Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Vi vil gerne takke Juan J. Tena for brugen af homogenisatoren og CABD Proteomics and Animal Husbandry-faciliteterne til teknisk support. Dette arbejde blev støttet af det spanske ministerium for uddannelse, kultur og sport gennem stipendium FPU16/03264 til J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) gennem stipendietilskud #22450 til C.V.-G., et institutionelt tilskud MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) og BFU2017-83150-P til J.J.C. Junta de Andalucía-bevillingen P18-RT-4572, FEDER-finansieringsprogrammet fra Den Europæiske Union og det spanske ministerium for videnskab, innovation og universiteter giver RED2018-102576-T til P.N.

Indsamling af mus og væv blev udført ved hjælp af protokoller godkendt af Universidad Pablo de Olavide Ethics Committee (Sevilla, Spanien; protokoller 24/04/2018/056 og 12/03/2021/033) i overensstemmelse med det spanske kongelige dekret 53/2013, det europæiske direktiv 2010/63/EU og andre relevante retningslinjer.
1. Forberedelse af lagre, buffere og reagenser til respirationsanalyser
<ol><li>Forbered følgende stamopløsninger, som kan opbevares ved den angivne temperat...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Alle metoder, der anvendes til at studere mitokondriel respiration, har deres begrænsninger; Derfor er det afgørende at vælge den metode, der bedst passer til et specifikt eksperimentelt spørgsmål. Dette arbejde giver en opdateret og detaljeret protokol til at isolere mitokondrier fra musens skeletmuskulatur for at udføre forskellige respiratoriske assays for at undersøge mitokondriefunktionen. Faktisk er undersøgelsen af mitokondriel bioenergetik i isolerede mitokondrier ved hjælp af mikropladebaserede teknolog...

Mitokondrier er de primære metaboliske organeller i cellen1. Disse specialiserede membranlukkede organeller bruger næringsmolekyler til at producere energi i form af adenosintrifosfat (ATP) af OXPHOS. Denne proces er afhængig af overførsel af elektroner fra donormolekyler i en række redoxreaktioner i ETC2. CoQ er det eneste redoxaktive lipid, der produceres endogent i alle cellemembraner og cirkulerende lipoproteiner, der viser antioxidantfunktion3. Det er en væsentlig bestanddel af ETC, der overfører elektroner fra NADH-afhængigt kompleks I og FADH2-afhængigt kompleks II til kompleks III, selvom mange andre reduktaser kan drive reduktionen af mitokondriel CoQ til ubiquinol som et obligatorisk trin i flere cellulære metaboliske veje4,5.
Gennem hele processen skabes en elektrokemisk protongradient på tværs af den mitokondrielle indre membran, som omdannes til biologisk aktiv energi af ATP-syntasekomplekset V2. Derfor fører mitokondriel dysfunktion til et utal af patologiske tilstande, der hovedsageligt påvirker væv med høje energibehov - hjernen, hjertet og skeletmuskulaturen6,7. Derfor er det grundlæggende at udvikle metoder til nøjagtigt at analysere mitokondriel bioenergetik for at undersøge dens rolle i sundhed og sygdom, især i meget energiske væv som skeletmuskler.
Oxygenelektroden af Clark-typen er klassisk blevet anvendt i studiet af mitokondriel respiration8. Dette system er imidlertid gradvist blevet fortrængt af teknologier med højere opløsning, hvor mikropladebaserede iltforbrugsteknologier som Agilent Seahorse XF-analysatorer er særligt populære9. På skeletmuskelområdet udføres disse undersøgelser typisk i dyrkede celler, hovedsageligt i C2C12 udødeliggjort muse myoblast cellelinje eller primære kulturer afledt af satellitceller10,11. Disse undersøgelser rekapitulerer imidlertid ikke fuldt ud situationen in vivo, især når man undersøger mitokondriebiologi og funktion på vævsniveau ved specifikke fornærmelser, ikke-genetiske indgreb eller genetiske manipulationer.
Desuden er respirationsassays i celler mere komplekse på grund af yderligere faktorer, herunder ekstra mitokondriel efterspørgsel efter ATP- og assaysubstrater eller signalhændelser, hvilket kan vildlede fortolkningen af resultaterne. Alternativt er det også muligt at bruge enkelt eller bundter af friskisolerede myofibre fra musklerne. Isolationsmetoden er dog teknisk udfordrende og kun mulig for nogle få muskeltyper. I dette tilfælde anvendes flexor digitorum brevis (FDB) og extensor digitorum longus (EDL) muskler hovedsageligt10,12,13, selvom nogle få rapporter også beskriver brugen af andre muskeltyper14,15.
Bioenergetisk profilering af skeletmuskelsektioner er også blevet rapporteret16. Den største fordel ved denne metode er, at intakte muskler kan studeres (forfatterne viser, at udskæring gennem fibre ikke forstyrrer resultaterne sammenlignet med isolerede myofibre). Mitokondrieadgangen til substrater og analysehæmmere er dog begrænset, og dermed kan kun få parametre måles16. Endelig kan isolerede mitokondrier ligeledes anvendes9,17,18,19. I dette tilfælde mister mitokondrier deres cytosoliske miljø, hvilket kan påvirke deres funktion. I modsætning hertil garanterer denne metode adgang til substrater og hæmmere, muliggør analyse af en overflod af prøvetyper og kræver typisk mindre materiale.
Dette papir beskriver en metode til at udføre bioenergetisk profilering af isolerede mitokondrier fra museskeletmuskulatur ved hjælp af mikropladebaserede respirometriske assays (figur 1). Der er navnlig tre protokoller detaljeret: koblingsassayet, CA til vurdering af graden af kobling mellem etc og OXPHOS-maskinen; Elektronstrømsassayet, EFA til måling af aktiviteten af de enkelte ETC-komplekser; og BOX-analysen til bestemmelse af mitokondrie- β oxidationskapacitet. Især kræves der kun små mængder prøver sammenlignet med konventionelle respirometrimetoder. Den isolationsprotokol, der anvendes her, er blevet ændret fra den metode, der er offentliggjort andetsteds18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

Det meste af cellens energi opnås ved nedbrydning af glucose, fedtsyrer og aminosyrer ved forskellige veje, der konvergerer på mitokondrieoxidativ phosphorylering (OXPHOS) -systemet, som reguleres som reaktion på cellulære krav. Lipidmolekylet Coenzym Q (CoQ) er afgørende i denne proces ved at overføre elektroner til kompleks III i elektrontransportkæden (ETC) gennem konstante oxidations- / reduktionscyklusser. Mitokondrier status og i sidste ende cellulær sundhed kan vurderes ved at måle ETC iltforbrug ved hjælp af respirometriske assays. Disse undersøgelser udføres typisk i etablerede eller primære cellelinjer, der er blevet dyrket i flere dage. I begge tilfælde kan de opnåede respirationsparametre have afveget fra normale fysiologiske forhold i et givet organ eller væv.
Derudover hindrer de iboende egenskaber ved dyrkede enkeltfibre isoleret fra skeletmuskulatur denne type analyse. Dette papir præsenterer en opdateret og detaljeret protokol til analyse af åndedræt i friskisolerede mitokondrier fra museskeletmuskulatur. Vi leverer også løsninger på potentielle problemer, der kan opstå på ethvert trin i processen. Den metode, der præsenteres her, kan anvendes til at sammenligne iltforbrugshastigheder i forskellige transgene musemodeller og studere mitokondrieresponset på lægemiddelbehandlinger eller andre faktorer såsom aldring eller køn. Dette er en gennemførlig metode til at svare på afgørende spørgsmål om mitokondriel bioenergetik metabolisme og regulering.

Protokollen, der præsenteres her, tillader in vivo-analyse af mitokondriel respiration gennem isolering af mitokondrier fra museskeletmuskulatur. En oversigt over metoden er vist i figur 1. Efter dissekering af skeletmuskler fra bagbenene (figur 2) homogeniseres væv og mitokondrier renses under isotoniske forhold gennem serielle centrifugeringer. Renheden af de forskellige fraktioner opnået under isolationsprocessen kan analyseres ved western blot ve...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Her beskriver vi en detaljeret metode til mitokondrier isolering fra musens skeletmuskulatur og den efterfølgende analyse af åndedræt ved Oxygen Consumption Rate (OCR) ved hjælp af mikropladebaserede respirometriske assays. Denne rørledning kan anvendes til at studere virkningerne af flere miljømæssige eller genetiske indgreb på mitokondriemetabolisme.

Isolering af mitokondrier fra museskeletmuskulatur til respirometriske assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Dette ord beskriver respirationsanalyse ved behandling af mitokondrier fra musens skeletmuskulatur. Denne protokol reducerer rensningstiden betydeligt og gør det muligt at behandle flere prøver samtidigt. Mitokondrier fra dyr på et hvilket som helst otte køn med United-baggrund kan lemlæstes ved hjælp af denne protokol, der muliggør undersøgelse af åndedræt under en lang række eksperimentelle forhold.Denne metode er velegnet til alle forskningsområder, hvor mitokondriers funktion er relevant, herunder aldring, lægemiddeltest, kræft eller udvikling. Det kan endda også tilpasses andre væv og organismer. Sørg for, at alle materialer er kolde ved at placere alt på isen under proceduren for at beskytte mitokondrier mod skader.Der anbringes tre bægerglas på 50 ml pr. prøve på is, og der tilsættes 10 ml PBS i bægerglas 1, 10 ml 10 millimolær EDTA PBS i bægerglas to og fire milliliter IB1 i bægerglas tre. Sprøjt højre bagben på en aflivet mus med 70% ethanol for at forhindre pels i at kaste og tape lemmet til korkdissektionspladen og tape derefter venstre forben. Lav et snit med en steril engangsskalpel gennem huden fra knæ til tå.Tag fat i huden med tandede tang i ankelhøjde og klip den med en fin saks omkring anklen. Lette huden væk fra den underliggende muskulatur med en fin spids pincet i den ene hånd, mens du trækker den op med tandede tang i den anden hånd. Dissekere alle skeletmuskler fra ankel til knæ og fjerne alt bindevæv over tibialis forreste muskel ved hjælp af fin pincet og saks.Find de fire distale sener i extensor digitorum longus muskel og sektion dem tæt på deres indsættelser i tæerne. Find tibialis forreste distale sene og skær den tæt på dens indsættelse under anklen. Træk tibialis forreste og extensor digitorum longus sener over anklen for at frigøre de løse ender.Tag fat i senernes løse ender og lette musklerne væk fra resten af muskulaturen i knoglerne ved at trække dem op. Skær de proksimale sener af disse muskler så tæt som muligt på knæskallen. Vend musen på hovedet for at fortsætte med gastrocnemius og soleus muskelekstraktion.Tag fat i lommen dannet mellem biceps, femoris og gastrocnemius og adskil disse muskler ved hjælp af en fin saks for at visualisere den proksimale gastrocnemius sene. Tag fat i og skær forsigtigt den distale akillessene med en fin saks. Skær den proksimale gastrocnemius sene, der frigør den med den underliggende soleus.Disseker forsigtigt de resterende muskler og fastgør musen igen i den oprindelige position for at dissekere quadriceps-musklen. Kassér fedtvævet, og indsæt derefter en fin pincet mellem quadriceps og lårbenet for at adskille musklen fra knoglen. Tag fat i de distale quadriceps muskelsener og skær senen så tæt som muligt på knæskallen.Træk quadriceps op og frigør dem med en fin saks ved den proksimale indsættelse. Gentag det samme for venstre bagben. Skyl alle musklerne i bægerglas et, derefter to, efterfulgt af bægerglas tre.Til sidst hakkes alle musklerne i bægerglas tre med skarp saks på is. Overfør suspensionen til et C-rør, luk det tæt, og fastgør det på hovedet på homogenisatorens bøsning. Homogenatet opdeles i to 2 ml forkølede mikrocentrifugerør og centrifugering i 10 minutter.Overfør derefter supernatanten til nye forkølede rør og centrifuge i yderligere 10 minutter. Kombiner pelleten i 500 mikroliter IB2 Overfør supernatanten til et nyt 2 milliliter forkølet mikrocentrifugerør og mærk det som supernatant nummer to eller SN2. Re suspendere den endelige mitokondriepellets i 200 mikroliter resuspensionbuffer.Sæt hurtigt 10 mikroliter til proteinkvantificering til side, og tilsæt straks 10 mikroliter 10% FFA BSA til den resterende mitokondriesuspension for at forhindre skade. Centrifugering af den koncentrerede mitokondriesuspension ved 10.500 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Re suspendere mitokondriepillen i 100 mikroliter 1X koblingsassaymedium med BSA, 1X elektronstrømningsassaymedium med BSA eller 1X betaoxidationsmedium med BSA, afhængigt af den protokol, der skal udføres.Fortynd denne koncentrerede mitokondrieprøve til 0,2 mikrogram pr. mikroliter ved hjælp af det tilsvarende analysemedium. Frø 50 mikroliter af suspensionen pr. brønd i en forkølet mikroplade med 24 brønde på is. I baggrundskorrektionsbrøndene skal du kun tilføje det tilsvarende analysemedium.Opbevar den resterende mitokondriesuspension ved minus 80 grader Celsius til bestemmelse af fragmenteringsrenhed. Mikropladen drejes i den forkølede præparativcentrifuge i 20 minutter. I mellemtiden opvarmes det resterende analysemedium til 37 grader Celsius.Efter centrifugering skal du lade mikropladen stå på bænken i fem minutter for at udligne. Tilsæt 450 mikroliter af det varme analysemedium pr. brønd langsomt og forsigtigt for at undgå afskærmning af mitokondrier. Anbring straks mikropladen i iltforbrugsmåleinstrumentet uden låg, og start måleprogrammet.Sørg for, at det første trin er en 10 minutters inkubation for at lade mikropladen varme op. Når eksperimentet er afsluttet, skal du fjerne patronen og mikropladen, slukke for instrumentet og starte analysen. Generelle proteinprofiler fra de forskellige fraktioner opnået gennem serielle centrifugeringer viste forskellige proteinpopulationer i de isolerede fraktioner.Tilstedeværelsen af alt mitokondrieindholdet fremgår af de stærke signaler for markører for den ydre og indre mitokondriemembran og nukleoidassocierede proteiner. Fraktion N repræsenterer kerner og uforstyrret materiale. De fleste af de endoplasmatiske retikulum-, plasmamembran- eller cytoplasmamarkører i SN1- eller SN2-fraktionerne fremhæver den høje renhed opnået under isolering.En stigning i iltforbruget blev observeret efter ADP-tilsætning i koblings- og betaoxidationsassays. Efter carbonylcyanid-p-trifluormetoxy phenylhydrazon-tilsætning nåede iltforbruget sit højeste niveau. Et lavt åndedrætskontrolforhold sikrer integriteten af de isolerede mitokondrier.Elektronstrømsassayet undersøgte aktiviteten af elektrontransportkædekomplekserne individuelt eller i kombination gennem injektion af specifikke substrater og hæmmere. Isolering af mitokondrier er ekstremt følsomme. Derfor skal alle trin efter vævsafbødning udføres flittigt og omhyggeligt for at bevare deres levedygtighed.Eksperimentelle assays kan komplimenteres med en deterministisk sematisk analyse af vigtige mitokondriermolekyler eller med undersøgelsen af samlingen af respirometriske komplekser ved anvendelse af blå native polyacrylamidgelelektroforese.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Påført skade af zebrafisk Embryonale skeletmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering og dyrkning af individuelle myofibre og deres satellit celler fra voksne skeletmuskler

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering af blod-fartøj-afledt Multipotente Forstadier fra human skeletmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering og funktionel analyse af mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...