Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Forfatterne er svært takknemlige for den tekniske hjelpen til Ayse Öztürk og Eva Albertini. Mus som brukes til generering av levervev ble opprettholdt under tilsyn av Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institutt for biomedisinsk aldringsforskning ved Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Østerrike).

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Svin nyre ble hentet frisk fra det lokale supermarkedet. Levervev ble høstet fra C57BL6 villtype mus opprettholdt ved Institute for Biomedical Aging Research ved Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Østerrike under tilsyn av Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, dekket av etisk tillatelse som prosjektleder utstedt i 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Vedlikehold og bruk av musene til prosjektet dekkes under etisk tillatelse Nr. 202...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).</li><li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor.">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis.">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype.">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization,+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins.">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification.">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).</li><li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins:+Between+meaning+and+different+methods).">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li><li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes.">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(SDS-PAGE).">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li><li>. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011)</li><li>S&#248;rensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

Kritiske trinn i protokollen Det er viktig å følge vanlige retningslinjer for håndtering av proteiner, som å jobbe på is og ved moderate pH- og saltforhold. Bruken av proteasehemmere er gunstig for metoden, mens bruk av proteasomhemmere anbefales på det sterkeste. Frysing og opptining av prøven kan alltid resultere i proteinutfelling (i det minste delvis), slik at eventuell tint aliquot av innledende proteinlysat (trinn 2) skal behandles kontinuerlig uten pause. Sentrifugering og filtrering ett...

Det eukaryote FAH-domenet som inneholder protein 1 (FAHD1) fungerer som bifunksjonelt oksalacetat (OAA) dekarboksylase (ODx)1 og acylpyruvathydroklase (ApH)2. Den er lokalisert i mitokondrier2 og tilhører den brede FAH superfamilien av enzymer 1,2,3,4,5,6. Mens ApH-aktiviteten bare er av liten relevans, er ODx-aktiviteten til FAHD1 involvert i reguleringen av TCA-syklusfluksen 1,7,8,9. OAA er ikke bare nødvendig for den sentrale sitratsyntasereaksjonen i trikarboksylsyresyklusen, men fungerer også som en konkurransedyktig hemmer av succinat dehydrogenase som en del av elektrontransportsystemet og som en katalakerotisk metabolitt. Nedregulering av FAHD1 genuttrykk i humane navlestrengsvene endotelceller (HUVEC) resulterte i en betydelig reduksjon i frekvensen av celleproliferasjon10, og betydelig hemming av mitokondriemembranpotensial, forbundet med en samtidig bytte til glykolyse. Arbeidsmodellen refererer til mitokondrie dysfunksjon assosiert senescence (MiDAS)11-lignende fenotype8, hvor mitokondrie OAA nivåer er tett regulert av FAHD1 aktivitet 1,8,9.
Rekombinant protein er lettere å oppnå via uttrykk og rensing fra bakterier12 i stedet for fra vev. Imidlertid kan et protein uttrykt i bakterier være partisk av mulig mangel på post-translasjonelle modifikasjoner, eller kan ganske enkelt være problematisk (dvs. på grunn av plasmidtap, bakterielle stressresponser, forvrengte / uformede disulfidbindinger, ingen eller dårlig sekresjon, proteinaggregering, proteolytisk spalting, etc.). For visse bruksområder må protein fås fra cellelys eller vev, for å inkludere slike modifikasjoner og / eller for å utelukke mulige gjenstander. Renset protein fra vev støtter utviklingen av høykvalitets antistoffer, og / eller potente og spesifikke farmakologiske hemmere for utvalgte enzymer, for eksempel for FAHD113.
Dette manuskriptet presenterer en rekke metoder for utvinning og rensing av FAHD1 fra svin nyre og mus lever. De beskrevne metodene krever rask proteinvæskekromatografi (FPLC), men bruker ellers vanlig laboratorieutstyr. Alternative metoder finnes andre steder 14,15,16,17. Etter total proteinutvinning innebærer den foreslåtte protokollen en testfase, der underprotokoller for ammoniumsulfatutfelling og ionisk utvekslingskromatografi diskuteres (figur 1). Etter å ha definert disse underprotokollene, ekstraheres proteinet av interesse via en sekvensiell strategi ved hjelp av ionisk utveksling og størrelsesekskluderingskromatografi med FPLC. Basert på disse retningslinjene kan den endelige protokollen tilpasses individuelt for andre proteiner av interesse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> Figur 1: Den overordnede strategien for denne protokollen. Fra topp til bunn: Protein ekstraheres fra vev. Vev homogenat er tilberedt, sentrifugert og filtrated. For hvert par supernatante og pelletsavledede prøver må tester for ammoniumsulfatutfelling og FPLC (onic exchange chromatography) utføres for å sonde for optimale forhold. Etter å ha etablert disse underprotokollene, kan proteinet ekstraheres via en sekvensiell prosedyre for ammoniumsulfatutfelling, ionisk utvekslingskromatografi og repeterende størrelseseksklusjonskromatografi (FPLC) ved varierende pH- og saltkonsentrasjoner. Alle trinn må kontrolleres av vestlig blott. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

Fumarylacetoaceacetathydrlasedomeneholdig protein 1 (FAHD1) er det første identifiserte medlemmet av FAH-superfamilien i eukaryoter, som fungerer som oksaacetatdekarboksylase i mitokondrier. Denne artikkelen presenterer en rekke metoder for utvinning og rensing av FAHD1 fra svin nyre og mus lever. Dekkede metoder er ionisk utvekslingskromatografi med rask proteinvæskekromatografi (FPLC), forberedende og analytisk gelfiltrering med FPLC og proteomiske tilnærminger. Etter total proteinutvinning ble ammoniumsulfatutfelling og ionisk utvekslingskromatografi utforsket, og FAHD1 ble ekstrahert via en sekvensiell strategi ved hjelp av ionisk utveksling og størrelsesekskluderingskromatografi. Denne representative tilnærmingen kan tilpasses andre proteiner av interesse (uttrykt på betydelige nivåer) og modifisert for andre vev. Renset protein fra vev kan støtte utviklingen av antistoffer av høy kvalitet, og/eller potente og spesifikke farmakologiske hemmere.

FAHD1 protein ble ekstrahert fra svin nyre og mus lever ved hjelp av den presenterte protokollen. For musevev er det nødvendig med flere organer for å oppnå flere μg etter det endelige rensetrinnet. Av denne grunn fokuserer denne artikkelen på utvinning av FAHD1 fra svin nyrer, som er et mye mer eksemplarisk eksperiment. Utvinningen av FAHD1 fra muselever utføres for å presentere vanskelighetene og mulige fallgruver i denne protokollen. Det anbefales generelt å bruke organer som viser et høyt uttrykksnivå av pr...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Denne protokollen beskriver hvordan du trekker ut fumarylacetoaceaceacetathydrlase domeneholdig protein 1 (FAHD1) fra svin nyre og mus lever. De oppførte metodene kan tilpasses andre proteiner av interesse og modifiseres for andre vev.

Ekstraksjon og rensing av FAHD1 Protein fra svin nyre og mus lever

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Rensing av rekombinant protein fra bakterier er en veletablert metode. Det kan imidlertid oppstå flere problemer når du bruker disse teknikkene. Å ha metoder for å trekke ut protein fra vev er sikkert tiltalende.Den største fordelen med denne metoden er at man kan trekke ut proteinet i sin fysiologiske form, inkludert alle gjensidige effekter som kan påvirke folding og katalytisk aktivitet. Denne tilnærmingen kan tilpasses andre proteiner av interesse og modifiseres for annet vev. Renset protein fra vev kan støtte utviklingen av høykvalitets antistoffer og farmakologiske hemmere.Til å begynne med, forberede protein lysis buffer ved å blande 250 milliliter PBS med 50 millimolar natriumfluorid, en millimeter fenylmetylsulfonylfluorid, to mikrogram per milliliter aprotinin og en millimolar aktivert orthovanadate. Filtrer oppløsningen ved hjelp av en 0,22 mikrometer sprøytefilterenhet. Forbered rør med to milliliter lysisbuffer per gram vev og legg dem på is.For å forberede vevsprøven, disseker vevet på ca 100 milligram hver på en forhåndsrenset glassplate plassert på is i en polystyrenskumboks. Overfør vevstykkene inn i de forberedte rørene for etterfølgende lysis. For å forberede en mettet ammoniumsulfatløsning, varme 500 milliliter dobbelt destillert vann til 70 grader Celsius.Under omrøring, tilsett gradvis ammoniumsulfatpulver til ikke mer ammoniumsulfat er oppløst. Avkjøl denne mettede løsningen til romtemperatur og lagre den på fire grader Celsius over natten. For å homogenisere svin nyrevev, soniker suspensjonen helst av en ultralyd sonde mens du holder prøven på is.Når det gjelder levervev med mus, bruk en elektrisk homogenisator og vask den regelmessig i PBS for å forhindre tilstopping mens du holder prøvene på is. Ta 20 mikroliter ut av prøvene og kontroller under mikroskopet om cellene i det homogeniserte vevet er riktig ødelagt. Ellers gjentar du homogeniseringen.Sentrifuger rørene ved 10.000 ganger G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Samle supernatanten i et friskt rør og legg det på is. Filtrer deretter supernatanten ved hjelp av 0,45 mikrometer og 0,22 mikrometer sprøytefilterenheter.Aliquot supernatant i 10 milliliter partier og fryse dem på minus 20 grader Celsius for kortsiktig lagring eller ved minus 80 grader Celsius for lengre lagring. Forbered en 50 mikroliterprøve for SDS-PAGE eller Western blot analyse ved å legge til 10 mikroliter med fem ganger SDS-prøvebufferen til 40 mikroliter av supernatanten og deretter koke ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Forbered en diskontinuerlig 12,5% polyakrylamid SDS-PAGE gel i henhold til produsentens instruksjoner.For å utføre SDS-PAGE-analyse, last brønnene i gelen deretter med en proteinmarkørstige, fem nanogram humant FAHD1 rekombinant protein som en positiv kontroll, 20 mikroliter av prøven som skal analyseres, og de resterende brønnene med 20 mikroliter tilberedt SDS-PAGE prøvebuffer. Kjør SDS-PAGE gels med 125 volt ved hjelp av SDS-bufferen. Etter at SDS-PAGE er fullført, utfør en vestlig flekkanalyse, sonde membranene ved hjelp av det tilgjengelige antistoffet som er reist mot FAHD1.Etter å ha forberedt supernatante aliquots som beskrevet tidligere, enten prosess etter opptining eller prosess rett etter proteinutvinning uten å fryse prøven. Filtrer prøven ved hjelp av en 0,22 mikrometer filterenhet for å utelukke mulige utfellinger etter opptining. Forbered seks 1,5 milliliter rør på is, og overfør deretter 250 mikroliter prøve inn i hvert rør.Forbered en fortynningsserie av ammoniumsulfat i de forberedte rørene og utgjør det endelige volumet til 1000 mikroliter med proteinlysbuffer. Inkuber prøvene ved fire grader Celsius over natten på en rørrotator. Ved hjelp av en sentrifuge sentrifuge sentrifuge ved 10.000 ganger G i 30 minutter ved fire grader Celsius og overfør forsiktig alle supernatantene til separate rør.Lufttørk de resulterende pelletsene og resuspend hver av dem i 1000 mikroliter dobbelt destillert vann. For hvert par resuspended pellet og supernatant fra forrige trinn, bland 40 mikroliter med 10 mikroliter på fem ganger SDS-prøvebufferen og kok ved 95 grader Celsius med åpne lokk til det meste av væsken har fordampet. Deretter resuspenderer pellet i en blanding av 50% dimetylsulfoksid i dobbelt destillert vann.Utfør SDS-PAGE ved å laste inn prøvene avledet fra de resuspenderte pellets og supernatant i par, etterfulgt av en vestlig blotanalyse. Kjør imidlertid gelene på 80 volt i tre timer. Konfigurer FPLC-systemet med den anioniske eller kationiske utvekslingskolonnen.Vask kolonnen med fem kolonnevolumer på 20% etanol i dobbelt destillert vann, etterfulgt av fem kolonnevolumer med dobbelt destillert vann. Påfør prøven på kolonnen enten ved injeksjon eller ved hjelp av en prøvepumpe og samle gjennomstrømningen. Vask kolonnen med ett kolonnevolum av lav saltbuffer.Sett opp en lineær gradient elution fra 100% lav saltbuffer til 100% høy saltbuffer innen tre kolonnevolumer. Samle kontinuerlig en milliliterfraksjoner. Når gradienten er ferdig, fortsetter du å kjøre med en høy saltbuffer til det ikke oppdages flere proteinrelaterte topper i kromatogrammet over området for ett kolonnevolum.Påfør en milliliter 25% SDS oppløst i 0,5 molar natriumhydroksid og dobbelt destillert vann for å rengjøre kolonnen. Vask kolonnen fortløpende med tre kolonnevolumer dobbelt destillert vann og tre kolonnevolumer på 20% etanol i dobbelt destillert vann. Samle inn SDS-PAGE-prøvene av alle toppfraksjoner og gjennomstrømningen.Trykk fryse de oppsamlede fraksjonene i flytende nitrogen og lagre dem på minus 80 grader Celsius. Etter å ha probing dem via vestlig blot, tine og basseng fraksjonene som inneholder proteiner av interesse og kaste de andre. For å utføre rensetrinnet, reduser volumet av proteinoppløsningen ned til to milliliter ved hjelp av ultra sentrifugeringsfilterenheter.Filtrer oppløsningen sekvensielt med 0,45 mikrometer og 0,22 mikrometer sprøytefilterenheter for å fjerne eventuell mikroprecipitasjon. Likevekt størrelsesekskluderingskromatografikolonnen med ett kolonnevolum av løpende buffer som inneholder en millimolar dithiothreitol. Last prøven på kolonnen og kjør kromatografienheten til alle proteinene er eluted som beskrevet tidligere.Forbered 50 mikroliterprøver for SDS-PAGE og western blot analyse beskrevet tidligere. Vask kolonnen fortløpende med ett kolonnevolum av dobbelt destillert vann og ett kolonnevolum på 20% etanol i dobbelt destillert vann. Etter å ha utført vestlig blotanalyse, samle alle FAHD1 som inneholder brøker.Reduser volumet av proteinoppløsningen ned til to milliliter ved hjelp av ultra sentrifugeringsfilterenheter. Western blot screening viser tilstedeværelsen av svin FAHD1 i supernatant med et bånd på 25 kilodaltonn mens den taggede positive kontrollen kjører på 34 kilodaltonn. Svin fahd1 fra lysat ble renset av anionisk utveksling kromatografi og bindende proteiner ble fjernet ved elution.Fraksjoner som inneholder svin FAHD1 ble identifisert ved vestlig blotanalyse, samlet og konsentrert. Proteinprøver ble renset av SEC og identifisert ved vestlig blotanalyse. Utbyttet av svin FAHD1 protein var omtrent ett milligram med et 80% nivå av renhet.Vestlig blotanalyse oppdaget musen FAHD1 protein i gjennomstrømningen sammen med andre proteiner. Gjennomstrømningen ble anvendt for størrelseseksklusjonskromatografi. Brøker som inneholder FAHD1 ble gruppert, konsentrert og brukt på SDS-PAGE-analyse.Utbyttet av protein var imidlertid ikke veldig høyt. Den spesifikke enzymatiske aktiviteten til svinet FAHD1 øker med renhetsnivået ved å øke den relative mengden FAHD1 per totalt protein. Høyere konsentrasjoner av ammoniumsulfat forårsaker smileeffekten, som kan løses ved lavere spenning.Ytterligere protein ble funnet i lysat og supernatant ved 15% konsentrasjon. Ved høyere konsentrasjoner kan imidlertid prøver utløses og kan ikke påvises. Protokollen som presenteres her krever at proteinet er løsbart.Optimale forhold for nedbør og pH eller størrelsesjustering for kromatografi må testes og defineres. Studien av enzymatisk funksjon, undersøkelse av proteinstruktur og utvikling av antistoff støttes sterkt når protein ekstraheres fra vev i stedet for ekstrahert fra bakterier.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Regissert Protein Emballasje innen ytre membran Blemmer fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produksjon og rensing

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rensing av hepatocytter og sinusformet endotelceller fra musen leveren perfusjon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymatisk aktivitet og genuttrykk av koffein syntase fra anlegget celle suspensjoner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttrykk, Rask Protein Rensing Protokoller og Krystallisering av Wild Type og Mutant Former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Ganglioside utvinning, rensing og profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Ekstraksjon og visualisering av proteinaggregater etter behandling av Escherichia coli med en protetoksisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...