되었다. 이러한 대표적인 접근법은 관심있는 다른 단백질(상당한 수준에서 발현됨)에 적응되고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다. 조직으로부터 정제된 단백질은 고품질 항체 및/또는 강력하고 특이적인 약리학적 억제제의 개발을 지원할 수 있다.

FAHD1 단백질은 제시된 프로토콜을 사용하여 돼지 신장 및 마우스 간으로부터 추출되었다. 마우스 조직의 경우, 최종 정제 단계 후에 수 μg을 얻기 위해서는 여러 장기가 필요합니다. 이러한 이유로이 기사는 돼지 신장에서 FAHD1을 추출하는 데 중점을 둡니다.이 실험은 훨씬 더 모범적 인 실험입니다. 마우스 간에서 FAHD1의 추출은이 프로토콜의 어려움과 가능한 함정을 제시하기 위해 수행됩니다. 일...

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Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

이 프로토콜은 돼지 신장 및 마우스 간으로부터 푸마리아세토아세테이트 가수분해효소 도메인 함유 단백질 1(FAHD1)을 추출하는 방법을 기술한다. 열거된 방법들은 관심있는 다른 단백질에 적응될 수 있고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다.

돼지 신장과 마우스 간에서 FAHD1 단백질의 추출 및 정제

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

박테리아로부터 재조합 단백질을 정제하는 것은 잘 확립된 방법이다. 그러나 이러한 기술을 사용할 때 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 조직에서 단백질을 추출하는 방법을 갖는 것은 확실히 매력적입니다.이 방법의 주요 이점은 그의 폴딩 및 촉매 활성에 영향을 줄 수있는 모든 상호 효과를 포함하여 그의 생리적 형태로 단백질을 추출 할 수 있다는 것입니다. 이러한 접근법은 관심있는 다른 단백질에 적응되고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다. 조직으로부터 정제된 단백질은 고품질 항체 및 약리학적 억제제의 개발을 지원할 수 있다.시작하려면 PBS 250 밀리리터와 50 밀리몰 플루오라이드 나트륨, 밀리몰 페닐메틸설포닐 플루오라이드 한 개, 밀리리터 아프로티닌 당 두 마이크로그램, 및 밀리몰 활성화된 오르토바나데이트 한 개를 혼합하여 단백질 용해 완충액을 준비한다. 용액을 0.22 마이크로미터 시린지 필터 유닛을 사용하여 여과한다. 조직 그램 당 두 밀리리터의 용해 완충액으로 튜브를 준비하고 얼음 위에 놓습니다.조직 샘플을 제조하기 위해, 폴리스티렌 폼 박스의 얼음 위에 놓인 미리 세척된 유리판 위에 각각 약 100 밀리그램의 조직을 해부한다. 후속 용해를 위해 조직 조각을 준비된 튜브로 옮깁니다. 포화 황산암모늄 용액을 제조하려면 이중 증류수 500 밀리리터를 섭씨 70도까지 가열하십시오.교반하면서 황산암모늄이 더 이상 용해되지 않을 때까지 황산암모늄 분말을 서서히 첨가한다. 이 포화 용액을 실온으로 식히고 하룻밤 사이에 섭씨 네 도에 보관하십시오. 돼지 신장 조직을 균질화하려면 샘플을 얼음 위에 유지하면서 초음파 프로브로 현탁액을 초음파 처리하는 것이 좋습니다.마우스 간 조직의 경우, 전기 균질 기를 사용하고 PBS로 정기적으로 세척하여 샘플을 얼음 위에 보관하면서 막힘을 방지하십시오. 샘플에서 20 마이크로 리터를 꺼내 균질화 된 조직의 세포가 제대로 파괴되었는지 현미경으로 확인하십시오. 그렇지 않으면 균질화를 반복하십시오.튜브를 섭씨 4도에서 30분 동안 10, 000배 G에서 원심분리한다. 상층액을 신선한 튜브에 모아 얼음 위에 놓습니다. 이어서, 상청액을 0.45 마이크로미터 및 0.22 마이크로미터 시린지 필터 유닛을 사용하여 여과한다.상층액을 10 밀리리터 배치로 분취하여 단기 보관의 경우 영하 20도, 장기간 보관을 위해 영하 80도에서 동결시킵니다. 50 마이크로리터의 SDS 샘플 버퍼를 40 마이크로리터의 상청액에 5배 10 마이크로리터의 상청액을 첨가한 다음, 섭씨 95도에서 10분 동안 끓여서 SDS-PAGE 또는 웨스턴 블롯 분석을 위해 50 마이크로리터 샘플을 준비한다. 제조업체의 지침에 따라 불연속 12.5 % 폴리 아크릴 아미드 SDS-PAGE 젤을 준비하십시오.SDS-PAGE 분석을 수행하기 위해, 단백질 마커 사다리, 양성 대조군으로서 인간 FAHD1 재조합 단백질의 다섯 나노그램, 분석할 샘플의 20 마이크로리터, 및 20 마이크로리터의 제조된 SDS-PAGE 샘플 버퍼로 나머지 웰을 연속적으로 로딩한다. SDS 실행 버퍼를 사용하여 SDS-PAGE 젤을 125V로 실행합니다. SDS-PAGE가 완료된 후, 웨스턴 블롯 분석을 수행하고, FAHD1에 대해 상승가능한 항체를 사용하여 멤브레인을 프로브한다.앞서 기술한 바와 같이 상청액 분취량을 준비한 후, 샘플을 동결시키지 않고 해동 후 처리하거나 단백질 추출 직후에 처리한다. 해동 후 가능한 침전물을 배제하기 위해 0.22 마이크로미터 필터 유닛을 사용하여 샘플을 여과한다. 얼음 위에 여섯 개의 1.5 밀리리터 튜브를 준비한 다음 250 마이크로 리터의 샘플을 각 튜브로 옮깁니다.준비된 튜브에 황산암모늄의 희석 시리즈를 준비하고 단백질 용해 완충액으로 최종 부피를 1, 000 마이크로리터로 구성한다. 샘플을 튜브 회전기 상에서 하룻밤 동안 섭씨 네 도에서 인큐베이션한다. 탁상용 원심분리기를 이용하여 섭씨 4도에서 30분 동안 10, 000배 G에서 원심분리하고 모든 상층액을 별도의 튜브로 조심스럽게 옮긴다.생성된 펠렛을 공기 건조시키고 이들 각각을 1, 000 마이크로리터의 이중 증류수에 재현탁시킨다. 이전 단계의 재현탁 펠릿 및 상청액의 각 쌍에 대해 40 마이크로 리터를 SDS 샘플 버퍼의 5 배의 10 마이크로 리터와 혼합하고 대부분의 액체가 기화 될 때까지 뚜껑을 열어 섭씨 95도에서 끓입니다. 그런 다음 펠렛을 이중 증류수에 50 % 디메틸 설폭사이드의 혼합물에 재현탁시킨다.재현탁된 펠릿 및 상청액으로부터 유래된 샘플을 쌍으로 로딩하여 SDS-PAGE를 수행하고, 이어서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그러나 젤을 80 볼트에서 세 시간 동안 실행하십시오. 음이온 또는 양이온 교환 컬럼으로 FPLC 시스템을 설정하십시오.컬럼을 이중 증류수에서 20% 에탄올의 다섯 컬럼 부피로 세척한 다음, 다섯 컬럼 부피의 이중 증류수로 세척한다. 주입 또는 샘플 펌프를 사용하여 샘플을 컬럼에 적용하고 유동을 수집합니다. 저염 완충액의 하나의 컬럼 부피로 컬럼을 세척한다.세 컬럼 부피 내에서 100% 저염 완충액에서 100% 고염 완충액으로 선형 구배 용출을 설정합니다. 지속적으로 하나의 밀리리터 분수를 수집합니다. 구배가 끝난 후, 하나의 컬럼 부피의 범위에 걸쳐 크로마토그램에서 더 이상 단백질-관련 피크가 검출되지 않을 때까지 높은 염 완충액으로 계속 실행한다.0.5 몰 수산화나트륨과 이중 증류수에 용해 된 25 % SDS 한 밀리리터를 적용하여 컬럼을 청소하십시오. 이중 증류수에서 세 개의 컬럼 부피의 이중 증류수와 20 % 에탄올의 세 컬럼 볼륨으로 컬럼을 연속적으로 세척하십시오. 모든 피크 분획 및 유동 스루의 SDS-PAGE 샘플을 수집한다.스냅은 수집 된 분획을 액체 질소에서 동결시키고 영하 80도에서 보관하십시오. 웨스턴 블롯을 통해 이들을 프로빙한 후, 관심있는 단백질을 포함하는 분획을 해동 및 풀링하고 다른 것들은 버린다. 정제 단계를 수행하려면 울트라 원심분리 필터 장치를 사용하여 단백질 용액의 부피를 두 밀리리터로 줄입니다.용액을 0.45 마이크로미터 및 0.22 마이크로미터 시린지 필터 유닛으로 순차적으로 필터링하여 임의의 미세침전을 제거한다. 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 하나의 밀리몰 디티오트레이톨을 함유하는 실행 완충액의 하나의 컬럼 부피로 평형화시킨다. 샘플을 컬럼 상에 로딩하고, 이전에 기술된 바와 같이 모든 단백질이 용출될 때까지 크로마토그래피 유닛을 실행한다.앞서 설명한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 50 마이크로리터 샘플을 준비합니다. 이중 증류수에서 하나의 컬럼 부피의 이중 증류수와 20 % 에탄올의 하나의 컬럼 부피로 컬럼을 연속적으로 세척하십시오. 웨스턴 블롯 분석을 수행한 후, 분획을 함유하는 모든 FAHD1을 풀링한다.울트라 원심분리 필터 유닛을 사용하여 단백질 용액의 부피를 두 밀리리터로 줄입니다. 웨스턴 블롯 스크리닝은 태그가 지정된 양성 대조군이 34킬로달톤에서 실행되는 동안 25킬로달톤의 밴드를 가진 상청액에 돼지 FAHD1의 존재를 보여줍니다. 용해물로부터 돼지 FAHD1을 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하고, 결합 단백질을 용출에 의해 제거하였다.돼지 FAHD1을 함유하는 분획은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었고, 풀링되고 농축되었다. 단백질 샘플을 SEC에 의해 정제하고 웨스턴 블롯 분석에 의해 동정하였다. 돼지 FAHD1 단백질의 수율은 80 % 순도의 약 1 밀리그램이었다.웨스턴 블롯 분석은 마우스 FAHD1 단백질을 다른 단백질과 함께 유동-관통하여 검출하였다. 유동-스루를 크기 배제 크로마토그래피에 적용하였다. FAHD1을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축하고, SDS-PAGE 분석에 적용하였다.그러나, 단백질의 수율은 그리 높지 않았다. 돼지 FAHD1의 특정 효소 활성은 총 단백질 당 FAHD1의 상대적 양을 증가시킬 때 순도 수준에 따라 증가합니다. 황산 암모늄의 높은 농도는 더 낮은 전압에서 해결 될 수있는 미소 효과를 일으킨다.추가의 단백질은 15% 농도에서 용해물 및 상청액에서 발견되었다. 그러나 더 높은 농도에서는 샘플이 침전 될 수 있으며 검출 할 수 없습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 단백질이 해결 가능하다는 것을 요구합니다.크로마토그래피를 위한 침전 및 pH 또는 크기 조정을 위한 최적 조건은 시험되고 정의되어야 합니다. 효소 기능에 대한 연구, 단백질 구조 조사 및 항체 개발은 박테리아에서 추출하기보다는 조직에서 단백질을 추출 할 때 크게 지원됩니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

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에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

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This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

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PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

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