Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Nous tenons à remercier Juan J. Tena pour l’utilisation de l’homogénéisateur et des installations de protéomique et d’élevage CABD pour le soutien technique. Ce travail a été soutenu par le ministère espagnol de l’Éducation, de la Culture et des Sports par le biais de bourses FPU16/03264 à J.D.H.C., l’Association Française contre les Myopathies (AFM) par le biais d’une bourse #22450 à C.V.-G., d’une subvention institutionnelle MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Département de régulation des gènes et morphogenèse au CABD) et BFU2017-83150-P à J.J.C. La bourse P18-RT-4572 de la Junta de Andalucía, le programme de financement FEDER de l’Union européenne et le ministère espagnol de la Science, de l’Innovation et des Universités accordent RED2018-102576-T à P.N.

Le logement des souris et la collecte de tissus ont été effectués à l’aide de protocoles approuvés par le Comité d’éthique de l’Universidad Pablo de Olavide (Séville, Espagne; protocoles 24/04/2018/056 et 12/03/2021/033) conformément au décret royal espagnol 53/2013, à la directive européenne 2010/63/UE et à d’autres directives pertinentes.
1. Préparation des stocks, tampons et réactifs pour les tests respiratoires
<ol><li>Préparez les solutions mère...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Toutes les méthodes utilisées pour étudier la respiration mitochondriale ont leurs limites; par conséquent, il est crucial de choisir la méthode qui convient le mieux à une question expérimentale spécifique. Ce travail fournit un protocole mis à jour et détaillé pour isoler les mitochondries du muscle squelettique de la souris afin d’effectuer différents tests respiratoires pour étudier la fonction mitochondriale. En effet, l’étude de la bioénergétique mitochondriale dans les mitochondries isolées à...

Les mitochondries sont les principaux organites métaboliques de la cellule1. Ces organites spécialisés enfermés dans la membrane utilisent des molécules nutritives pour produire de l’énergie sous forme d’adénosine triphosphate (ATP) par OXPHOS. Ce processus repose sur le transfert d’électrons à partir de molécules donneuses dans une série de réactions redox dans l’ETC2. La CoQ est le seul lipide redox-actif qui est produit de manière endogène dans toutes les membranes cellulaires et les lipoprotéines circulantes qui présente une fonction antioxydante3. C’est un composant essentiel de l’ETC, transférant des électrons du complexe I dépendant du NADH et du complexe II dépendant du FADH2 au complexe III, bien que de nombreuses autres réductases puissent conduire à la réduction de la CoQ mitochondriale en ubiquinol comme une étape obligatoire dans de multiples voies métaboliques cellulaires4,5.
Tout au long du processus, un gradient électrochimique de protons est créé à travers la membrane interne mitochondriale, qui est transformée en énergie biologiquement active par le complexe ATP synthase V2. Par conséquent, le dysfonctionnement mitochondrial conduit à une myriade de conditions pathologiques affectant principalement les tissus ayant des besoins énergétiques élevés - le cerveau, le cœur et les muscles squelettiques6,7. Par conséquent, il est fondamental de développer des méthodes pour analyser avec précision la bioénergétique mitochondriale afin d’étudier son rôle dans la santé et la maladie, en particulier dans les tissus très énergétiques tels que les muscles squelettiques.
L’électrode d’oxygène de type Clark a été classiquement utilisée dans l’étude de la respiration mitochondriale8. Cependant, ce système a été progressivement remplacé par des technologies à plus haute résolution, les technologies de consommation d’oxygène à base de microplaques telles que les analyseurs Agilent Seahorse XF étant particulièrement populaires9. Dans le domaine des muscles squelettiques, ces études sont généralement menées dans des cellules cultivées, principalement dans la lignée cellulaire de myoblastes de souris immortalisés C2C12 ou dans des cultures primaires dérivées de cellules satellites10,11. Cependant, ces études ne récapitulent pas complètement la situation in vivo, en particulier lorsqu’il s’agit d’étudier la biologie mitochondriale et la fonction au niveau tissulaire lors d’insultes spécifiques, d’interventions non génétiques ou de manipulations génétiques.
En outre, les tests respiratoires dans les cellules sont plus complexes en raison de facteurs supplémentaires, notamment la demande extra-mitochondriale d’ATP et de substrats de dosage ou d’événements de signalisation, ce qui pourrait induire en erreur l’interprétation des résultats. Alternativement, il est également possible d’utiliser des myofibres simples ou des faisceaux de myofibres fraîchement isolés provenant des muscles. Cependant, la méthode d’isolement est techniquement difficile et n’est réalisable que pour quelques types de muscles. Dans ce cas, les muscles fléchisseurs digitorum brevis (FDB) et extenseurs digitorum longus (EDL) sont principalement utilisés10,12,13, bien que quelques rapports décrivent également l’utilisation d’autres types de muscles14,15.
Un profilage bioénergétique des sections musculaires squelettiques a également été rapporté16. Le principal avantage de cette méthode est que les muscles intacts peuvent être étudiés (les auteurs montrent que le tranchage à travers les fibres ne perturbe pas les résultats par rapport aux myofibres isolés). Cependant, l’accès mitochondrial aux substrats et aux inhibiteurs de dosage est limité et, par conséquent, seuls quelques paramètres peuvent être mesurés16. Enfin, des mitochondries isolées peuvent également être utilisées9,17,18,19. Dans ce cas, les mitochondries perdent leur environnement cytosolique, ce qui pourrait affecter leur fonction. En revanche, cette méthode garantit l’accès aux substrats et aux inhibiteurs, permet l’analyse d’une pléthore de types d’échantillons et nécessite généralement moins de matériel.
Cet article décrit une méthode pour effectuer le profilage bioénergétique de mitochondries isolées du muscle squelettique de souris à l’aide de tests respirométriques sur microplaques (Figure 1). En particulier, trois protocoles sont détaillés: le test de couplage, CA pour évaluer le degré de couplage entre l’ETC et la machine OXPHOS; le test de flux d’électrons, EFA pour mesurer l’activité des complexes ETC individuels; et le test BOX pour déterminer la capacité mitochondriale de β-oxydation. Notamment, seules de petites quantités d’échantillons sont nécessaires par rapport aux méthodes de respirométrie conventionnelles. Le protocole d’isolement utilisé ici a été modifié par rapport à la méthode publiée ailleurs18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

La majeure partie de l’énergie de la cellule est obtenue par la dégradation du glucose, des acides gras et des acides aminés par différentes voies qui convergent vers le système de phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS), qui est régulé en réponse aux demandes cellulaires. La molécule lipidique Coenzyme Q (CoQ) est essentielle dans ce processus en transférant des électrons au complexe III dans la chaîne de transport d’électrons (ETC) par des cycles constants d’oxydation /réduction. L’état des mitochondries et, en fin de compte, la santé cellulaire peuvent être évalués en mesurant la consommation d’oxygène ETC à l’aide de tests respirométriques. Ces études sont généralement réalisées dans des lignées cellulaires établies ou primaires qui ont été cultivées pendant plusieurs jours. Dans les deux cas, les paramètres respiratoires obtenus peuvent s’être écartés des conditions physiologiques normales dans un organe ou un tissu donné.
De plus, les caractéristiques intrinsèques des fibres simples cultivées isolées du muscle squelettique entravent ce type d’analyse. Cet article présente un protocole mis à jour et détaillé pour l’analyse de la respiration dans les mitochondries fraîchement isolées du muscle squelettique de la souris. Nous fournissons également des solutions aux problèmes potentiels qui pourraient survenir à n’importe quelle étape du processus. La méthode présentée ici pourrait être appliquée pour comparer les taux de consommation d’oxygène dans divers modèles murins transgéniques et étudier la réponse mitochondriale aux traitements médicamenteux ou à d’autres facteurs tels que le vieillissement ou le sexe. C’est une méthode réalisable pour répondre à des questions cruciales sur le métabolisme et la régulation de la bioénergétique mitochondriale.

Le protocole présenté ici permet l’analyse in vivo de la respiration mitochondriale par l’isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris. Un aperçu de la méthode est illustré à la figure 1. Après avoir disséqué les muscles squelettiques des membres postérieurs (Figure 2), les tissus sont homogénéisés et les mitochondries purifiées, dans des conditions isotoniques, par des centrifugations en série. La pureté des diff?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour l’isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris et l’analyse ultérieure de la respiration par taux de consommation d’oxygène (OCR) à l’aide de tests respirométriques sur microplaques. Ce pipeline peut être appliqué pour étudier les effets de multiples interventions environnementales ou génétiques sur le métabolisme mitochondrial.

Isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris pour les tests respirométriques

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Ce mot décrit l’analyse de la respiration dans le traitement des mitochondries du muscle squelettique de la souris. Ce protocole réduit considérablement le temps de purification et permet de traiter plusieurs échantillons simultanément. Les mitochondries d’animaux de n’importe quel sexe d’origine unie peuvent être mutilées à l’aide de ce protocole permettant l’étude de la respiration dans une grande variété de conditions expérimentales.Cette méthode convient à tous les domaines de recherche où la fonction des mitochondries est pertinente, y compris le vieillissement, le dépistage de médicaments, le cancer ou le développement. Il peut même être adapté à d’autres tissus et organismes. Assurez-vous que tous les matériaux sont froids en plaçant tout sur la glace pendant la procédure pour protéger les mitochondries des dommages.Placez trois béchers de 50 millilitres par échantillon sur de la glace et ajoutez 10 millilitres de PBS dans un bécher, 10 millilitres de 10 millilitres EDTA PBS dans le bécher deux et quatre millilitres IB1 dans le bécher trois. Vaporisez le membre postérieur droit d’une souris euthanasiée avec 70% d’éthanol pour empêcher la fourrure de perdre et collez le membre sur la planche de dissection en liège, puis collez le membre avant gauche. Faites une incision avec un scalpel jetable stérile à travers la peau du genou aux orteils.Saisissez la peau avec une pince dentée au niveau de la cheville et coupez-la avec de fins ciseaux autour de la cheville. Éloignez la peau de la musculature sous-jacente avec une pince à épiler fine dans une main tout en la tirant vers le haut avec des pinces dentées dans l’autre main. Disséquez tous les muscles squelettiques de la cheville au genou et retirez tout le tissu conjonctif sur le muscle antérieur du tibialis à l’aide d’une pince à épiler fine et de ciseaux.Trouvez les quatre tendons distaux du muscle extenseur digitorum longus et coupez-les près de leurs insertions dans les orteils. Localisez le tendon distal antérieur tibialis et coupez-le près de son insertion sous la cheville. Tirez les tendons tibialis antérieur et extenseur digitorum longus au-dessus de la cheville pour libérer les extrémités lâches.Saisissez les extrémités lâches des tendons et éloignez les muscles du reste de la musculature dans les os en les tirant vers le haut. Coupez les tendons proximaux de ces muscles le plus près possible de la rotule. Tournez la souris à l’envers pour procéder à l’extraction musculaire gastrocnémienne et soléaire.Saisissez la poche formée entre les biceps, les fémoris et le gastrocnémien et séparez ces muscles à l’aide de ciseaux fins pour visualiser le tendon gastrocnémien proximal. Saisissez et coupez soigneusement le tendon d’Achille distal avec de fins ciseaux. Coupez le tendon gastrocnémien proximal en le libérant avec le soléaire sous-jacent.Disséquez soigneusement les muscles restants et épinglez à nouveau la souris dans la position initiale pour disséquer le muscle quadriceps. Jetez le tissu adipeux puis insérez une pince à épiler fine entre le quadriceps et le fémur pour séparer le muscle de l’os. Saisissez les tendons musculaires du quadriceps distal et coupez le tendon le plus près possible de la rotule.Tirez les quadriceps vers le haut et libérez-les avec de fins ciseaux à l’insertion proximale. Répétez la même chose pour le membre postérieur gauche. Rincez tous les muscles dans le bécher un, puis deux, suivi du bécher trois.Enfin, hachez tous les muscles dans le bécher trois avec des ciseaux tranchants sur la glace. Transférez la suspension dans un tube C, fermez-la hermétiquement et fixez-la à l’envers sur le manchon de l’homogénéisateur. Diviser l’homogénat en deux tubes de microcentrifugation pré-refroidis de 2 millilitres et centrifuger pendant 10 minutes.Ensuite, transférez le surnageant dans de nouveaux tubes pré-réfrigérés et centrifugez pendant encore 10 minutes. Combinez la pastille dans 500 microlitres d’IB2 Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidis de 2 millilitres et étiquetez-le comme surnageant numéro deux, ou SN2. Re suspendre la pastille mitochondriale finale dans 200 microlitres de tampon de ressis.Mettez rapidement de côté 10 microlitres pour la quantification des protéines et ajoutez immédiatement 10 microlitres de 10% de BSA FFA à la suspension mitochondriale restante pour éviter tout dommage. Centrifuger la suspension mitochondriale concentrée à 10 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Re suspendre la pastille mitochondriale dans 100 microlitres de milieu d’essai de couplage 1X avec BSA, 1X milieu de test de flux d’électrons avec BSA, ou 1X milieu d’oxydation bêta avec BSA, selon le protocole à effectuer.Diluer cet échantillon mitochondrial concentré à 0,2 microgramme par microlitre en utilisant le milieu d’essai correspondant. Ensemencez 50 microlitres de la suspension par puits dans une microplaque pré-réfrigérée de 24 puits sur glace. Dans les puits de correction de fond, ajoutez uniquement le milieu d’essai correspondant.Conservez la suspension mitochondriale restante à moins 80 degrés Celsius pour la détermination de la pureté de la fragmentation. Faire tourner la microplaque dans la centrifugeuse préparative pré-réfrigérée pendant 20 minutes. En attendant, réchauffez le milieu d’essai restant à 37 degrés Celsius.Après centrifugation, laissez la microplaque sur le banc pendant cinq minutes pour équilibrer. Ajouter 450 microlitres du milieu d’essai chaud par puits lentement et soigneusement pour éviter le détachement des mitochondries. Placez la microplaque immédiatement dans l’instrument de mesure de la consommation d’oxygène sans le couvercle et démarrez le programme de mesure.Assurez-vous que la première étape est une incubation de 10 minutes pour permettre à la microplaque de se réchauffer. Une fois l’expérience terminée, retirez la cartouche et la microplaque, éteignez l’instrument et commencez l’analyse. Les profils protéiques généraux des différentes fractions obtenues par centrifugations en série ont montré des populations protéiques distinctes dans les fractions isolées.La présence de tout le contenu mitochondrial est évidente par les signaux forts pour les marqueurs de la membrane mitochondriale externe et interne et des protéines associées aux nucléoïdes. La fraction N représente les noyaux et le matériau non perturbé. La plupart des marqueurs du réticulum endoplasmique, de la membrane plasmique ou du cytoplasme dans les fractions SN1 ou SN2 mettent en évidence la grande pureté obtenue lors de l’isolement.Une augmentation de la consommation d’oxygène a été observée après l’ajout d’ADP dans les essais de couplage et d’oxydation bêta. Après l’ajout de cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxy phénylhydrazone, la consommation d’oxygène a atteint son plus haut niveau. Un faible rapport de contrôle respiratoire assure l’intégrité des mitochondries isolées.Le test de flux d’électrons a examiné l’activité des complexes de chaîne de transport d’électrons individuellement ou en combinaison par l’injection de substrats et d’inhibiteurs spécifiques. Les mitochondries isolantes sont extrêmement sensibles. Par conséquent, toutes les étapes après l’atténuation des tissus doivent être effectuées avec diligence et soin pour préserver leur viabilité.Les essais expérimentaux peuvent être complétés par une analyse sématique déterministe des molécules clés des mitochondries ou par l’étude de l’assemblage de complexes respirométriques à l’aide de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adultes et embryonnaires Culture squelettique Microexplant musculaire et isolement de cellules souches du muscle squelettique

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Recherche

Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Isolement mitochondriale du muscle squelettique

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-infligé des blessures de poisson zèbre muscle squelettique embryonnaire

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...