Name: extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Författarna är mycket tacksamma för den tekniska hjälpen av Ayse Öztürk och Eva Albertini. Möss som användes för generering av levervävnad upprätthölls under överinseende av Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institutet för biomedicinsk åldrandeforskning vid Innsbruck universitet, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Österrike).

Alla experiment utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer. Svinnjure erhölls färsk från den lokala stormarknaden. Levervävnader skördades från C57BL6 vildtypsmöss som underhålls vid Institutet för biomedicinsk åldrandeforskning vid Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Österrike under överinseende av Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, omfattas av etiskt tillstånd som projektledare utfärdat 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Underhåll och användning av mössen för projektet omfatta...

<ol>
	<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+(FAHD1)+as+oxaloacetate+decarboxylase.">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+(FAHD1)+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase.">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li><li>Kang, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development.">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li><li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence,+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies.">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li><li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase.">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).</li><li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor.">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1.">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li><li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence.">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis.">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).</li><li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-D&#252;rr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells.">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li><li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype.">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+crystallization,+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins.">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).</li><li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+(FAHD1).">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009 (2021).</li><li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8.">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification.">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).</li><li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins:+Between+meaning+and+different+methods).">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li><li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes.">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(SDS-PAGE).">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li><li>. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011)</li><li>S&#248;rensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li><li>. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022)</li><li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli:+advances+and+challenges.">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).</li><li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli:+A+5-year+update.">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li></ol>

Kritiska steg i protokollet Att följa gemensamma riktlinjer för hantering av proteiner är viktigt, till exempel att arbeta på is och vid måttliga pH- och saltförhållanden. Användningen av proteashämmare är fördelaktig för metoden, medan användningen av proteasomhämmare rekommenderas starkt. Frysning och upptining av provet kan alltid leda till proteinutfällning (åtminstone delvis), så all upptinad alikvot av initialt proteinlysat (steg 2) bör bearbetas kontinuerligt utan avbrott. Cen...

Det eukaryota FAH-domäninnehållande proteinet 1 (FAHD1) fungerar som bifunktionellt oxaloacetat (OAA) dekarboxylas (ODx)1 och acylpyruvathydrolas (ApH)2. Det är lokaliserat i mitokondrier2 och tillhör den breda FAH-superfamiljen av enzymer 1,2,3,4,5,6. Medan dess ApH-aktivitet endast är av mindre relevans, är ODx-aktiviteten hos FAHD1 involverad i regleringen av TCA-cykelflödet 1,7,8,9. OAA krävs inte bara för den centrala citratsyntasreaktionen i trikarboxylsyracykeln utan fungerar också som en konkurrerande hämmare av succinatdehydrogenas som en del av elektrontransportsystemet och som en kataklerotisk metabolit. Nedreglering av FAHD1-genuttryck i humana navelvenendotelceller (HUVEC) resulterade i en signifikant minskning av cellproliferationshastigheten10 och signifikant hämning av mitokondriell membranpotential, associerad med en samtidig övergång till glykolys. Arbetsmodellen avser mitokondriell dysfunktion associerad senescens (MiDAS)11-liknande fenotyp8, där mitokondriella OAA-nivåer regleras hårt av FAHD1-aktivitet 1,8,9.
Rekombinant protein är lättare att få via uttryck och rening från bakterier12 snarare än från vävnad. Ett protein som uttrycks i bakterier kan emellertid vara partiskt av eventuell brist på post-translationella modifieringar, eller kan helt enkelt vara problematiskt (dvs. på grund av plasmidförlust, bakteriella stressreaktioner, förvrängda / oformade disulfidbindningar, ingen eller dålig utsöndring, proteinaggregering, proteolytisk klyvning etc.). För vissa tillämpningar måste protein erhållas från celllysat eller vävnad för att inkludera sådana modifieringar och/eller utesluta eventuella artefakter. Renat protein från vävnad stödjer utvecklingen av högkvalitativa antikroppar och/eller potenta och specifika farmakologiska hämmare för utvalda enzymer, såsom för FAHD113.
Detta manuskript presenterar en serie metoder för extraktion och rening av FAHD1 från svinnjure och muslever. De beskrivna metoderna kräver snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) men använder i övrigt vanlig laboratorieutrustning. Alternativa metoder kan hittas någon annanstans 14,15,16,17. Efter total proteinextraktion innefattar det föreslagna protokollet en testfas, där underprotokoll för ammoniumsulfatutfällning och jonutbyteskromatografi diskuteras (Figur 1). Efter att ha definierat dessa underprotokoll extraheras proteinet av intresse via en sekventiell strategi med hjälp av jonutbyte och storleksuteslutningskromatografi med FPLC. Baserat på dessa riktlinjer kan det slutliga protokollet anpassas individuellt för andra proteiner av intresse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> Figur 1: Den övergripande strategin för detta protokoll. Från topp till botten: Protein extraheras från vävnader. Vävnadshomogenat framställs, centrifugeras och filtreras. För varje par supernatanta och pellet-härledda prover, tester för ammoniumsulfat utfällning och jonisk utbyte kromatografi (FPLC) måste utföras för att sondera för optimala förhållanden. Efter upprättandet av dessa underprotokoll kan proteinet extraheras via ett sekventiellt förfarande för ammoniumsulfatutfällning, jonbyteskromatografi och repetitiv storleksuteslutningskromatografi (FPLC) vid varierande pH- och saltkoncentrationer. Alla steg måste kontrolleras av western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Millex-HP, 0.22 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter units</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHP033NS</td>
			<td>Millex-HP, 0.45 &#181;m, PES 33 mm, not steril</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>centrifugal tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well UV Microplate</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>8404</td>
			<td>UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1610147</td>
			<td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>-</td>
			<td>using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the &#34;&#196;KTA pure&#34; system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A4418</td>
			<td>ammonium sulphate for molecular biology, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>215589</td>
			<td>Catalyst for acrylamide gel polymerization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1125530025</td>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>D9277</td>
			<td>Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendof tubes 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1042</td>
			<td>microcentrifugal tubes; autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>28989334</td>
			<td>HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1620177</td>
			<td>PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703930</td>
			<td>Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516701</td>
			<td>Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono S 10/100 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td>
			<td>17516901</td>
			<td>Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>26616</td>
			<td>A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>23225</td>
			<td>A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td>
			<td>Branson</td>
			<td>-</td>
			<td>New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>P0399</td>
			<td>The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>T9281</td>
			<td>TEMED (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Roller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0003725000</td>
			<td>New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of fahd1 protein from swine kidney and mouse liver

Fumarylacetoacetathydrolasdomäninnehållande protein 1 (FAHD1) är den första identifierade medlemmen av FAH-superfamiljen i eukaryoter, som fungerar som oxaloacetatdekarboxylas i mitokondrier. Denna artikel presenterar en serie metoder för extraktion och rening av FAHD1 från svinnjure och muslever. Omfattade metoder är jonutbyteskromatografi med snabb proteinvätskekromatografi (FPLC), preparativ och analytisk gelfiltrering med FPLC och proteomiska tillvägagångssätt. Efter total proteinutvinning undersöktes ammoniumsulfatutfällning och jonutbyteskromatografi, och FAHD1 extraherades via en sekventiell strategi med jonutbyte och storleksuteslutningskromatografi. Detta representativa tillvägagångssätt kan anpassas till andra proteiner av intresse (uttryckt på signifikanta nivåer) och modifieras för andra vävnader. Renat protein från vävnad kan stödja utvecklingen av högkvalitativa antikroppar och/eller potenta och specifika farmakologiska hämmare.

FAHD1-protein extraherades från svinnjure och muslever med hjälp av det presenterade protokollet. För musvävnad krävs flera organ för att erhålla flera μg efter det slutliga reningssteget. Av denna anledning fokuserar denna artikel på utvinning av FAHD1 från svinnjurar, vilket är ett mycket mer exemplifierande experiment. Extraktionen av FAHD1 från muslevern utförs för att presentera svårigheterna och möjliga fallgropar i detta protokoll. Det rekommenderas generellt att använda organ som visar en hög ut...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver at JoVE.com

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Detta protokoll beskriver hur man extraherar fumarylacetoacetathydrolasdomäninnehållande protein 1 (FAHD1) från svinnjure och muslever. De förtecknade metoderna kan anpassas till andra proteiner av intresse och modifieras för andra vävnader.

Extraktion och rening av FAHD1-protein från svinnjure och muslever

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Rening av rekombinant protein från bakterier är en väletablerad metod. Flera problem kan dock uppstå vid användning av dessa tekniker. Att ha metoder för att extrahera protein från vävnad är säkert tilltalande.Den största fördelen med denna metod är att man kan extrahera proteinet i sin fysiologiska form inklusive alla ömsesidiga effekter som kan påverka dess vikning och katalytiska aktivitet. Detta tillvägagångssätt kan anpassas till andra proteiner av intresse och modifieras för annan vävnad. Renat protein från vävnad kan stödja utvecklingen av högkvalitativa antikroppar och farmakologiska hämmare.Börja med att förbereda proteinlysbuffert genom att blanda 250 ml PBS med 50 millimolär natriumfluorid, en millimolär fenylmetylsulfonylfluorid, två mikrogram per milliliter aprotinin och ett millimolärt aktiverat ortovanadat. Filtrera lösningen med en 0,22 mikrometer sprutfilterenhet. Förbered rör med två milliliter lysbuffert per gram vävnad och placera dem på is.För att förbereda vävnadsprovet, dissekera vävnaden på cirka 100 milligram vardera på en förrenad glasplatta placerad på is i en polystyrenskumlåda. Överför vävnadsbitarna till de beredda rören för efterföljande lys. För att framställa en mättad ammoniumsulfatlösning, värm 500 ml dubbeldestillerat vatten till 70 grader Celsius.Under omrörning, tillsätt gradvis ammoniumsulfatpulver tills inget mer ammoniumsulfat är upplöst. Kyl denna mättade lösning till rumstemperatur och förvara den vid fyra grader Celsius över natten. För att homogenisera svinnjurvävnaderna, sonicate suspensionen helst av en ultraljudssond samtidigt som provet hålls på is.När det gäller muslevervävnader, använd en elektrisk homogenisator och tvätta den regelbundet i PBS för att förhindra igensättning samtidigt som proverna hålls på is. Ta 20 mikroliter ur proverna och kontrollera under mikroskopet om cellerna i den homogeniserade vävnaden förstörs ordentligt. Annars upprepar du homogeniseringen.Centrifugera rören vid 10 000 gånger G i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Samla supernatanten i ett nytt rör och lägg den på is. Filtrera därefter supernatanten med 0,45 mikrometer och 0,22 mikrometer sprutfilterenheter.Alicitera supernatanten i 10 ml satser och frys dem vid minus 20 grader Celsius för kortvarig lagring eller vid minus 80 grader Celsius för längre lagring. Förbered ett 50 mikroliter prov för SDS-PAGE eller Western blot analys genom att tillsätta 10 mikroliter av fem gånger SDS-provbufferten till 40 mikroliter av supernatanten och koka sedan vid 95 grader Celsius i 10 minuter. Förbered en diskontinuerlig 12,5% polyakrylamid SDS-PAGE-gel enligt tillverkarens instruktioner.För att utföra SDS-PAGE-analys, ladda gelens brunnar därefter med en proteinmarkörstege, fem nanogram humant FAHD1-rekombinant protein som en positiv kontroll, 20 mikroliter av provet som ska analyseras och de återstående brunnarna med 20 mikroliter beredd SDS-PAGE-provbuffert. Kör SDS-PAGE-gelerna vid 125 volt med SDS-löpbufferten. När SDS-PAGE är klar, utför en Western blot-analys, sond membranen med hjälp av den tillgängliga antikroppen som höjs mot FAHD1.Efter beredning av supernatanta alikvoter som beskrivits tidigare, antingen bearbeta efter upptining eller bearbeta direkt efter proteinextraktion utan att frysa provet. Filtrera provet med en 0,22 mikrometer filterenhet för att utesluta eventuella utfällningar efter upptining. Förbered sex 1,5 ml rör på is och överför sedan 250 mikroliter prov till varje rör.Förbered en utspädningsserie av ammoniumsulfat i de beredda rören och fyll den slutliga volymen till 1000 mikroliter med proteinlysbuffert. Inkubera proverna vid fyra grader Celsius över natten på en rörrotator. Använd en bordscentrifug, centrifug vid 10 000 gånger G i 30 minuter vid fyra grader Celsius och försiktigt överför alla supernatanter till separata rör.Lufttorka de resulterande pelletsna och resuspendera var och en av dem i 1000 mikroliter dubbeldestillerat vatten. För varje par resuspenderade pellets och supernatant från föregående steg, blanda 40 mikroliter med 10 mikroliter av fem gånger SDS-provbufferten och koka vid 95 grader Celsius med öppna lock tills det mesta av vätskan har förångats. Resuspendera sedan pelletsen i en blandning av 50% dimetylsulfoxid i dubbeldestillerat vatten.Utför SDS-PAGE genom att ladda proverna härledda från de resuspenderade pelletsna och supernatanten i par, följt av en Western blot-analys. Kör dock gelerna vid 80 volt i tre timmar. Ställ in FPLC-systemet med kolumnen anjonisk eller katjonisk utbyte.Tvätta kolonnen med fem kolonnvolymer av 20% etanol i dubbelt destillerat vatten, följt av fem kolonnvolymer dubbeldestillerat vatten. Applicera provet på kolonnen antingen genom injektion eller med hjälp av en provpump och samla in genomströmningen. Tvätta kolonnen med en kolonnvolym av den låga saltbufferten.Ställ in en linjär gradienteluering från 100% låg saltbuffert till 100% hög saltbuffert inom tre kolumnvolymer. Samla kontinuerligt en milliliter fraktioner. När gradienten är klar fortsätter du att köra med en hög saltbuffert tills inga fler proteinassocierade toppar detekteras i kromatogrammet över intervallet för en kolonnvolym.Applicera en milliliter 25% SDS upplöst i 0,5 molär natriumhydroxid och dubbeldestillerat vatten för att rengöra kolonnen. Tvätta kolonnen i följd med tre kolonnvolymer dubbeldestillerat vatten och tre kolonnvolymer på 20% etanol i dubbelt destillerat vatten. Samla in SDS-PAGE-proverna av alla toppfraktioner och genomströmningen.Snäpp frys de uppsamlade fraktionerna i flytande kväve och förvara dem vid minus 80 grader Celsius. Efter att ha sonderat dem via Western blot, tina och slå samman fraktionerna som innehåller proteinerna av intresse och kassera de andra. För att utföra reningssteget, minska volymen av proteinlösningen ner till två milliliter med hjälp av ultracentrifugeringsfilterenheter.Filtrera lösningen sekventiellt med 0,45 mikrometer och 0,22 mikrometer sprutfilterenheter för att avlägsna eventuell mikroutfällning. Jämvikt mellan storleksuteslutningskromatografikolonnen med en kolonnvolym löpande buffert som innehåller en millimolär dithiothreitol. Ladda provet på kolonnen och kör kromatografienheten tills alla proteiner är eluerade som beskrivits tidigare.Förbered 50 mikroliterprover för SDS-PAGE och Western blot-analys som beskrivits tidigare. Tvätta kolonnen i följd med en kolonnvolym dubbeldestillerat vatten och en kolonnvolym på 20% etanol i dubbelt destillerat vatten. Efter att ha utfört Western blot-analys, poola alla FAHD1 som innehåller fraktioner.Minska volymen av proteinlösningen ner till två milliliter med hjälp av ultracentrifugeringsfilterenheter. Western blot screening visar närvaron av svin FAHD1 i supernatanten med ett band vid 25 kilodalton medan den märkta positiva kontrollen går vid 34 kilodalton. Svinet FAHD1 från lysat renades genom anjonisk utbyteskromatografi och bindningsproteinerna avlägsnades genom eluering.Fraktioner innehållande svin FAHD1 identifierades genom Western blot-analys, poolade och koncentrerade. Proteinprover renades av SEC och identifierades genom Western blot-analys. Utbytet av svin FAHD1-protein var cirka ett milligram med en renhetshalt på 80%.Western blot-analys detekterade musen FAHD1-proteinet i genomströmningen tillsammans med andra proteiner. Genomströmningen tillämpades för storleksuteslutningskromatografi. Fraktioner innehållande FAHD1 poolades, koncentrerades och applicerades på SDS-PAGE-analys.Utbytet av protein var emellertid inte särskilt högt. Den specifika enzymatiska aktiviteten hos svinet FAHD1 ökar med renhetsgraden vid ökning av den relativa mängden FAHD1 per totalt protein. Högre koncentrationer av ammoniumsulfat orsakar leendeeffekten, som kan lösas vid lägre spänning.Ytterligare protein hittades i lysatet och supernatanten vid 15% koncentration. Vid högre koncentrationer kan prover dock fällas ut och kan inte detekteras. Protokollet som presenteras här kräver att proteinet är lösbart.Optimala förhållanden för utfällning och pH- eller storleksjustering för kromatografi måste testas och definieras. Studien av enzymatisk funktion, undersökningen av proteinstruktur och utvecklingen av antikroppar stöds starkt när protein extraheras från vävnad snarare än extraheras från bakterier.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Riktad Protein Förpackning inom yttre membranvesiklar från<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion och rening

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinitetsrening av proteinkomplex från eukaryota celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rening av hepatocyter och sinusformad Endothelial celler från mus lever Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymaktivitet och genuttryck av koffein syntas från växten cellsuspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rening och kinetiska analys via syre elektrod för att studera DesB dioxygenas aktivitet och hämning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttryck, Snabba protein rening protokoll och kristallisering av den vilda typen och mutanta former av tryptofan syntas

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Utvinning, rening och profilering av gangliosid

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraktion och visualisering av proteinaggregat efter behandling av Escherichia coli med proteotoxisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...