Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

We willen Juan J. Tena bedanken voor het gebruik van de homogenisator en de CABD Proteomics en Veeteelt faciliteiten voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van Onderwijs, Cultuur en Sport via fellowship FPU16/03264 aan J.D.H.C., de Association Française contre les Myopathies (AFM) via fellowship grant #22450 aan C.V.-G., een Institutional Grant MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis bij CABD) en BFU2017-83150-P aan J.J.C. De Junta de Andalucía-subsidie P18-RT-4572, het FEDER-financieringsprogramma van de Europese Unie en het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten verlenen RED2018-102576-T aan P.N.

Muishuisvesting en weefselverzameling werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Spanje; protocollen 24/04/2018/056 en 12/03/2021/033) in overeenstemming met het Spaanse koninklijk besluit 53/2013, de Europese richtlijn 2010/63/EU en andere relevante richtlijnen.
1. Voorbereiding van voorraden, buffers en reagentia voor de ademhalingstests
<ol><li>Bereid de volgende stamoplossinge...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Alle methoden die worden gebruikt om mitochondriale ademhaling te bestuderen, hebben hun beperkingen; daarom is het cruciaal om de methode te kiezen die het beste past bij een specifieke experimentele vraag. Dit werk biedt een bijgewerkt en gedetailleerd protocol om mitochondriën te isoleren van de skeletspieren van muizen om verschillende ademhalingstests uit te voeren om de mitochondriale functie te onderzoeken. Inderdaad, de studie van mitochondriale bio-energetica in geïsoleerde mitochondriën met behulp van microp...

Mitochondriën zijn de primaire metabole organellen in de cel1. Deze gespecialiseerde membraan-ingesloten organellen gebruiken voedingsmoleculen om energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP) door OXPHOS. Dit proces is afhankelijk van de overdracht van elektronen van donormoleculen in een reeks redoxreacties in de ETC2. CoQ is het enige redox-actieve lipide dat endogeen wordt geproduceerd in alle celmembranen en circulerende lipoproteïnen die een antioxiderende functie vertoont3. Het is een essentieel onderdeel van de ETC, het overbrengen van elektronen van NADH-afhankelijk complex I en FADH2-afhankelijk complex II naar complex III, hoewel veel andere reductasen de reductie van mitochondriale CoQ naar ubiquinol kunnen stimuleren als een verplichte stap in meerdere cellulaire metabole routes4,5.
Gedurende het hele proces wordt een elektrochemische protongradiënt gecreëerd over het mitochondriale binnenmembraan, dat wordt omgezet in biologisch actieve energie door het ATP-synthasecomplex V2. Bijgevolg leidt mitochondriale disfunctie tot een groot aantal pathologische aandoeningen die voornamelijk weefsels met hoge energiebehoeften beïnvloeden - de hersenen, het hart en de skeletspieren6,7. Daarom is het van fundamenteel belang om methoden te ontwikkelen om mitochondriale bio-energetica nauwkeurig te analyseren om de rol ervan in gezondheid en ziekte te onderzoeken, met name in hoogenergetische weefsels zoals skeletspieren.
De Clark-type zuurstofelektrode is klassiek gebruikt in de studie van mitochondriale ademhaling8. Dit systeem is echter geleidelijk verdrongen door technologieën met een hogere resolutie, waarbij op microplaten gebaseerde zuurstofverbruikstechnologieën zoals Agilent Seahorse XF-analyzers bijzonder populair zijn9. Op het gebied van skeletspieren worden deze studies meestal uitgevoerd in gekweekte cellen, voornamelijk in de C2C12 vereeuwigde muismyoblastcellijn of primaire culturen afgeleid van satellietcellen10,11. Deze studies vatten de situatie echter niet volledig in vivo samen, vooral bij het onderzoeken van mitochondriale biologie en functie op weefselniveau bij specifieke beledigingen, niet-genetische interventies of genetische manipulaties.
Bovendien zijn ademhalingstests in cellen complexer vanwege aanvullende factoren, waaronder extra mitochondriale vraag naar ATP en assaysubstraten of signaalgebeurtenissen, die de interpretatie van de resultaten kunnen misleiden. Als alternatief is het ook mogelijk om enkele of bundels vers geïsoleerde myofibers uit spieren te gebruiken. De isolatiemethode is echter technisch uitdagend en slechts voor enkele spiertypen haalbaar. In dit geval worden voornamelijk flexor digitorum brevis (FDB) en extensor digitorum longus (EDL) spieren gebruikt10,12,13, hoewel enkele rapporten ook het gebruik van andere spiertypen beschrijven14,15.
Bio-energetische profilering van skeletspiersecties is ook gemeld16. Het grote voordeel van deze methode is dat intacte spieren kunnen worden bestudeerd (de auteurs laten zien dat het snijden door vezels de resultaten niet verstoort in vergelijking met geïsoleerde myofiberen). De mitochondriale toegang tot substraten en assayremmers is echter beperkt en dus kunnen slechts enkele parameters worden gemeten16. Ten slotte kunnen geïsoleerde mitochondriën ook worden gebruikt9,17,18,19. In dit geval verliezen mitochondriën hun cytosolische omgeving, wat hun functie kan beïnvloeden. Deze methode garandeert daarentegen toegang tot substraten en remmers, maakt de analyse van een overvloed aan monstertypen mogelijk en vereist doorgaans minder materiaal.
Dit artikel beschrijft een methode om de bio-energetische profilering van geïsoleerde mitochondriën uit de skeletspieren van muizen uit te voeren met behulp van respirometrische assays op basis van microplaten (figuur 1). In het bijzonder zijn drie protocollen gedetailleerd: de koppelingstest, CA om de mate van koppeling tussen de ETC en de OXPHOS-machines te beoordelen; de Electron Flow Assay, EFA om de activiteit van de afzonderlijke ETC-complexen te meten; en de BOX-test om mitochondriale β-oxidatiecapaciteit te bepalen. Met name zijn slechts kleine hoeveelheden monsters vereist in vergelijking met conventionele respirometriemethoden. Het hier gebruikte isolatieprotocol is aangepast ten opzichte van de elders gepubliceerde methode18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

Het grootste deel van de energie van de cel wordt verkregen door de afbraak van glucose, vetzuren en aminozuren door verschillende routes die samenkomen op het mitochondriale oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS), dat wordt gereguleerd als reactie op cellulaire eisen. Het lipidemolecuul Co-enzym Q (CoQ) is essentieel in dit proces door elektronen over te brengen naar complex III in de elektronentransportketen (ETC) door constante oxidatie/ reductiecycli. Mitochondriale status en, uiteindelijk, cellulaire gezondheid kunnen worden beoordeeld door etc zuurstofverbruik te meten met behulp van respirometrische assays. Deze studies worden meestal uitgevoerd in gevestigde of primaire cellijnen die gedurende meerdere dagen zijn gekweekt. In beide gevallen kunnen de verkregen ademhalingsparameters afwijken van de normale fysiologische omstandigheden in een bepaald orgaan of weefsel.
Bovendien belemmeren de intrinsieke kenmerken van gekweekte enkelvoudige vezels geïsoleerd uit skeletspieren dit type analyse. Dit artikel presenteert een bijgewerkt en gedetailleerd protocol voor de analyse van ademhaling in vers geïsoleerde mitochondriën van muizenskeletspieren. We bieden ook oplossingen voor mogelijke problemen die zich in elke stap van het proces kunnen voordoen. De hier gepresenteerde methode kan worden toegepast om zuurstofverbruikssnelheden in verschillende transgene muismodellen te vergelijken en de mitochondriale respons op medicamenteuze behandelingen of andere factoren zoals veroudering of geslacht te bestuderen. Dit is een haalbare methode om te reageren op cruciale vragen over mitochondriaal bio-energetisch metabolisme en regulatie.

Het hier gepresenteerde protocol maakt de in vivo analyse van mitochondriale ademhaling mogelijk door de isolatie van mitochondriën van de skeletspieren van muizen. Een overzicht van de methode is weergegeven in figuur 1. Na het ontleden van skeletspieren uit de achterpoten (figuur 2), worden weefsels gehomogeniseerd en mitochondriën gezuiverd, onder isotone omstandigheden, door seriële centrifubaties. De zuiverheid van de verschillende fracties verk...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Dit woord beschrijft ademhalingsanalyse bij het verwerken van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen. Dit protocol verkort de zuiveringstijd aanzienlijk en maakt het mogelijk om meerdere monsters tegelijkertijd te verwerken. Mitochondriën van dieren met een acht geslacht van Verenigde achtergrond kunnen worden verminkt met behulp van dit protocol dat de studie van ademhaling in een breed scala van experimentele omstandigheden mogelijk maakt.Deze methode is geschikt voor alle onderzoeksgebieden waar de mitochondriale functie relevant is, waaronder veroudering, medicijntesten, kanker of ontwikkeling. Het kan zelfs worden aangepast aan andere weefsels en organismen. Zorg ervoor dat alle materialen koud zijn door alles tijdens de procedure op het ijs te plaatsen om mitochondriën te beschermen tegen schade.Leg drie bekers van 50 milliliter per monster op ijs en voeg 10 milliliter PBS toe in beker één, 10 milliliter 10 millimolaire EDTA PBS in beker twee en vier milliliter IB1 in beker drie. Spuit de rechter achterpoot van een geëuthanaseerde muis met 70% ethanol om te voorkomen dat de vacht afstoot en plak de ledemaat vast aan de kurkdissectieplaat en plak vervolgens de linkervoorpoot vast. Maak een incisie met een steriel wegwerp scalpel door de huid van knie tot teen.Pak de huid vast met een getande tang op enkelhoogte en knip deze met een fijne schaar om de enkel. Maak de huid weg van de onderliggende musculatuur met een pincet met fijne punt in de ene hand en trek het omhoog met een getande tang in de andere hand. Ontleed alle skeletspieren van enkel tot knie en verwijder al het bindweefsel over de tibialis voorste spier met behulp van een fijn pincet en schaar.Zoek de vier distale pezen van de extensor digitorum longus spier en snijd ze dicht bij hun inserties in de tenen. Lokalis anterieure distale pees en snijd deze dicht bij het inbrengen onder de enkel. Trek de tibialis anterieure en extensor digitorum longus pezen boven de enkel om de losse eindjes vrij te maken.Pak de losse eindjes van de pezen vast en verlicht de spieren weg van de rest van de spieren in botten door ze omhoog te trekken. Snijd de proximale pezen van deze spieren zo dicht mogelijk bij de knieschijf. Draai de muis ondersteboven om verder te gaan met gastrocnemius en soleus spierextractie.Pak de pocket tussen de biceps, femoris en de gastrocnemius vast en scheid deze spieren met een fijne schaar om de proximale gastrocnemiuspees te visualiseren. Grijp en knip de distale achillespees voorzichtig door met een fijne schaar. Snijd de proximale gastrocnemiuspees door en bevrijd deze met de onderliggende soleus.Ontleed voorzichtig de resterende spieren en pin de muis opnieuw vast in de beginpositie om de quadricepsspier te ontleden. Gooi het vetweefsel weg en plaats vervolgens een fijn pincet tussen de quadriceps en het dijbeen om de spier van het bot te scheiden. Pak de distale quadriceps spierpezen vast en snijd de pees zo dicht mogelijk bij de knieschijf.Trek de quadriceps omhoog en bevrijd ze met een fijne schaar bij het proximaal inbrengen. Herhaal hetzelfde voor de linker achterpoot. Spoel alle spieren in beker één, dan twee, gevolgd door beker drie.Tot slot hak je alle spieren in beker drie met een scherpe schaar op ijs. Breng de ophanging over in een C-buis, sluit deze goed en bevestig deze ondersteboven aan de huls van de homogenisator. Verdeel het homogenaat in twee voorgekoelde microcentrifugebuizen van 2 milliliter en centrifugeer gedurende 10 minuten.Breng vervolgens het supernatant over in nieuwe voorgekoelde buizen en centrifugeer nog 10 minuten. Combineer de pellet in 500 microliter IB2 Breng het supernatant over naar een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 2 milliliter en label deze als supernatant nummer twee, of SN2. Re suspensie van de uiteindelijke mitochondriale pellet in 200 microliter re-suspensiebuffer.Zet snel 10 microliter opzij voor eiwitkwantificering en voeg onmiddellijk 10 microliter 10% FFA BSA toe aan de resterende mitochondriale suspensie om schade te voorkomen. Centrifugeer de geconcentreerde mitochondriale suspensie op 10, 500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Re suspensie van de mitochondriale pellet in 100 microliter 1X koppelingstestmedium met BSA, 1X elektronenstroomtestmedium met BSA, of 1X bèta-oxidatiemedium met BSA, afhankelijk van het uit te voeren protocol.Verdun dit geconcentreerde mitochondriale monster tot 0,2 microgram per microliter met behulp van het overeenkomstige testmedium. Zaai 50 microliter van de suspensie per put in een voorgekoelde 24 put microplaat op ijs. Voeg in de achtergrondcorrectieputten alleen het bijbehorende testmedium toe.Bewaar de resterende mitochondriale suspensie bij min 80 graden Celsius voor fragmentatiezuiverheidsbepaling. Draai de microplaat gedurende 20 minuten in de voorgekoelde bereidingscentrifuge. Verwarm ondertussen het resterende testmedium tot 37 graden Celsius.Laat na het centrifugeren de microplaat vijf minuten op de bank liggen om te balanceren. Voeg langzaam en voorzichtig 450 microliter van het warme testmedium per put toe om te voorkomen dat de mitochondriën worden losgemaakt. Plaats de microplaat onmiddellijk in het zuurstofverbruiksmeetinstrument zonder deksel en start het meetprogramma.Zorg ervoor dat de eerste stap een incubatie van 10 minuten is om de microplaat te laten opwarmen. Zodra het experiment is voltooid, verwijdert u de cartridge en microplaat, schakelt u het instrument uit en start u de analyse. Algemene eiwitprofielen van de verschillende fracties verkregen door seriële centrifubaties toonden verschillende eiwitpopulaties in de geïsoleerde fracties.De aanwezigheid van alle mitochondriale inhoud blijkt uit de sterke signalen voor markers van het buitenste en binnenste mitochondriale membraan en nucleoïde geassocieerde eiwitten. Fractie N staat voor kernen en ongestoord materiaal. De meeste endoplasmatische reticulum-, plasmamembraan- of cytoplasmamarkers in de SN1- of SN2-fracties benadrukken de hoge zuiverheid die tijdens isolatie wordt verkregen.Een toename van het zuurstofverbruik werd waargenomen na ADP-toevoeging in de koppelings- en bèta-oxidatietests. Na toevoeging van carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon bereikte het zuurstofverbruik zijn hoogste niveau. Een lage respiratoire controleverhouding zorgt voor de integriteit van de geïsoleerde mitochondriën.De elektronenstroomtest onderzocht de activiteit van de elektronentransportketencomplexen afzonderlijk of in combinatie door de injectie van specifieke substraten en remmers. Het isoleren van mitochondriën is extreem gevoelig. Daarom moeten alle stappen na weefselmitigatie ijverig en zorgvuldig worden uitgevoerd om hun levensvatbaarheid te behouden.Experimentele assays kunnen worden aangevuld met een deterministische sematische analyse van belangrijke mitochondriale moleculen of met de studie van de assemblage van respirometrische complexen met behulp van blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...