Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
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Wir danken Juan J. Tena für den Einsatz des Homogenisators und der CABD Proteomics and Animal Husbandry Einrichtungen für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom spanischen Ministerium für Bildung, Kultur und Sport durch ein Stipendium FPU16/03264 an J.D.H.C., die Association Française contre les Myopathies (AFM) durch Fellowship Grant #22450 an C.V.-G., ein Institutional Grant MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) und BFU2017-83150-P an J.J.C unterstützt. Der Junta de Andalucía-Zuschuss P18-RT-4572, das RENDER-Förderprogramm der Europäischen Union und das spanische Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten gewähren RED2018-102576-T an P.N.

Mausgehäuse und Gewebeentnahme wurden unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die von der Ethikkommission der Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Spanien; Protokolle 24/04/2018/056 und 12/03/2021/033) in Übereinstimmung mit dem spanischen Königlichen Dekret 53/2013, der europäischen Richtlinie 2010/63/EU und anderen relevanten Richtlinien genehmigt wurden.
1. Vorbereitung von Beständen, Puffern und Reagenzien für die Atmungstests
<ol><li>Bereiten Sie die fol...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. 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Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Alle Methoden, die zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung verwendet werden, haben ihre Grenzen; Daher ist es entscheidend, die Methode auszuwählen, die am besten zu einer bestimmten experimentellen Fragestellung passt. Diese Arbeit bietet ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll zur Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus, um verschiedene Atemassays zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion durchzuführen. Tatsächlich ist die Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik in isolie...

Mitochondrien sind die primären Stoffwechselorganellen in der Zelle1. Diese spezialisierten membranumschlossenen Organellen verwenden Nährstoffmoleküle, um Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) von OXPHOS zu erzeugen. Dieser Prozess beruht auf dem Transfer von Elektronen aus Donormolekülen in einer Reihe von Redoxreaktionen im ETC2. CoQ ist das einzige redoxaktive Lipid, das endogen in allen Zellmembranen und zirkulierenden Lipoproteinen produziert wird und eine antioxidative Funktion zeigt3. Es ist ein wesentlicher Bestandteil des ETC und überträgt Elektronen vom NADH-abhängigen Komplex I und FADH2-abhängigen Komplex II auf den Komplex III, obwohl viele andere Reduktasen die Reduktion von mitochondrialem CoQ zu Ubiquinol als obligatorischen Schritt in mehreren zellulären Stoffwechselwegen vorantreiben können4,5.
Während des gesamten Prozesses wird ein elektrochemischer Protonengradient über die mitochondriale innere Membran erzeugt, der durch den ATP-Synthasekomplex V2 in biologisch aktive Energie umgewandelt wird. Folglich führt die mitochondriale Dysfunktion zu einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, die hauptsächlich Gewebe mit hohem Energiebedarf betreffen - Gehirn, Herz und Skelettmuskulatur6,7. Daher ist es von grundlegender Bedeutung, Methoden zur genauen Analyse der mitochondrialen Bioenergetik zu entwickeln, um ihre Rolle bei Gesundheit und Krankheit zu untersuchen, insbesondere in hochenergetischen Geweben wie der Skelettmuskulatur.
Die Clark-Sauerstoffelektrode wurde klassischerweise bei der Untersuchung der mitochondrialen Atmung8 verwendet. Dieses System wurde jedoch zunehmend durch Technologien mit höherer Auflösung ersetzt, wobei mikroplattenbasierte Sauerstoffverbrauchstechnologien wie Agilent Seahorse XF-Analysatoren besonders beliebt sind9. Im Bereich der Skelettmuskulatur werden diese Studien typischerweise in kultivierten Zellen durchgeführt, hauptsächlich in der C2C12-immortalisierten Maus-Myoblasten-Zelllinie oder Primärkulturen, die von Satellitenzellen abgeleitet wurden10,11. Diese Studien rekapitulieren die Situation jedoch nicht vollständig in vivo, insbesondere bei der Untersuchung der mitochondrialen Biologie und der Funktion auf Gewebeebene bei spezifischen Beleidigungen, nichtgenetischen Eingriffen oder genetischen Manipulationen.
Darüber hinaus sind die Atmungstests in Zellen aufgrund zusätzlicher Faktoren komplexer, einschließlich des extramitochondrialen Bedarfs an ATP- und Assay-Substraten oder Signalereignissen, die die Interpretation der Ergebnisse in die Irre führen könnten. Alternativ ist es auch möglich, einzelne oder Bündel von frisch isolierten Myofasern aus Muskeln zu verwenden. Die Isolationsmethode ist jedoch technisch anspruchsvoll und nur für wenige Muskeltypen machbar. In diesem Fall werden hauptsächlich die Muskeln Flexor digitorum brevis (FDB) und Extensor digitorum longus (EDL) verwendet10,12,13, obwohl einige Berichte auch die Verwendung anderer Muskeltypen beschreiben14,15.
Eine bioenergetische Profilierung von Skelettmuskelabschnitten wurde ebenfalls berichtet16. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass intakte Muskeln untersucht werden können (die Autoren zeigen, dass das Durchschneiden von Fasern die Ergebnisse im Vergleich zu isolierten Myofasern nicht stört). Der mitochondriale Zugang zu Substraten und Assay-Inhibitoren ist jedoch begrenzt, so dass nur wenige Parameter gemessen werden können16. Schließlich können auch isolierte Mitochondrien eingesetzt werden9,17,18,19. In diesem Fall verlieren Mitochondrien ihre zytosolische Umgebung, was ihre Funktion beeinträchtigen könnte. Im Gegensatz dazu garantiert diese Methode den Zugang zu Substraten und Inhibitoren, ermöglicht die Analyse einer Vielzahl von Probentypen und benötigt typischerweise weniger Material.
Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Durchführung der bioenergetischen Profilierung von isolierten Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays (Abbildung 1). Insbesondere werden drei Protokolle detailliert beschrieben: der Coupling Assay, CA zur Beurteilung des Grades der Kopplung zwischen der ETC- und der OXPHOS-Maschine; der Elektronenfluss-Assay, EFA zur Messung der Aktivität der einzelnen ETC-Komplexe; und der BOX-Assay zur Bestimmung der mitochondrialen β-Oxidationskapazität. Bemerkenswert ist, dass im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Respirometrie nur geringe Mengen an Proben benötigt werden. Das hier verwendete Isolationsprotokoll wurde gegenüber der an anderer Stelle veröffentlichten Methode geändert18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

Der größte Teil der Energie der Zelle wird durch den Abbau von Glukose, Fettsäuren und Aminosäuren über verschiedene Wege gewonnen, die auf dem mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungssystem (OXPHOS) zusammenlaufen, das als Reaktion auf zelluläre Anforderungen reguliert wird. Das Lipidmolekül Coenzym Q (CoQ) ist in diesem Prozess essentiell, indem es Elektronen durch konstante Oxidations- / Reduktionszyklen in den Komplex III in der Elektronentransportkette (ETC) überträgt. Der Zustand der Mitochondrien und letztendlich die Zellgesundheit können durch Messung des ETC-Sauerstoffverbrauchs mithilfe von respirometrischen Assays beurteilt werden. Diese Studien werden typischerweise in etablierten oder primären Zelllinien durchgeführt, die mehrere Tage lang kultiviert wurden. In beiden Fällen können die erhaltenen Atmungsparameter von den normalen physiologischen Bedingungen in einem bestimmten Organ oder Gewebe abgewichen sein.
Darüber hinaus behindern die intrinsischen Eigenschaften von kultivierten Einzelfasern, die aus der Skelettmuskulatur isoliert wurden, diese Art der Analyse. Dieses Papier stellt ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll für die Analyse der Atmung in frisch isolierten Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus vor. Wir bieten auch Lösungen für potenzielle Probleme, die in jedem Schritt des Prozesses auftreten können. Die hier vorgestellte Methode könnte angewendet werden, um Sauerstoffverbrauchsraten in verschiedenen transgenen Mausmodellen zu vergleichen und die mitochondriale Reaktion auf medikamentöse Behandlungen oder andere Faktoren wie Altern oder Geschlecht zu untersuchen. Dies ist eine praktikable Methode, um auf entscheidende Fragen zum mitochondrialen bioenergetischen Stoffwechsel und zur Regulation zu antworten.

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die In-vivo-Analyse der mitochondrialen Atmung durch die Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus. Ein Überblick über die Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Sezierung der Skelettmuskulatur von den Hinterbeinen (Abbildung 2) werden die Gewebe homogenisiert und die Mitochondrien unter isotonischen Bedingungen durch serielle Zentrifugationen gereinigt. Die Reinheit der versc...

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Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Dieses Wort beschreibt die Atmungsanalyse bei der Verarbeitung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus. Dieses Protokoll reduziert die Reinigungszeit erheblich und ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Proben. Mitochondrien von Tieren eines beliebigen Geschlechts mit vereintem Hintergrund können mit diesem Protokoll verstümmelt werden, was die Untersuchung der Atmung unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen ermöglicht.Diese Methode eignet sich für alle Forschungsbereiche, in denen die Funktion der Mitochondrien relevant ist, einschließlich Alterung, Drogentests, Krebs oder Entwicklung. Es kann sogar an andere Gewebe und Organismen angepasst werden. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien kalt sind, indem Sie während des Vorgangs alles auf das Eis legen, um die Mitochondrien vor Schäden zu schützen.Legen Sie drei 50-Milliliter-Bechergläser pro Probe auf Eis und fügen Sie 10 Milliliter PBS in Becherglas eins, 10 Milliliter 10 Millimolar EDTA PBS in Becherglas zwei und vier Milliliter IB1 in Becherglas drei hinzu. Besprühen Sie das rechte Hinterteil einer eingeschläferten Maus mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell abfällt, und kleben Sie das Glied an das Kork-Sezierbrett und kleben Sie dann das linke vordere Glied ab. Machen Sie einen Schnitt mit einem sterilen Einwegskalpell durch die Haut vom Knie bis zu den Zehen.Greifen Sie die Haut mit einer gezähnten Pinzette auf Knöchelhöhe und schneiden Sie sie mit einer feinen Schere um den Knöchel. Erleichtern Sie die Haut von der darunter liegenden Muskulatur mit einer feinen Pinzette in der einen Hand, während Sie sie mit einer Zahnzange in der anderen Hand hochziehen. Sezieren Sie alle Skelettmuskeln vom Knöchel bis zum Knie und entfernen Sie das gesamte Bindegewebe über dem vorderen Musculus tibialis mit einer feinen Pinzette und Schere.Finden Sie die vier distalen Sehnen des Musculus extensor digitorum longus und schneiden Sie sie in der Nähe ihrer Insertionen in den Zehen. Suchen Sie die vordere distale Sehne von Tibialis und schneiden Sie sie in der Nähe ihres Einführens unterhalb des Knöchels ab. Ziehen Sie die Sehnen Tibialis anterior und Extensor digitorum longus über den Knöchel, um die losen Enden zu befreien.Greifen Sie die losen Enden der Sehnen und entspannen Sie die Muskeln vom Rest der Muskulatur in den Knochen, indem Sie sie hochziehen. Schneiden Sie die proximalen Sehnen dieser Muskeln so nah wie möglich an der Kniescheibe ab. Drehen Sie die Maus auf den Kopf, um mit der Extraktion von Gastrocnemius und Soleus fortzufahren.Greifen Sie die Tasche zwischen dem Bizeps, Femoris und dem Gastrocnemius und trennen Sie diese Muskeln mit einer feinen Schere, um die proximale Gastrocnemius-Sehne zu visualisieren. Greifen und schneiden Sie die distale Achillessehne vorsichtig mit einer feinen Schere ab. Schneiden Sie die proximale Gastrocnemius-Sehne ab und befreien Sie sie mit dem darunter liegenden Soleus.Sezieren Sie vorsichtig die verbleibenden Muskeln und fixieren Sie die Maus in der Ausgangsposition erneut, um den Quadrizepsmuskel zu sezieren. Entsorgen Sie das Fettgewebe und führen Sie dann eine feine Pinzette zwischen den Quadrizeps und den Femur ein, um den Muskel vom Knochen zu trennen. Greifen Sie die distalen Quadrizeps-Muskelsehnen und schneiden Sie die Sehne so nah wie möglich an die Kniescheibe.Ziehen Sie den Quadrizeps nach oben und befreien Sie ihn mit einer feinen Schere am proximalen Einführen. Wiederholen Sie dasselbe für das linke Hinterbein. Spülen Sie alle Muskeln in Becherglas eins, dann zwei, gefolgt von Becher drei.Zum Schluss hacken Sie alle Muskeln in Becherglas drei mit einer scharfen Schere auf Eis. Legen Sie die Aufhängung auf ein C-Rohr, schließen Sie es fest und befestigen Sie es kopfüber an der Hülse des Homogenisators. Teilen Sie das Homogenat in zwei 2 Milliliter vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie für 10 Minuten.Dann den Überstand für weitere 10 Minuten in neue vorgekühlte Röhrchen und Zentrifuge überführen. Kombinieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern IB2 Übertragen Sie den Überstand auf ein neues vorgekühltes 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und kennzeichnen Sie es als Überstand Nummer zwei oder SN2. Suspendiert das letzte mitochondriale Pellet in 200 Mikrolitern Respensionspuffer.Stellen Sie schnell 10 Mikroliter für die Proteinquantifizierung zur Verfügung und fügen Sie sofort 10 Mikroliter 10% FFA BSA zur verbleibenden mitochondrialen Suspension hinzu, um Schäden zu vermeiden. Die konzentrierte mitochondriale Suspension bei 10.500 mal G zentrifugieren für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Suspendieren Sie das mitochondriale Pellet in 100 Mikrolitern 1X Kopplungsassaymedium mit BSA, 1X Elektronenfluss-Assay-Medium mit BSA oder 1X Beta-Oxidationsmedium mit BSA, abhängig vom durchzuführenden Protokoll.Verdünnen Sie diese konzentrierte mitochondriale Probe mit dem entsprechenden Assay-Medium auf 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter. Samen Sie 50 Mikroliter der Suspension pro Vertiefung in einer vorgekühlten 24-Well-Mikroplatte auf Eis. Fügen Sie in den Hintergrundkorrekturwellen nur das entsprechende Assay-Medium hinzu.Lagern Sie die verbleibende mitochondriale Suspension bei minus 80 Grad Celsius, um die Reinheit der Fragmentierung zu bestimmen. Drehen Sie die Mikroplatte in der vorgekühlten präparativen Zentrifuge für 20 Minuten. In der Zwischenzeit den verbleibenden Assay auf 37 Grad Celsius erwärmen.Lassen Sie die Mikroplatte nach der Zentrifugation fünf Minuten lang auf der Bank, um sich auszugleichen. Fügen Sie 450 Mikroliter des warmen Assay-Mediums pro Vertiefung langsam und vorsichtig hinzu, um eine Ablösung der Mitochondrien zu vermeiden. Legen Sie die Mikroplatte sofort in das Sauerstoffverbrauchsmessgerät ohne Deckel und starten Sie das Messprogramm.Stellen Sie sicher, dass der erste Schritt eine 10-minütige Inkubation ist, damit sich die Mikroplatte erwärmen kann. Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie die Kartusche und die Mikroplatte, schalten Sie das Gerät aus und starten Sie die Analyse. Allgemeine Proteinprofile aus den verschiedenen Fraktionen, die durch serielle Zentrifugationen erhalten wurden, zeigten unterschiedliche Proteinpopulationen in den isolierten Fraktionen.Das Vorhandensein des gesamten mitochondrialen Inhalts wird durch die starken Signale für Marker der äußeren und inneren mitochondrialen Membran und der nukleoidassoziierten Proteine deutlich. Fraktion N steht für Kerne und ungestörtes Material. Die meisten endoplasmatischen Retikulum-, Plasmamembran- oder Zytoplasmamarker in den SN1- oder SN2-Fraktionen unterstreichen die hohe Reinheit, die während der Isolierung erhalten wird.Ein Anstieg des Sauerstoffverbrauchs wurde nach ADP-Zugabe in den Kopplungs- und Beta-Oxidationsassays beobachtet. Nach der Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon-Zugabe erreichte der Sauerstoffverbrauch seinen höchsten Niveau. Ein niedriges Atemkontrollverhältnis gewährleistet die Integrität der isolierten Mitochondrien.Der Elektronenflussassay untersuchte die Aktivität der Elektronentransportkettenkomplexe einzeln oder in Kombination durch die Injektion spezifischer Substrate und Inhibitoren. Isolierende Mitochondrien sind extrem empfindlich. Daher müssen alle Schritte nach der Gewebeminderung sorgfältig und sorgfältig durchgeführt werden, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.Experimentelle Assays können durch eine deterministische sematische Analyse wichtiger Mitochondrienmoleküle oder durch die Untersuchung der Montage respirometrischer Komplexe unter Verwendung der blauen nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese ergänzt werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Forschung

Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...