Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
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Os autores agradecem muito a assistência técnica de Ayse Öztürk e Eva Albertini. Os camundongos utilizados para a geração de tecido hepático foram mantidos sob a supervisão da Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituto de Pesquisa de Envelhecimento Biomédico da Universidade de Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Áustria).

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais. O rim suíno foi obtido fresco do supermercado local. Os tecidos hepáticos foram colhidos de camundongos do tipo selvagem C57BL6 mantidos no Instituto de Pesquisa de Envelhecimento Biomédico da Universidade de Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Áustria sob a supervisão da Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, coberto pela permissão ética como líder do projeto emitido em 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). A manutenção e o ...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. 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Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

Passos críticos no protocolo Seguir diretrizes comuns para o manuseio de proteínas é essencial, como trabalhar no gelo e em condições moderadas de pH e sal. O uso de inibidores de protease é benéfico para o método, enquanto o uso de inibidores proteasso é altamente recomendado. Congelar e descongelar a amostra pode sempre resultar em precipitação proteica (pelo menos parcialmente), por isso qualquer alíquota descongelada de lisato de proteína inicial (etapa 2) deve ser processada continua...

A proteína de domínio fah eucariótico 1 (FAHD1) atua como oxaloacetato bifuncional (OAA) decarboxylase (ODx)1 e hidrolase acylpyruvate (ApH)2. Está localizada nas mitocôndrias2 e pertence à ampla superfamília FAH de enzimas 1,2,3,4,5,6. Embora sua atividade de ApH seja apenas de menor relevância, a atividade ODx do FAHD1 está envolvida na regulação do fluxo de ciclo TCA 1,7,8,9. OAA não é apenas necessário para a reação de sinthase citrato central no ciclo do ácido tricarboxílico, mas também age como um inibidor competitivo de succinato desidrogenase como parte do sistema de transporte de elétrons e como metabólito catapleótico. A redução da expressão genética FAHD1 nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) resultou em uma redução significativa na taxa de proliferação celular10, e inibição significativa do potencial da membrana mitocondrial, associada a uma mudança concomitante para a glicólise. O modelo de trabalho refere-se à senescência associada à disfunção mitocondrial (MiDAS)11-like fenótipo8, onde os níveis mitocondrial de OAA são fortemente regulados pela atividade FAHD1 1,8,9.
A proteína recombinante é mais fácil de obter através da expressão e purificação de bactérias12 em vez de tecido. No entanto, uma proteína expressa em bactérias pode ser tendenciosa por possível falta de modificações pós-translacionais, ou pode ser simplesmente problemática (ou seja, devido à perda de plasmídeos, respostas de estresse bacteriano, ligações de dissulfeto distorcidas/não formadas, nenhuma ou má secreção, agregação de proteínas, decote protelítico, etc.). Para determinadas aplicações, a proteína precisa ser obtida a partir de lisesto celular ou tecido, a fim de incluir tais modificações e/ou excluir possíveis artefatos. A proteína purificada do tecido suporta o desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade e/ou inibidores farmacológicos potentes e específicos para enzimas selecionadas, como para FAHD113.
Este manuscrito apresenta uma série de métodos para a extração e purificação do FAHD1 a partir de fígado de rim suíno e rato. Os métodos descritos requerem cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), mas de outra forma usam equipamentos de laboratório comuns. Métodos alternativos podem ser encontrados em outros lugares 14,15,16,17. Após a extração total da proteína, o protocolo proposto envolve uma fase de teste, na qual são discutidos sub-protocolos para precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica (Figura 1). Após a definição desses subtítnicos, a proteína de interesse é extraída através de uma estratégia sequencial usando troca iônica e cromatografia de exclusão de tamanho com FPLC. Com base nessas diretrizes, o protocolo final pode ser adaptado individualmente para outras proteínas de interesse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> Figura 1: A estratégia global deste protocolo. De cima para baixo: A proteína é extraída de tecidos. A homogeneidade do tecido é preparada, centrifugada e filtrada. Para cada par de amostras supernascidas e derivadas de pelotas, os testes para precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica (FPLC) precisam ser realizados para sondar para condições ideais. Após a criação desses sub-protocolos, a proteína pode ser extraída através de um procedimento sequencial de precipitação de sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica e cromatografia de exclusão de tamanho repetitivo (FPLC) em diferentes concentrações de pH e sal. Todos os passos precisam ser controlados por mancha ocidental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

Fumarylacetoacetate hydrolase proteína contendo domínio 1 (FAHD1) é o primeiro membro identificado da superfamília FAH em eucariotes, agindo como oxaloacetate decarboxylase em mitocôndrias. Este artigo apresenta uma série de métodos para a extração e purificação do FAHD1 a partir de fígado de rim suíno e rato. Os métodos cobertos são cromatografia de troca iônica com cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), filtragem de gel preparatório e analítico com FPLC e abordagens proteômicas. Após a extração total da proteína, a precipitação de sulfato de amônio e a cromatografia de troca iônica foram exploradas, e o FAHD1 foi extraído através de uma estratégia sequencial usando troca iônica e cromatografia de exclusão de tamanho. Esta abordagem representativa pode ser adaptada a outras proteínas de interesse (expressas em níveis significativos) e modificada para outros tecidos. A proteína purificada do tecido pode apoiar o desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade e/ou potentes e específicos inibidores farmacológicos.

A proteína FAHD1 foi extraída do fígado de rim e camundongo suíno usando o protocolo apresentado. Para o tecido do rato, vários órgãos são necessários para obter vários μg após a etapa final de purificação. Por essa razão, este artigo se concentra na extração do FAHD1 dos rins suínos, que é um experimento muito mais exemplar. A extração de FAHD1 do fígado do camundongo é realizada para apresentar as dificuldades e possíveis armadilhas deste protocolo. É geralmente recomendado o uso de órgãos qu...

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Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Este protocolo descreve como extrair a proteína de domínio de hidrolase 1 (FAHD1) de rim suíno e fígado de camundongo. Os métodos listados podem ser adaptados a outras proteínas de interesse e modificados para outros tecidos.

Extração e Purificação da Proteína FAHD1 do fígado de rim suíno e rato

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

A purificação da proteína recombinante de bactérias é um método bem estabelecido. No entanto, vários problemas podem ocorrer ao usar essas técnicas. Ter métodos para extrair proteína do tecido é certamente atraente.A principal vantagem com este método é que se pode extrair a proteína em sua forma fisiológica, incluindo todos os efeitos mútuos que podem impactar sua atividade dobrável e catalítica. Esta abordagem pode ser adaptada a outras proteínas de interesse e modificada para outros tecidos. A proteína purificada do tecido pode apoiar o desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade e inibidores farmacológicos.Para começar, prepare o tampão de proteína lyse misturando 250 mililitros de PBS com flúor de sódio de 50 milimolar, um flúor de fenilmetilsulfonyl milimolar, dois microgramas por aprotinína mililitro e um ortovanadato ativado milimolar. Filtre a solução usando uma unidade de filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Prepare tubos com dois mililitros de tampão de lise por grama de tecido e coloque-os no gelo.Para preparar a amostra de tecido, disseque o tecido de cerca de 100 miligramas cada um em uma placa de vidro pré-limpa colocada no gelo em uma caixa de espuma de poliestireno. Transfira os pedaços de tecido para os tubos preparados para a lise subsequente. Para preparar uma solução de sulfato de amônio saturado, aqueça 500 mililitros de água dupla destilada a 70 graus Celsius.Durante a agitação, adicione gradualmente o sulfato de amônio em pó até que não haja mais sulfato de amônio. Esfrie esta solução saturada para a temperatura ambiente e armazene-a a quatro graus Celsius durante a noite. Para homogeneizar os tecidos renais suínos, sonicar a suspensão preferencialmente por uma sonda ultrassônica enquanto mantém a amostra no gelo.No caso dos tecidos hepáticos do rato, use um homogeneizador elétrico e lave-o regularmente em PBS para evitar entupimentos enquanto mantém as amostras no gelo. Tire 20 microlitros das amostras e verifique sob o microscópio se as células do tecido homogeneizado estão devidamente destruídas. Caso contrário, repita a homogeneização.Centrifugar os tubos a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Colete o supernatante em um tubo fresco e coloque-o no gelo. Posteriormente, filtre o supernascer utilizando unidades de filtro de seringa de 0,45 micrômetros e 0,22 micrômetros.Aliquot o supernasal em lotes de 10 mililitros e congele-os a menos 20 graus Celsius para armazenamento a curto prazo ou a menos 80 graus Celsius para armazenamento mais longo. Prepare uma amostra de 50 microliteres para análise de SDS-PAGE ou western blot adicionando 10 microliters de cinco vezes o buffer amostral SDS a 40 microliters do supernante e, em seguida, fervendo a 95 graus Celsius por 10 minutos. Prepare um gel SDS-PAGE de 12,5% de poliacrilamida de 12,5% de poliacrilamida de acordo com as instruções do fabricante.Para realizar a análise SDS-PAGE, carregue os poços do gel posteriormente com uma escada marcador de proteína, cinco nanogramas de proteína recombinante FAHD1 humana como controle positivo, 20 microlitrais da amostra a serem analisados e os demais poços com 20 microliters de tampão de amostra SDS-PAGE preparados. Execute os géis SDS-PAGE a 125 volts usando o buffer de execução SDS. Depois que o SDS-PAGE estiver completo, realize uma análise de manchas ocidentais, teste as membranas usando o anticorpo disponível levantado contra o FAHD1.Depois de preparar alíquotas supernasas como descrito anteriormente, processe após o descongelamento ou processe diretamente após a extração de proteínas sem congelar a amostra. Filtre a amostra usando uma unidade de filtro de 0,22 micrômetro para excluir possíveis precipitados após o descongelamento. Prepare seis tubos de 1,5 mililitro no gelo e transfira 250 microliters de amostra para cada tubo.Prepare uma série de diluição de sulfato de amônio nos tubos preparados e compor o volume final para 1.000 microliter com tampão de proteína. Incubar as amostras a quatro graus Celsius durante a noite em um rotador de tubo. Usando uma centrífuga de mesa, centrífuga a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius e transfira cuidadosamente todos os supernantes em tubos separados.O ar seque as pelotas resultantes e resuspenque cada uma delas em 1.000 microliter de água dupla destilada. Para cada par de pelotas resuspended e supernadante da etapa anterior, misture 40 microliters com 10 microliters de cinco vezes o tampão amostral SDS e ferva a 95 graus Celsius com tampas abertas até que a maior parte do líquido tenha vaporizado. Em seguida, resuspengue a pelota em uma mistura de 50% de sulfóxido de dimetil em água dupla destilada.Execute o SDS-PAGE carregando as amostras derivadas das pelotas resuspended e sobrenantes em pares, seguido por uma análise de manchas ocidentais. No entanto, execute os géis a 80 volts por três horas. Configure o sistema FPLC com a coluna de troca aniônica ou cônica.Lave a coluna com cinco volumes de coluna de 20% de etanol em água dupla destilada, seguida por cinco volumes de coluna de água dupla destilada. Aplique a amostra na coluna por injeção ou usando uma bomba de amostra e colete o fluxo através. Lave a coluna com um volume de coluna do tampão de sal baixo.Configure uma elução linear de gradiente de tampão de sal 100% baixo para tampão de sal 100% alto dentro de três volumes de coluna. Colete continuamente uma fração mililitro. Após o gradiente ter terminado, continue a funcionar com um tampão de sal alto até que não sejam detectados mais picos associados à proteína no cromatografia ao longo da faixa de um volume de coluna.Aplique um mililitro de 25% SDS dissolvido em hidróxido de sódio molar de 0,5 e água dupla destilada para limpar a coluna. Lave consecutivamente a coluna com três volumes de coluna de água dupla destilada e três volumes de coluna de 20% de etanol em água dupla destilada. Colete as amostras de SDS-PAGE de todas as frações de pico e o fluxo.Esperje as frações coletadas em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Depois de sondar-os via mancha ocidental, descongelar e juntar as frações contendo as proteínas de interesse e descartar as outras. Para realizar a etapa de purificação, reduza o volume da solução proteica para dois mililitros usando unidades de filtro de ultra centrifugação.Filtrar sequencialmente a solução com unidades de filtro de seringa de 0,45 micrômetros e 0,22 micrômetros para remover qualquer microprecipitação. Equilibre a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com um volume de coluna de tampão de execução contendo um dithiothreitol milimolar. Coloque a amostra na coluna e execute a unidade de cromatografia até que todas as proteínas sejam elucidadas como descrito anteriormente.Prepare 50 amostras de microliter para análise de SDS-PAGE e western blot descritas anteriormente. Lavar consecutivamente a coluna com uma coluna de volume duplo de água destilada e um volume de coluna de 20% de etanol em água dupla destilada. Depois de realizar a análise de manchas ocidentais, acumule todas as FRAções fahd1 contendo frações.Reduza o volume da solução proteica para dois mililitros usando unidades de filtro de ultra centrifugação. A exibição de manchas ocidentais mostra a presença de fahd1 suíno no supernante com uma banda a 25 kilodaltons, enquanto o controle positivo marcado é executado em 34 kilodaltons. O fahd1 suíno do lysate foi purificado pela cromatografia de troca aniônica e as proteínas de ligação foram removidas por eluição.Frações contendo FAHD1 suínos foram identificadas pela análise de manchas ocidentais, agrupadas e concentradas. As amostras de proteína foram purificadas pela SEC e identificadas pela análise de manchas ocidentais. O rendimento da proteína fahd1 suína foi de cerca de um miligrama com um nível de 80% de pureza.A análise da mancha ocidental detectou a proteína FAHD1 do camundongo no fluxo, juntamente com outras proteínas. O fluxo foi aplicado para a cromatografia de exclusão de tamanho. As frações contendo FAHD1 foram agrupadas, concentradas e aplicadas à análise SDS-PAGE.No entanto, o rendimento da proteína não foi muito alto. A atividade enzimática específica do fahd1 suíno aumenta com o nível de pureza ao aumentar a quantidade relativa de FAHD1 por proteína total. Maiores concentrações de sulfato de amônio causam o efeito sorriso, que pode ser resolvido na menor tensão.Mais proteínas foram encontradas no liseto e sobrenasce na concentração de 15%. No entanto, em concentrações mais elevadas, as amostras podem precipitar-se e não podem ser detectadas. O protocolo aqui apresentado requer que a proteína seja solucionável.As condições ideais para precipitação e pH ou ajuste de tamanho para cromatografia precisam ser testadas e definidas. O estudo da função enzimática, a investigação da estrutura proteica e o desenvolvimento de anticorpos são muito apoiados quando se tem proteína extraída do tecido em vez de extraída de bactérias.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bioquímica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificação de proteínas anaeróbica e análise cinética através do eletrodo de oxigênio para estudar a inibição e atividade dioxigenase DesB

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Extração de ganglioside, purificação e perfil

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extração e Visualização de Agregados proteicos após tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...