Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

אנו רוצים להודות לחואן ג'יי טנה על השימוש בהומוגניזר ובמתקני הפרוטאומיקה של CABD וגידול בעלי חיים על תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, התרבות והספורט הספרדי באמצעות מלגה FPU16/03264 ל- J.D.H.C., האגודה Française contre les Myopathies (AFM) באמצעות מענק מלגה #22450 ל- C.V.-G., מענק מוסדי MDM-2016-0687 (יחידת המצוינות מריה דה מאזטו, המחלקה לרגולציה גנטית ומורפוגנזה ב- CABD) ו- BFU2017-83150-P ל- J.J.C. מענק החונטה דה אנדלוסיה P18-RT-4572, תוכנית המימון של FEDER מהאיחוד האירופי, ומשרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי מעניקים RED2018-102576-T ל- P.N.

איסוף דיור ורקמות של עכברים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה פבלו דה אולביד (סביליה, ספרד; פרוטוקולים 24/04/2018/056 ו-12/03/2021/033) בהתאם לצו המלכותי הספרדי 53/2013, הוראה אירופית 2010/63/EU, והנחיות רלוונטיות אחרות.
1. הכנת מניות, חוצצים, ריאגנטים לבדיקות ה?...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

לכל השיטות המשמשות לחקר הנשימה המיטוכונדריאלית יש מגבלות; לפיכך, חשוב לבחור את השיטה המתאימה ביותר לשאלה ניסיונית ספציפית. עבודה זו מספקת פרוטוקול מעודכן ומפורט כדי לבודד את המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר כדי לבצע בדיקות נשימה שונות כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה. ואכן, המחקר של ביו-א?...

המיטוכונדריה הם האברונים המטבוליים העיקריים בתא1. אברונים מיוחדים אלה סגורים ממברנה להשתמש במולקולות מזין כדי לייצר אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) על ידי OXPHOS. תהליך זה מסתמך על העברת אלקטרונים ממולקולות תורמות בסדרה של תגובות redox ב ETC2. CoQ הוא השומנים הפעילים היחידים המיוצרים באופן אנדוגני בכל הקרומים התאיים וליפופרוטאינים במחזור שמראה תפקוד נוגד חמצון3. זהו מרכיב חיוני של ETC, העברת אלקטרונים מ NADH תלוי קומפלקס I ו FADH2 תלוי קומפלקס II מורכב מורכב III מורכב, אם כי צמצומים רבים אחרים יכולים להניע את ההפחתה של CoQ מיטוכונדריאלי ליוביקינול כצעד חובה במסלולים מטבוליים תאיים מרובים4,5.
לאורך כל התהליך, שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי נוצר על פני הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית, אשר הופכת לאנרגיה פעילה ביולוגית על ידי V2 קומפלקס סינתאז ATP. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מוביל למספר עצום של מצבים פתולוגיים המשפיעים בעיקר על רקמות עם דרישות אנרגיה גבוהה - המוח, הלב, ושרירי השלד6,7. לכן, זה בסיסי לפתח שיטות לנתח במדויק ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית כדי לחקור את תפקידה בבריאות ובמחלות, במיוחד ברקמות אנרגטיות מאוד כגון שרירי השלד.
אלקטרודת חמצן מסוג קלארק שימשה באופן קלאסי במחקר של נשימה מיטוכונדריאלית8. עם זאת, מערכת זו נעקרה בהדרגה על ידי טכנולוגיות ברזולוציה גבוהה יותר, עם טכנולוגיות צריכת חמצן מבוססות מיקרופלט כגון מנתחי סוסון ים XF Agilent להיות פופולרי במיוחד9. בשדה שרירי השלד, מחקרים אלה מתנהלים בדרך כלל בתאים מתורבתים, בעיקר בקו התאים של העכבר המונצח C2C12 או בתרביות ראשוניות שמקורן בתאי לווין10,11. עם זאת, מחקרים אלה אינם מסכמים באופן מלא את המצב ב- vivo, במיוחד כאשר חוקרים ביולוגיה מיטוכונדריאלית ותפקוד ברמת הרקמה על עלבונות ספציפיים, התערבויות לא גנטיות או מניפולציות גנטיות.
יתר על כן, בדיקות נשימה בתאים מורכבות יותר בשל גורמים נוספים, כולל דרישה חוץ-מיטוכונדריאלית של ATP ומצעים לבדיקה או אירועי איתות, אשר עלול להטעות את הפרשנות של התוצאות. לחלופין, ניתן גם להשתמש יחיד או חבילות של myofibers מבודד טרי מן השרירים. עם זאת, שיטת הבידוד מאתגרת מבחינה טכנית ואפשרית רק עבור כמה סוגי שרירים. במקרה זה, flexor digitorum brevis (FDB) ו- extensor digitorum longus השרירים (EDL) משמשים בעיקר 10,12,13, אם כי כמה דיווחים מתארים את השימוש בסוגי שרירים אחרים, כמו גם 14,15.
פרופיל ביו-אנרגטי של מקטעי שרירי שלד דווח גם הוא16. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי שרירים שלמים ניתן ללמוד (המחברים מראים כי חיתוך דרך סיבים אינו מפריע לתוצאות בהשוואה myofibers מבודד). עם זאת, הגישה המיטוכונדריאלית למצעים ומעכבי בדיקה מוגבלת, ולכן, רק כמה פרמטרים ניתן למדוד16. לבסוף, מיטוכונדריה מבודדת יכולה להיות מועסקת גם 9,17,18,19. במקרה זה, המיטוכונדריה מאבדת את הסביבה הציטוטוסולית שלהם, מה שעלול להשפיע על תפקודם. לעומת זאת, שיטה זו מבטיחה גישה למצעים ומעכבים, מאפשרת ניתוח של שפע של סוגי מדגמים, ובדרך כלל דורשת פחות חומר.
מאמר זה מתאר שיטה לביצוע הפרופיל הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה המבודדת משריר השלד של העכבר באמצעות בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרופלסטיק (איור 1). בפרט, שלושה פרוטוקולים מפורטים: בדיקת צימוד, CA כדי להעריך את מידת הצימוד בין ETC ומכונות OXPHOS; אסאי זרימת האלקטרונים, EFA כדי למדוד את הפעילות של מתחמי ETC בודדים; ואת הבדיקה BOX כדי לקבוע את יכולת חמצון β מיטוכונדריאלי. ראוי לציין, רק כמויות קטנות של דגימות נדרשות בהשוואה לשיטות נשימה קונבנציונליות. פרוטוקול הבידוד המשמש כאן שונה מהשיטה שפורסמה במקום אחר18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

רוב האנרגיה של התא מתקבלת באמצעות השפלה של גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו על ידי מסלולים שונים המתכנסים על מערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS), אשר מוסדר בתגובה לדרישות הסלולר. מולקולת השומנים קואנזים Q (CoQ) חיונית בתהליך זה על ידי העברת אלקטרונים ל- III מורכב בשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) באמצעות מחזורי חמצון/הפחתה קבועים. מצב המיטוכונדריה, ובסופו של דבר, בריאות התא ניתן להעריך על ידי מדידת צריכת חמצן ETC באמצעות בדיקות respirometric. מחקרים אלה מבוצעים בדרך כלל בשורות תא מבוססות או ראשוניות אשר היו בתרבית במשך מספר ימים. בשני המקרים, הפרמטרים של הנשימה שהושגו עשויים לסטות ממצבים פיזיולוגיים רגילים בכל איבר או רקמה נתון.
בנוסף, המאפיינים המהותיים של סיבים בודדים מתורבתים המבודדים משרירי השלד מעכבים סוג זה של ניתוח. מאמר זה מציג פרוטוקול מעודכן ומפורט לניתוח נשימה במיטוכונדריה מבודדת טרייה משריר השלד של העכבר. אנו מספקים גם פתרונות לבעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר בכל שלב של התהליך. השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעורי צריכת החמצן במודלים שונים של עכבר מהונדס וללמוד את התגובה המיטוכונדריאלית לטיפולים תרופתיים או גורמים אחרים כגון הזדקנות או מין. זוהי שיטה אפשרית להגיב לשאלות מכריעות על חילוף החומרים והרגולציה הביו-אנרגטית המיטוכונדריאלית.

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ניתוח in vivo של נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות בידוד של המיטוכונדריה משריר שלד העכבר. חלוקה לרמות של השיטה מוצגת באיור 1. לאחר ניתוח שרירי השלד מההינדלימבים (איור 2), הרקמות הומוגניות והמיטוכונדריה מטוהרת, בתנאים איזוטוניים, באמצ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

מילה זו מתארת ניתוח נשימה בעיבוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר. פרוטוקול זה מפחית במידה ניכרת את זמן הטיהור ומאפשר עיבוד של דגימות מרובות בו-זמנית. מיטוכונדריה מבעלי חיים בכל שמונה מינים של רקע מאוחד ניתן להשחתה באמצעות פרוטוקול זה המאפשר את חקר הנשימה במגוון רחב של תנאים ניסיוניים.שיטה זו מתאימה לכל תחומי המחקר שבהם תפקוד המיטוכונדריה רלוונטי כולל הזדקנות, בדיקות סמים, סרטן או פיתוח. זה יכול אפילו להיות מותאם לרקמות ואורגניזמים אחרים גם כן. ודא שכל החומרים קרים על ידי הנחת הכל על הקרח במהלך ההליך כדי להגן על המיטוכונדריה מפני נזק.מניחים שלוש כוסות 50 מיליליטר לכל מדגם על קרח ומוסיפים 10 מיליליטר של PBS בכוס אחת, 10 מיליליטר של 10 מילימטרים EDTA PBS בכוס שתיים, וארבעה מיליליטר IB1 בכוס שלוש. לרסס את הגפה האחורית הימנית של עכבר מורדם עם 70% אתנול כדי למנוע פרווה לשפוך ולהדביק את האיבר ללוח כריתת הפקק ולאחר מכן להדביק את איבר החזית השמאלית. בצע חתך עם אזמל חד פעמי סטרילי דרך העור מכף רגל ועד ראש.לאחוז את העור עם מלקחיים שיניים בגובה הקרסול לחתוך אותו עם מספריים עדינים סביב הקרסול. הקלו את העור הרחק מהשרירים שמתחתיו עם פינצטה עדינה ביד אחת תוך משיכתו למעלה עם מלקחיים בעלי שיניים ביד השנייה. לנתח את כל שרירי השלד מהקרסול לברך ולהסיר את כל רקמת החיבור מעל השריר הקדמי tibialis באמצעות פינצטה עדינה ומספריים.מצא את ארבעת הגידים הדיסטליים של שריר longus ארוך digittensor digitoror extensor ולחתוך אותם קרוב הוספות שלהם בהונות. אתר את הגיד הדיסטלי הקדמי של טיביאליס וחתוך אותו קרוב להכנסתו מתחת לקרסול. משוך את הגידים הקדמיים וההרחבה של digitorum longus מעל הקרסול כדי לשחרר את הקצוות הרופפים.לאחוז את הקצוות הרופפים של הגידים ולהקל על השרירים הרחק משאר השרירים בעצמות על ידי משיכתם למעלה. חותכים את הגידים הפרוקסימליים של השרירים האלה קרוב ככל האפשר לפיקת הברך. הפוך את העכבר כדי להמשיך עם גסטרוקנימוס ומיצוי שריר סולוס.לאחוז בכיס שנוצר בין שרירי הזרוע, עצם הירך, ואת gastrocnemius ולהפריד את השרירים האלה באמצעות מספריים עדינים כדי לדמיין את גיד gastrocnemius הפרוקסימלי. לאחוז ולחתוך בזהירות את גיד אכילס דיסטלי עם מספריים עדינות. חותכים את גיד הגסטרוקנמיוס הפרוקסימלי ומשחררים אותו עם הסוליה הבסיסית.בזהירות לנתח את השרירים הנותרים ולהצמיד מחדש את העכבר במיקום הראשוני כדי לנתח את שריר הארבע ראשי. להשליך את רקמת השומן ולאחר מכן להכניס פינצטה עדינה בין quadriceps ואת עצם הירך כדי להפריד את השריר מן העצם. אוחזים בגידי השרירים של שריר הארבע ראשי הדיסטלי וחותכים את הגיד קרוב ככל האפשר לפיקת הברך.משכו את שריר הארבע ראשי למעלה ושחררו אותם עם מספריים עדינות בהכנסה הפרוקסימלית. חזור על אותו הדבר עבור הגפה האחורית השמאלית. לשטוף את כל השרירים בכוס אחת, אז שתיים, ואחריו שלוש.לבסוף, לטחון את כל השרירים בכוס שלוש עם מספריים חדים על קרח. מעבירים את ההשעיה לצינור C, סוגרים אותו בחוזקה, ומצמידים אותו הפוך על שרוול ההומוגניזר. מחלקים את ההומוגנט לשני צינורות מיקרו צנטריפוגות מיקרו מצוננים מראש 2 מיליליטר וצנטריפוגה במשך 10 דקות.לאחר מכן להעביר את supernatant לצינורות מצוננים מראש חדשים צנטריפוגה במשך 10 דקות נוספות. שלבו את הכדור ב-500 מיקרוליטרים של IB2 העבירו את הסופר-נרטיב לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש של 2 מיליליטר שצונן מראש ותייגו אותו כמספר שתיים על-טבעי, או SN2. להשעות מחדש את הכדור המיטוכונדריאלי הסופי ב 200 מיקרוליטרים של חיץ השעיה מחדש.הקצו במהירות 10 מיקרוליטרים לכימות חלבונים והוסיפו מיד 10 מיקרוליטרים של 10% FFA BSA למתלים המיטוכונדריאליים הנותרים כדי למנוע נזק. צנטריפוגה ההשעיה המיטוכונדריאלית המרוכזת ב 10, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשעות מחדש את הכדור המיטוכונדריאלי ב 100 microliters של 1X צימוד בדיקת מדיום עם BSA, 1X זרימת אלקטרונים בדיקת מדיום עם BSA, או 1X בטא חמצון מדיום עם BSA, בהתאם לפרוטוקול להתבצע.לדלל מדגם מיטוכונדריאלי מרוכז זה ל 0.2 מיקרוגרם לכל מיקרוליטר באמצעות מדיום הבדיקה המתאים. זרע 50 מיקרוליטרים של ההשעיה לבאר בצלחת מיקרו 24 מצוננת מראש על קרח. בבארות תיקון הרקע, הוסף את מדיום הבדיקה המתאים בלבד.יש לאחסן את ההשעיה המיטוכונדריאלית הנותרת במינוס 80 מעלות צלזיוס לקביעת טוהר הפיצול. מסובבים את צלחת המיקרו בצנטריפוגה הכנה מצוננת מראש במשך 20 דקות. בינתיים, לחמם את המדיום הבדיקה הנותרת עד 37 מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה, להשאיר את צלחת מיקרו על הספסל במשך חמש דקות כדי שיווי משקל. הוסף 450 מיקרוליטרים של מדיום הבדיקה החמה לבאר לאט ובזהירות כדי למנוע ניתוק של המיטוכונדריה. מניחים את צלחת המיקרו מיד במכשיר מדידת צריכת החמצן ללא המכסה ולהתחיל את תוכנית המדידה.ודא כי הצעד הראשון הוא דגירה של 10 דקות כדי לאפשר לצלחת המיקרו להתחמם. לאחר סיום הניסוי, הסר את המחסנית ואת לוחית המיקרו, כבה את המכשיר והתחל בניתוח. פרופילי חלבון כלליים מהשברים השונים שהושגו באמצעות צנטריפוגות סדרתיות הראו אוכלוסיות חלבונים שונות בשברים המבודדים.נוכחותו של כל התוכן המיטוכונדריאלי ניכרת על ידי האותות החזקים עבור סמנים של הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית והפנימית וחלבונים הקשורים לנוקלואיד. שבר N מייצג גרעינים וחומר לא מסולף. רוב הרשתית האנדופלזמית, קרום הפלזמה או סמני הציטופלסמה בשברירי SN1 או SN2 מדגישים את הטוהר הגבוה המתקבל במהלך הבידוד.עלייה בצריכת החמצן נצפתה לאחר תוספת ADP בבדיקות צימוד חמצון בטא. לאחר קרבונל ציאניד-p-trifluoromethoxy פנילhydrazone תוספת, צריכת חמצן הגיעה לרמה הגבוהה ביותר שלה. יחס שליטה נמוך בדרכי הנשימה מבטיח את שלמות המיטוכונדריה המבודדת.בדיקת זרימת האלקטרונים בחנה את הפעילות של מתחמי שרשרת הובלת האלקטרונים בנפרד או בשילוב באמצעות הזרקת מצעים ומעכבים ספציפיים. בידוד המיטוכונדריה רגיש ביותר. לפיכך כל השלבים לאחר הפחתת רקמות צריך להתבצע בחריצות ובזהירות כדי לשמור על הכדאיות שלהם.בדיקות ניסיוניות ניתן להחמיא עם ניתוח סמטי דטרמיניסטי של מולקולות מיטוכונדריה מפתח או עם המחקר של הרכבה של קומפלקסים respirometric באמצעות אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד יליד כחול.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...