Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Авторы очень благодарны за техническую помощь Айсе Озтюрк и Еве Альбертини. Мыши, используемые для генерации ткани печени, содержались под наблюдением Univ.-Doz. Д-р Пиддер Янсен-Дюрр (Институт биомедицинских исследований старения при Инсбрукском университете, Реннвег 10, 6020 Инсбрук, Австрия).

Все эксперименты проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами. Почки свиней были получены свежими из местного супермаркета. Ткани печени были собраны у мышей дикого типа C57BL6, поддерживаемых в Институте биомедицинских исследований старения при Университет...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).</li><li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor.">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis.">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype.">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization,+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins.">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification.">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).</li><li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins:+Between+meaning+and+different+methods).">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li><li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes.">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(SDS-PAGE).">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li><li>. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011)</li><li>S&#248;rensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

Критические шаги в протоколе Соблюдение общих рекомендаций по обращению с белками имеет важное значение, например, работа на льду и в умеренных условиях pH и соли. Применение ингибиторов протеазы выгодно для метода, в то время как использование ингибиторов протеасом настояте...

Эукариотический домен FAH-содержащий белок 1 (FAHD1) действует как бифункциональная оксалоацетат (OAA), декарбоксилаза (ODx)1 и ацилпируватгидролаза (ApH)2. Он локализован в митохондриях2 и принадлежит к широкому надсемейству ферментовFAH 1,2,3,4,5,6. В то время как его активность ApH имеет лишь незначительное значение, активность ODx FAHD1 участвует в регулировании потока цикла TCA 1,7,8,9. OAA не только необходим для реакции центральной цитратсинтазы в цикле трикарбоновой кислоты, но также действует как конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы как часть системы переноса электронов и как катаплеротический метаболит. Снижение регуляции экспрессии гена FAHD1 в эндотелиальных клетках пупочных вен человека (HUVEC) привело к значительному снижению скорости пролиферации клеток10 и значительному ингибированию потенциала митохондриальной мембраны, связанного с сопутствующим переходом на гликолиз. Рабочая модель относится к митохондриальной дисфункции, связанной со старением (MiDAS)11-подобным фенотипом8, где уровни митохондриального OAA жестко регулируются активностью FAHD1 1,8,9.
Рекомбинантный белок легче получить путем экспрессии и очистки от бактерий12 , а не от ткани. Однако белок, экспрессируемый в бактериях, может быть смещен из-за возможного отсутствия посттрансляционных модификаций или может быть просто проблематичным (т. Е. Из-за потери плазмид, реакций бактериального стресса, искаженных / несформированных дисульфидных связей, отсутствия или плохой секреции, агрегации белка, протеолитического расщепления и т. Д.). Для определенных применений белок должен быть получен из клеточного лизата или ткани, чтобы включить такие модификации и/или исключить возможные артефакты. Очищенный белок из ткани поддерживает выработку высококачественных антител и/или мощных и специфических фармакологических ингибиторов для выбранных ферментов, таких как FAHD113.
В данной рукописи представлен ряд методов извлечения и очистки FAHD1 из печени свиной почки и мыши. Описанные методы требуют быстрой белковой жидкостной хроматографии (ФПЛК), но в остальном используют общее лабораторное оборудование. Альтернативные методы можно найти в других местах 14,15,16,17. После полной экстракции белка предлагаемый протокол включает в себя фазу тестирования, на которой обсуждаются подпротоколы для осаждения сульфата аммония и хроматографии ионного обмена (рисунок 1). После определения этих подпротоколов интересующий белок извлекается с помощью последовательной стратегии с использованием ионного обмена и размерно-эксклюзионной хроматографии с FPLC. Основываясь на этих руководящих принципах, окончательный протокол может быть адаптирован индивидуально для других белков, представляющих интерес.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> Рисунок 1: Общая стратегия этого протокола. Сверху донизу: Белок извлекается из тканей. Тканевый гомогенат готовят, центрифугируют и фильтруют. Для каждой пары образцов, полученных из супернатанта и гранул, необходимо провести испытания на осаждение сульфата аммония и ионно-обменную хроматографию (FPLC) для определения оптимальных условий. После установления этих подпротоколов белок может быть извлечен с помощью последовательной процедуры осаждения сульфата аммония, хроматографии ионнообменной хроматографии и повторяющейся хроматографии с исключением размера (FPLC) при различных концентрациях рН и солей. Все шаги должны контролироваться западным пятном. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

Фумарилацетоацетат гидролаза, содержащий домен белка 1 (FAHD1), является первым идентифицированным членом надсемейства FAH у эукариот, действующим как оксалоацетатдекарбоксилаза в митохондриях. В данной статье представлен ряд методов экстракции и очистки FAHD1 из почек свиней и печени мышей. Охватываемыми методами являются ионообменная хроматография с быстрой белковой жидкостной хроматографией (FPLC), препаративная и аналитическая гелевая фильтрация с FPLC и протеомные подходы. После полной экстракции белка были исследованы осаждение сульфата аммония и хроматография ионного обмена, а FAHD1 экстрагировали с помощью последовательной стратегии с использованием ионного обмена и размерно-эксклюзионной хроматографии. Этот репрезентативный подход может быть адаптирован к другим белкам, представляющим интерес (выраженным на значительных уровнях) и модифицирован для других тканей. Очищенный белок из ткани может поддерживать выработку высококачественных антител и/или мощных и специфических фармакологических ингибиторов.

Белок FAHD1 экстрагировали из почек свиней и печени мыши с использованием представленного протокола. Для тканей мышей требуется несколько органов, чтобы получить несколько мкг после окончательной стадии очистки. По этой причине в данной статье основное внимание уделяется извлечению FAHD1...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Этот протокол описывает, как извлечь фумарилацетоацетат гидролазу, содержащий домен белка 1 (FAHD1), из почек свиней и печени мыши. Перечисленные способы могут быть адаптированы к другим белкам, представляющим интерес, и модифицированы для других тканей.

Экстракция и очистка белка FAHD1 из печени свиной почки и мыши

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Очистка рекомбинантного белка от бактерий является хорошо зарекомендовавшим себя методом. Однако при использовании этих методов может возникнуть несколько проблем. Наличие методов извлечения белка из ткани, безусловно, привлекательно.Основным преимуществом этого метода является то, что можно извлечь белок в его физиологической форме, включая все взаимные эффекты, которые могут повлиять на его складчатую и каталитическую активность. Этот подход может быть адаптирован к другим белкам, представляющим интерес, и модифицирован для других тканей. Очищенный белок из ткани может поддерживать выработку высококачественных антител и фармакологических ингибиторов.Для начала подготовьте буфер лизиса белка, смешав 250 миллилитров PBS с 50 миллимолярами фторида натрия, одним миллимолярным фенилметилсульфонилфторидом, двумя микрограммами на миллилитр апротинина и одним миллимолярным активированным ортованадатом. Отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра длиной 0,22 микрометра. Подготовьте пробирки с двумя миллилитрами буфера лизиса на грамм ткани и поместите их на лед.Чтобы подготовить образец ткани, рассекните ткань примерно по 100 миллиграммов каждая на предварительно очищенной стеклянной пластине, помещенной на лед в коробке из пенополистирола. Переложите кусочки ткани в подготовленные пробирки для последующего лизиса. Для приготовления насыщенного раствора сульфата аммония нагревают 500 миллилитров двойной дистиллированной воды до 70 градусов Цельсия.Во время перемешивания постепенно добавляйте порошок сульфата аммония до тех пор, пока не растворится сульфат аммония. Охладите этот насыщенный раствор до комнатной температуры и храните его при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Чтобы гомогенизировать ткани почек свиней, обжайте суспензию ультразвуком, предпочтительно ультразвуковым зондом, сохраняя образец на льду.В случае тканей печени мышей используйте электрический гомогенизатор и регулярно мойте его в PBS, чтобы предотвратить засорение при сохранении образцов на льду. Возьмите 20 микролитров из образцов и проверьте под микроскопом, правильно ли разрушены клетки гомогенизированной ткани. В противном случае повторите гомогенизацию.Центрифугируйте трубки в 10 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант в свежую трубку и поместите его на лед. Впоследствии фильтруйте супернатант с помощью 0,45-микрометрового и 0,22-микрометрового шприцевых фильтрующих блоков.Аликвоцитируйте супернатант в партии по 10 миллилитров и замораживайте их при минус 20 градусах Цельсия для кратковременного хранения или при минус 80 градусах Цельсия для более длительного хранения. Подготовьте 50-микролитровый образец для анализа SDS-PAGE или western blot, добавив 10 микролитров в пять раз больше буфера образца SDS к 40 микролитрам супернатанта, а затем кипятя при 95 градусах Цельсия в течение 10 минут. Приготовьте прерывистый 12,5% полиакриламидный гель SDS-PAGE в соответствии с инструкциями производителя.Для выполнения анализа SDS-PAGE загрузите скважины геля впоследствии белковой маркерной лестницей, пятью нанограммами человеческого рекомбинантного белка FAHD1 в качестве положительного контроля, 20 микролитрами образца, подлежащего анализу, и оставшимися скважинами с 20 микролитрами подготовленного буфера образца SDS-PAGE. Запускайте гели SDS-PAGE со скоростью 125 В, используя работающий буфер SDS. После того, как SDS-PAGE будет завершен, выполните анализ вестерн-блоттинга, исследуйте мембраны, используя доступное антитело, поднятое против FAHD1.После получения супернатантных аликвот, как описано ранее, либо обрабатывают после оттаивания, либо обрабатывают непосредственно после экстракции белка без замораживания образца. Отфильтруйте образец с помощью фильтрующего блока размером 0,22 микрометра, чтобы исключить возможные осадки после оттаивания. Подготовьте шесть 1,5 миллилитровых пробирок на льду, затем переложите 250 микролитров образца в каждую пробирку.Готовят серию разведения сульфата аммония в подготовленных пробирках и составляют конечный объем до 1000 микролитров с буфером лизиса белка. Инкубируйте образцы при четырех градусах Цельсия в течение ночи на трубчатом ротаторе. Используя настольную центрифугу, центрифугу в 10 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и аккуратно переложите все супернатанты в отдельные трубки.Высушите полученные гранулы на воздухе и повторно суспендируйте каждую из них в 1000 микролитрах двойной дистиллированной воды. Для каждой пары повторно суспендированных гранул и супернатанта с предыдущего этапа смешайте 40 микролитров с 10 микролитрами, в пять раз превышающими буфер образца SDS, и кипятите при 95 градусах Цельсия с открытыми крышками, пока большая часть жидкости не испарится. Затем повторно суспендируют гранулу в смеси 50%-диметилсульфоксида в двойной дистиллированной воде.Выполните SDS-PAGE, загрузив образцы, полученные из повторно суспендированных гранул и супернатанта парами, с последующим анализом вестерн-блоттинга. Тем не менее, запускайте гели при 80 вольтах в течение трех часов. Настройте систему FPLC с анионной или катионной обменной колонкой.Промыть колонну с пятью колоннами объемов 20% этанола в двойной дистиллированной воде, а затем пять колонн объемов двойной дистиллированной воды. Нанесите образец на колонну либо путем впрыска, либо с помощью насоса для отбора проб и соберите поток. Вымойте колонну одним объемом колонны низкосолевого буфера.Настройте линейное градиентное элюирование от 100% низкосолевого буфера до 100%-го солевого буфера в трех колонных объемах. Непрерывно собирать одну миллилитровую фракцию. После завершения градиента продолжайте работать с буфером с высоким содержанием соли до тех пор, пока в хроматограмме больше не будут обнаружены связанные с белком пики в диапазоне объема в одну колонку.Нанесите один миллилитр 25% SDS, растворенный в 0,5 молярном гидроксиде натрия, и двойную дистиллированную воду для очистки колонны. Последовательно промывайте колонну с тремя колоннами объемов двойной дистиллированной воды и тремя колоннами объемов 20% этанола в двойной дистиллированной воде. Соберите образцы SDS-PAGE всех пиковых фракций и сквозного потока.Заморозьте собранные фракции в жидком азоте и храните их при минус 80 градусах Цельсия. После их зондирования с помощью вестерн-блоттинга, разморозьте и объедините фракции, содержащие интересующие белки, и выбросьте остальные. Для выполнения стадии очистки уменьшите объем белкового раствора до двух миллилитров с помощью ультрацентрифугирующих фильтрующих установок.Последовательно фильтруйте раствор с помощью 0,45 микрометра и 0,22 микрометра шприцевых фильтрующих блоков для удаления любых микропреципитаций. Уравновешивают размер исключающей хроматографической колонки с одним столбцом объема работающего буфера, содержащего один миллимолярный дитиотрейтол. Загрузите образец на колонку и запустите блок хроматографии до тех пор, пока все белки не будут элюированы, как описано ранее.Подготовьте 50 микролитровых образцов для анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга, описанного выше. Последовательно промывайте колонну с одним столбом объема двойной дистиллированной воды и одной колонкой объемом 20% этанола в двойной дистиллированной воде. После выполнения анализа вестерн-блотта объедините все фракции, содержащие FAHD1.Уменьшите объем белкового раствора до двух миллилитров с помощью ультрацентрифугирующих фильтрующих устройств. Скрининг вестерн-блот показывает присутствие свиней FAHD1 в супернатанте с полосой в 25 килодалтонах, в то время как помеченный положительный контроль работает на 34 килодалтонах. Свиней FAHD1 из лизата очищали с помощью анионнообменной хроматографии, а связывающие белки удаляли элюированием.Фракции, содержащие свиней FAHD1, были идентифицированы путем анализа вестерн-блоттинга, объединены и концентрированы. Образцы белка были очищены SEC и идентифицированы с помощью анализа вестерн-блоттинга. Выход свиного белка FAHD1 составил около одного миллиграмма с уровнем чистоты 80%.Анализ вестерн-блоттинга обнаружил мышиный белок FAHD1 в потоке вместе с другими белками. Проточная была применена для размерной эксклюзионной хроматографии. Фракции, содержащие FAHD1, были объединены, сконцентрированы и применены к анализу SDS-PAGE.Однако выход белка был не очень высоким. Специфическая ферментативная активность свиней FAHD1 увеличивается с уровнем чистоты при увеличении относительного количества FAHD1 на общий белок. Более высокие концентрации сульфата аммония вызывают эффект улыбки, который может быть разрешен при более низком напряжении.Далее белок был обнаружен в лизате и супернатанте в концентрации 15%. Однако при более высоких концентрациях образцы могут выпадать в осадок и не могут быть обнаружены. Протокол, представленный здесь, требует, чтобы белок был разрешимым.Оптимальные условия для осадков и pH или корректировки размера для хроматографии должны быть проверены и определены. Изучение ферментативной функции, исследование структуры белка и развитие антител в значительной степени поддерживаются при извлечении белка из ткани, а не из бактерий.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;: Проектирование, производство и очистка

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Очистка гепатоцитов и синусоидальных эндотелиальных клеток от мыши печени перфузии

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Экстракции кофеина, ферментативной активности и экспрессии генов синтетазы кофеин из суспензий клеток растений

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

ПЦР-мутагенез, клонирование, экспрессия, протоколы быстрой очистки белка и кристаллизация дикого типа и мутантных форм триптофанссинтазы

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Экстракция, очистка и профилирование ганглиозидов

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...