Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

ونود أن نشكر خوان ج. تينا على استخدام المجانس ومرافق البروتينات وتربية الحيوانات التابعة ل CABD للحصول على الدعم التقني. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والثقافة والرياضة الإسبانية من خلال زمالة FPU16/03264 إلى J.D.H.C. ، والرابطة الفرنسية لمكافحة اعتلال العضلات (AFM) من خلال منحة الزمالة رقم 22450 إلى C.V.-G. ، ومنحة مؤسسية MDM-2016-0687 (وحدة Maria de Maeztu Excellence ، قسم تنظيم الجينات وتكوين المورفوجينيا في CABD) و BFU2017-83150-P إلى J.J.C. منحة المجلس العسكري في الأندلس P18-RT-4572 ، وبرنامج تمويل FEDER من الاتحاد الأوروبي ، ووزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية تمنح RED2018-102576-T إلى P.N.

تم إجراء مبيت الفئران وجمع الأنسجة باستخدام بروتوكولات معتمدة من قبل لجنة أخلاقيات جامعة بابلو دي أولافيد (إشبيلية ، إسبانيا ؛ البروتوكولان 24/04/2018/056 و 12/03/2021/033) وفقا للمرسوم الملكي الإسباني 53/2013 ، والتوجيه الأوروبي 2010/63/EU ، والمبادئ التوجيهية الأخرى ذات الصلة.
1. إعداد الم...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

جميع الطرق المستخدمة لدراسة التنفس الميتوكوندريا لها حدودها. وبالتالي ، من الأهمية بمكان اختيار الطريقة التي تناسب سؤالا تجريبيا محددا. يوفر هذا العمل بروتوكولا محدثا ومفصلا لعزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر لإجراء فحوصات تنفسية مختلفة للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا. والوا?...

الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية الأساسية في الخلية1. تستخدم هذه العضيات المتخصصة المغلقة بالأغشية جزيئات مغذية لإنتاج الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) بواسطة OXPHOS. تعتمد هذه العملية على نقل الإلكترونات من الجزيئات المانحة في سلسلة من تفاعلات الأكسدة والاختزال في ETC2. CoQ هو الدهون الوحيدة النشطة في الأكسدة والاختزال التي يتم إنتاجها داخليا في جميع الأغشية الخلوية والبروتينات الدهنية المتداولة التي تظهر وظيفة مضادات الأكسدة 3. وهو مكون أساسي في ETC ، حيث ينقل الإلكترونات من المجمع I المعتمد على NADH والمجمع الثاني المعتمد على FADH2 إلى المركب الثالث ، على الرغم من أن العديد من المختزلات الأخرى يمكن أن تدفع إلى تقليل CoQ الميتوكوندريا إلى يوبيكوينول كخطوة إلزامية في مسارات التمثيل الغذائي الخلوية المتعددة4,5.
طوال العملية ، يتم إنشاء تدرج بروتون كهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم تحويله إلى طاقة نشطة بيولوجيا بواسطة مركب ATP synthase V2. وبالتالي ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى عدد لا يحصى من الحالات المرضية التي تؤثر بشكل رئيسي على الأنسجة ذات المتطلبات العالية للطاقة - الدماغ والقلب والعضلات الهيكلية6,7. لذلك ، من الضروري تطوير طرق لتحليل الطاقة الحيوية للميتوكوندريا بدقة للتحقيق في دورها في الصحة والمرض ، خاصة في الأنسجة عالية الطاقة مثل العضلات الهيكلية.
تم استخدام قطب الأكسجين من نوع كلارك بشكل كلاسيكي في دراسة تنفس الميتوكوندريا8. ومع ذلك، فقد تم استبدال هذا النظام تدريجيا بتقنيات عالية الدقة، مع تقنيات استهلاك الأكسجين القائمة على الصفائح الدقيقة مثل أجهزة تحليل Agilent Seahorse XF التي تحظى بشعبية خاصة9. في مجال العضلات الهيكلية ، يتم إجراء هذه الدراسات عادة في الخلايا المستزرعة ، وخاصة في خط الخلايا العضلية المخلدة للفئران C2C12 أو الثقافات الأولية المشتقة من خلايا الأقمار الصناعية 10,11. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات لا تلخص بشكل كامل الوضع في الجسم الحي ، خاصة عند التحقيق في بيولوجيا الميتوكوندريا ووظيفتها على مستوى الأنسجة عند إهانات محددة أو تدخلات غير جينية أو تلاعبات جينية.
علاوة على ذلك ، فإن اختبارات التنفس في الخلايا أكثر تعقيدا بسبب عوامل إضافية ، بما في ذلك الطلب خارج الميتوكوندريا على ATP وركائز الفحص أو أحداث الإشارة ، والتي يمكن أن تضلل تفسير النتائج. بدلا من ذلك ، من الممكن أيضا استخدام مفردة أو حزم من الألياف العضلية المعزولة حديثا من العضلات. ومع ذلك ، فإن طريقة العزل صعبة تقنيا وممكنة فقط لعدد قليل من أنواع العضلات. في هذه الحالة ، يتم استخدام العضلات المثنية الرقمية (FDB) والعضلات الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) بشكل رئيسي10،12،13 ، على الرغم من أن بعض التقارير تصف استخدام أنواع العضلات الأخرى أيضا14،15.
كما تم الإبلاغ عن تنميط الطاقة الحيوية لأقسام العضلات الهيكلية 16. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن دراسة العضلات السليمة (يوضح المؤلفون أن التقطيع عبر الألياف لا يزعج النتائج عند مقارنتها بالألياف العضلية المعزولة). ومع ذلك ، فإن وصول الميتوكوندريا إلى الركائز ومثبطات الفحص محدود ، وبالتالي ، لا يمكن قياس سوى عدد قليل من المعلمات16. وأخيرا، يمكن أيضا استخدام الميتوكوندريا المعزولة9،17،18،19. في هذه الحالة ، تفقد الميتوكوندريا بيئتها الخلوية ، مما قد يؤثر على وظيفتها. في المقابل ، تضمن هذه الطريقة الوصول إلى الركائز والمثبطات ، وتمكن من تحليل عدد كبير من أنواع العينات ، وعادة ما تتطلب مواد أقل.
تصف هذه الورقة طريقة لإجراء التنميط الحيوي للميتوكوندريا المعزولة من العضلات الهيكلية للفأر باستخدام المقايسات التنفسية القائمة على الألواح الدقيقة (الشكل 1). وعلى وجه الخصوص، هناك ثلاثة بروتوكولات مفصلة: فحص الاقتران، كاليفورنيا لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC فحص تدفق الإلكترون ، EFA لقياس نشاط مجمعات ETC الفردية ؛ وفحص BOX لتحديد قدرة الميتوكوندريا على أكسدة β. والجدير بالذكر أن هناك حاجة إلى كميات صغيرة فقط من العينات مقارنة بطرق قياس التنفس التقليدية. تم تعديل بروتوكول العزل المستخدم هنا من الطريقة المنشورة في مكان آخر18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

يتم الحصول على معظم طاقة الخلية من خلال تحلل الجلوكوز والأحماض الدهنية والأحماض الأمينية من خلال مسارات مختلفة تتلاقى على نظام الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا (OXPHOS) ، والذي يتم تنظيمه استجابة للطلبات الخلوية. جزيء الدهون الإنزيم المساعد Q (CoQ) ضروري في هذه العملية عن طريق نقل الإلكترونات إلى المركب الثالث في سلسلة نقل الإلكترون (ETC) من خلال دورات أكسدة / اختزال ثابتة. يمكن تقييم حالة الميتوكوندريا ، وفي النهاية ، الصحة الخلوية عن طريق قياس استهلاك الأكسجين ETC باستخدام المقايسات التنفسية. عادة ما يتم إجراء هذه الدراسات في خطوط الخلايا الثابتة أو الأولية التي تم زراعتها لعدة أيام. في كلتا الحالتين ، قد تكون معلمات التنفس التي تم الحصول عليها قد انحرفت عن الظروف الفسيولوجية الطبيعية في أي عضو أو نسيج معين.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخصائص الجوهرية للألياف المفردة المستزرعة المعزولة من العضلات الهيكلية تعيق هذا النوع من التحليل. تقدم هذه الورقة بروتوكولا محدثا ومفصلا لتحليل التنفس في الميتوكوندريا المعزولة حديثا من العضلات الهيكلية للفأر. كما نقدم حلولا للمشاكل المحتملة التي يمكن أن تنشأ في أي خطوة من خطوات العملية. يمكن تطبيق الطريقة المعروضة هنا لمقارنة معدلات استهلاك الأكسجين في نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتنوعة ودراسة استجابة الميتوكوندريا للعلاجات الدوائية أو عوامل أخرى مثل الشيخوخة أو الجنس. هذه طريقة مجدية للرد على الأسئلة الحاسمة حول استقلاب وتنظيم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا.

يسمح البروتوكول المقدم هنا بالتحليل الحي للتنفس الميتوكوندريا من خلال عزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر. ويرد في الشكل 1 مخطط تفصيلي لهذه الطريقة. بعد تشريح العضلات الهيكلية من الأطراف الخلفية (الشكل 2) ، يتم تجانس الأنسجة وتنقية الميتوكوند?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

هنا ، نصف طريقة مفصلة لعزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر والتحليل اللاحق للتنفس بواسطة معدل استهلاك الأكسجين (OCR) باستخدام المقايسات التنفسية القائمة على الصفائح الدقيقة. يمكن تطبيق خط الأنابيب هذا لدراسة آثار التدخلات البيئية أو الجينية المتعددة على استقلاب الميتوكوندريا.

عزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر لإجراء فحوصات قياس التنفس

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

تصف هذه الكلمة تحليل التنفس في معالجة الميتوكوندريا من العضلات الهيكلية للفأر. يقلل هذا البروتوكول بشكل كبير من وقت التنقية ويسمح بمعالجة عينات متعددة في وقت واحد. يمكن تشويه الميتوكوندريا من الحيوانات في أي ثمانية أجناس من خلفية يونايتد باستخدام هذا البروتوكول مما يتيح دراسة التنفس في مجموعة واسعة من الظروف التجريبية.هذه الطريقة مناسبة لجميع مجالات البحث التي تكون فيها وظيفة الميتوكوندريا ذات صلة بما في ذلك الشيخوخة أو اختبار المخدرات أو السرطان أو التطور. يمكن حتى تكييفها مع الأنسجة والكائنات الحية الأخرى أيضا. تأكد من أن جميع المواد باردة عن طريق وضع كل شيء على الجليد أثناء الإجراء لحماية الميتوكوندريا من التلف.ضع ثلاثة أكواب 50 ملليلتر لكل عينة على الجليد وأضف 10 ملليلتر من PBS في كوب واحد ، و 10 ملليلتر من 10 ملليمولار EDTA PBS في دورق اثنين ، وأربعة ملليلتر IB1 في دورق ثلاثة. رش الطرف الخلفي الأيمن للفأر الرحيم بالإيثانول بنسبة 70٪ لمنع الفراء من التساقط وربط الطرف بلوحة تشريح الفلين ثم ربط الطرف الأمامي الأيسر. قم بعمل شق باستخدام مشرط معقم يمكن التخلص منه عبر الجلد من الركبة إلى أخمص القدمين.أمسك الجلد بملقط مسنن على مستوى الكاحل وقطعه بمقص ناعم حول الكاحل. خفف الجلد بعيدا عن العضلات الأساسية باستخدام ملاقط دقيقة في يد واحدة أثناء سحبه باستخدام ملقط مسنن في اليد الأخرى. تشريح جميع عضلات الهيكل العظمي من الكاحل إلى الركبة وإزالة جميع الأنسجة الضامة فوق العضلة الأمامية الظنبوبية باستخدام ملاقط ومقص دقيق.أوجد الأوتار الأربعة البعيدة للعضلة الباسطة الرقمية الطويلة وقسمها بالقرب من إدخالاتها في أصابع القدم. حدد موقع الوتر البعيد الأمامي الظنبوبي وقطعه بالقرب من إدخاله أسفل الكاحل. اسحب أوتار الظنبوب الأمامية والباسطة الرقمية الطويلة فوق الكاحل لتحرير الأطراف الرخوة.أمسك بالأطراف الرخوة للأوتار وقم بتخفيف العضلات بعيدا عن بقية العضلات في العظام عن طريق سحبها لأعلى. قطع الأوتار القريبة من هذه العضلات أقرب ما يمكن إلى الرضفة. اقلب الماوس رأسا على عقب للمضي قدما في استخراج العضلات المعدية والوحيدة.أمسك الجيب المتشكل بين العضلة ذات الرأسين وعظم الفخذ والمعدة وافصل هذه العضلات باستخدام مقص دقيق لتصور وتر المعدة القريب. قبضة وقطع بعناية وتر أخيل البعيد مع مقص غرامة. قطع وتر المعدة القريبة لتحريره مع النعل الأساسي.تشريح العضلات المتبقية بعناية وإعادة تثبيت الماوس في الموضع الأولي لتشريح عضلة الفخذ الرباعية. تخلص من الأنسجة الدهنية ثم أدخل ملاقط دقيقة بين الفخذ الرباعي وعظم الفخذ لفصل العضلات عن العظام. أمسك بأوتار العضلات رباعية الرؤوس البعيدة واقطع الوتر في أقرب مكان ممكن من الرضفة.اسحب العضلة رباعية الرؤوس لأعلى وحررها بمقص دقيق عند الإدخال القريب. كرر الشيء نفسه للطرف الخلفي الأيسر. شطف جميع العضلات في دورق واحد ، ثم اثنين ، تليها دورق ثلاثة.أخيرا ، قم بفرم جميع العضلات في الكأس الثالثة بمقص حاد على الجليد. انقل التعليق إلى أنبوب C ، وأغلقه بإحكام ، وقم بإرفاقه رأسا على عقب على غلاف المجانس. قسم المتجانس إلى أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي الصغيرة المبردة مسبقا سعة 2 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق.ثم انقل المادة الفائقة إلى أنابيب جديدة مبردة مسبقا وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق أخرى. الجمع بين بيليه في 500 ميكرولتر من IB2 نقل supernatant إلى أنبوب جديد 2 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا وتسميته على أنه supernatant رقم اثنين ، أو SN2. أعد تعليق حبيبة الميتوكوندريا النهائية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق.ضع جانبا بسرعة 10 ميكرولترات لتحديد كمية البروتين وأضف على الفور 10 ميكرولترات من 10٪ FFA BSA إلى تعليق الميتوكوندريا المتبقي لمنع الضرر. الطرد المركزي لتعليق الميتوكوندريا المركز عند 10،500 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق بيليه الميتوكوندريا في 100 ميكرولتر من متوسط فحص اقتران 1X مع BSA ، أو وسط فحص تدفق الإلكترون 1X مع BSA ، أو وسط أكسدة بيتا 1X مع BSA ، اعتمادا على البروتوكول الذي سيتم إجراؤه.قم بتخفيف عينة الميتوكوندريا المركزة هذه إلى 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر باستخدام وسط الفحص المقابل. زرع 50 ميكرولتر من التعليق لكل بئر في صفيحة صغيرة من 24 بئرا مبردة مسبقا على الجليد. في آبار تصحيح الخلفية ، أضف وسيط الفحص المقابل فقط.قم بتخزين تعليق الميتوكوندريا المتبقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتحديد نقاء التجزئة. قم بتدوير اللوحة الصغيرة في جهاز الطرد المركزي التحضيري المبرد مسبقا لمدة 20 دقيقة. في غضون ذلك ، قم بتسخين الفحص المتبقي متوسط إلى 37 درجة مئوية.بعد الطرد المركزي ، اترك اللوحة الصغيرة على المقعد لمدة خمس دقائق لتحقيق التوازن. أضف 450 ميكرولتر من وسط الفحص الدافئ لكل بئر ببطء وبعناية لتجنب فصل الميتوكوندريا. ضع اللوحة الدقيقة على الفور في أداة قياس استهلاك الأكسجين بدون الغطاء وابدأ برنامج القياس.تأكد من أن الخطوة الأولى هي حضانة لمدة 10 دقائق للسماح للصفيحة الصغيرة بالإحماء. بمجرد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة الخرطوشة واللوحة الدقيقة ، وقم بإيقاف تشغيل الجهاز ، وابدأ التحليل. أظهرت ملامح البروتين العامة من الكسور المختلفة التي تم الحصول عليها من خلال أجهزة الطرد المركزي التسلسلية مجموعات بروتين متميزة في الكسور المعزولة.يتضح وجود كل محتوى الميتوكوندريا من خلال الإشارات القوية لعلامات غشاء الميتوكوندريا الخارجي والداخلي والبروتينات المرتبطة بالنيوكليويد. يمثل الكسر N النوى والمواد غير المعطلة. معظم الشبكة الإندوبلازمية أو الغشاء البلازمي أو علامات السيتوبلازم في كسور SN1 أو SN2 تسلط الضوء على النقاء العالي الذي تم الحصول عليه أثناء العزلة.لوحظت زيادة في استهلاك الأكسجين بعد إضافة ADP في مقايسات الاقتران وأكسدة بيتا. بعد إضافة الكربونيل سيانيد - ف - ثلاثي فلورو ميثوكسي فينيل هيدرازون ، وصل استهلاك الأكسجين إلى أعلى مستوى له. تضمن نسبة التحكم في الجهاز التنفسي المنخفضة سلامة الميتوكوندريا المعزولة.فحص فحص تدفق الإلكترون نشاط مجمعات سلسلة نقل الإلكترون بشكل فردي أو مجتمعة من خلال حقن ركائز ومثبطات محددة. عزل الميتوكوندريا حساسة للغاية. وبالتالي يجب تنفيذ جميع الخطوات بعد تخفيف الأنسجة بجد وبعناية للحفاظ على صلاحيتها.يمكن استكمال الفحوصات التجريبية بتحليل سيماتي حتمي لجزيئات الميتوكوندريا الرئيسية أو بدراسة تجميع مجمعات التنفس باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام البولي أكريلاميد الأصلي الأزرق.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...