Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
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हम Homogenizer और तकनीकी सहायता के लिए CABD प्रोटिओमिक्स और पशुपालन सुविधाओं के उपयोग के लिए जुआन जे टेना को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को स्पेनिश शिक्षा, संस्कृति और खेल मंत्रालय द्वारा फेलोशिप FPU16/03264 के माध्यम से J.D.H.C. के माध्यम से समर्थित किया गया था, एसोसिएशन Française contre les Myopathies (AFM) फेलोशिप अनुदान # 22450 के माध्यम से C.V.-G. को, एक संस्थागत अनुदान MDM-2016-0687 (मारिया डी Maeztu उत्कृष्टता इकाई, जीन विनियमन और Mfogenesis के विभाग, जीन विनियमन और Mfogenesis के विभाग के लिए CABD में 80.C जुंटा डी अंडालुसिया अनुदान P18-RT-4572, यूरोपीय संघ से फेडर फंडिंग कार्यक्रम, और स्पेनिश विज्ञान, नवाचार और विश्वविद्यालयों के मंत्रालय RED2018-102576-T को P.N.

माउस आवास और ऊतक संग्रह Universidad पाब्लो डी ओलावाइड नैतिकता समिति (सेविला, स्पेन; प्रोटोकॉल 24/04/2018/056 और 12/03/2021/033) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्पेनिश रॉयल डिक्री 53/2013, यूरोपीय निर्देश 2010/63/EU, और अन्य प्रास...

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	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी तरीकों की अपनी सीमाएं हैं; इसलिए, उस विधि का चयन करना महत्वपूर्ण है जो एक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए सबसे अच्छा है। यह काम माउ?...

माइटोकॉन्ड्रिया सेल 1 में प्राथमिक चयापचय ऑर्गेनेल हैं। ये विशेष झिल्ली-संलग्न ऑर्गेनेल पोषक तत्वों के अणुओं का उपयोग करते हैं ताकि OXPHOS द्वारा एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के रूप में ऊर्जा का उत्पादन किया जा सके। यह प्रक्रिया ETC2 में रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला में दाता अणुओं से इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण पर निर्भर करती है। CoQ एकमात्र रेडॉक्स-सक्रिय लिपिड है जो अंतर्जात रूप से सभी सेलुलर झिल्ली और परिसंचारी लिपोप्रोटीन में उत्पादित होता है जो एंटीऑक्सिडेंट फ़ंक्शन 3 दिखाता है। यह ईटीसी का एक आवश्यक घटक है, जो एनएडीएच-निर्भर कॉम्प्लेक्स I और FADH2-निर्भर कॉम्प्लेक्स II से इलेक्ट्रॉनों को जटिल III में स्थानांतरित करता है, हालांकि कई अन्य रिडक्टेस माइटोकॉन्ड्रियल कोक्यू को कई सेलुलर चयापचय मार्गों में एक अनिवार्य कदम के रूप में यूबिक्विनॉल में कम कर सकते हैं।
इस प्रक्रिया के दौरान, माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में एक इलेक्ट्रोकेमिकल प्रोटॉन ग्रेडिएंट बनाया जाता है, जिसे एटीपी सिंथेज़ कॉम्प्लेक्स वी 2 द्वारा जैविक रूप से सक्रिय ऊर्जा में बदल दिया जाता है। नतीजतन, माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता मुख्य रूप से उच्च ऊर्जा आवश्यकताओं वाले ऊतकों को प्रभावित करने वाली रोग संबंधी स्थितियों के असंख्य की ओर ले जाती है- मस्तिष्क, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों 6,7। इसलिए, स्वास्थ्य और बीमारी में अपनी भूमिका की जांच करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स का सटीक विश्लेषण करने के तरीकों को विकसित करना मौलिक है, विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशियों जैसे अत्यधिक ऊर्जावान ऊतकों में।
क्लार्क-प्रकार के ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का शास्त्रीय रूप से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन 8 के अध्ययन में उपयोग किया गया है। हालांकि, इस प्रणाली को उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रौद्योगिकियों द्वारा उत्तरोत्तर विस्थापित किया गया है, जिसमें माइक्रोप्लेट-आधारित ऑक्सीजन खपत प्रौद्योगिकियां जैसे कि एजाइलेंट सीहोर्स एक्सएफ विश्लेषक विशेष रूप से लोकप्रिय हैं। कंकाल की मांसपेशियों के क्षेत्र में, ये अध्ययन आमतौर पर सुसंस्कृत कोशिकाओं में आयोजित किए जाते हैं, मुख्य रूप से C2C12 अमर माउस मायोब्लास्ट सेल लाइन या उपग्रह कोशिकाओं से व्युत्पन्न प्राथमिक संस्कृतियों में 10,11। हालांकि, ये अध्ययन विवो में स्थिति को पूरी तरह से याद नहीं करते हैं, खासकर जब माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान की जांच करते हैं और विशिष्ट अपमान, गैर-आनुवंशिक हस्तक्षेप, या आनुवंशिक जोड़तोड़ पर ऊतक स्तर पर कार्य करते हैं।
इसके अलावा, कोशिकाओं में श्वसन assays अतिरिक्त कारकों के कारण अधिक जटिल हैं, जिसमें एटीपी और परख सब्सट्रेट या सिग्नलिंग घटनाओं की अतिरिक्त-माइटोकॉन्ड्रियल मांग शामिल है, जो परिणामों की व्याख्या को गुमराह कर सकती है। वैकल्पिक रूप से, मांसपेशियों से ताजा अलग मायोफाइबर के एकल या बंडलों का उपयोग करना भी संभव है। हालांकि, अलगाव विधि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और केवल कुछ मांसपेशियों के प्रकारों के लिए संभव है। इस मामले में, फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस (एफडीबी) और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल) मांसपेशियों का उपयोग मुख्य रूप से 10,12,13 किया जाता है, हालांकि कुछ रिपोर्टों में अन्य मांसपेशियों के प्रकारों के साथ-साथ 14,15 के उपयोग का वर्णन किया गया है।
कंकाल की मांसपेशी वर्गों के bioenergetic प्रोफाइलिंग भी रिपोर्ट किया गया है16. इस विधि का प्रमुख लाभ यह है कि बरकरार मांसपेशियों का अध्ययन किया जा सकता है (लेखकों से पता चलता है कि फाइबर के माध्यम से स्लाइसिंग अलग-थलग मायोफाइबर की तुलना में परिणामों को परेशान नहीं करता है)। हालांकि, सब्सट्रेट और परख अवरोधकों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल पहुंच सीमित है, और इस प्रकार, केवल कुछ मापदंडों को मापा जा सकता है16। अंत में, अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रिया को भी इसी तरह से नियोजित किया जा सकता है9,17,18,19। इस मामले में, माइटोकॉन्ड्रिया अपने साइटोसोलिक वातावरण को खो देता है, जो उनके कार्य को प्रभावित कर सकता है। इसके विपरीत, यह विधि सब्सट्रेट और अवरोधकों तक पहुंच की गारंटी देती है, नमूना प्रकारों की अधिकता के विश्लेषण को सक्षम बनाती है, और आमतौर पर कम सामग्री की आवश्यकता होती है।
यह पेपर माइक्रोप्लेट-आधारित रेस्पिरोमेट्रिक एसेस (चित्रा 1) का उपयोग करके माउस कंकाल की मांसपेशी से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग को करने की एक विधि का वर्णन करता है। विशेष रूप से, तीन प्रोटोकॉल विस्तृत हैं: युग्मन परख, सीए ETC और OXPHOS मशीनरी के बीच युग्मन की डिग्री का आकलन करने के लिए; इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख, ईएफए व्यक्तिगत ईटीसी परिसरों की गतिविधि को मापने के लिए; और बॉक्स परख माइटोकॉन्ड्रियल β ऑक्सीकरण क्षमता निर्धारित करने के लिए. विशेष रूप से, पारंपरिक श्वसनमिति विधियों की तुलना में केवल थोड़ी मात्रा में नमूनों की आवश्यकता होती है। यहां उपयोग किए जाने वाले अलगाव प्रोटोकॉल को कहीं और प्रकाशित विधि से संशोधित किया गया है18।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

सेल की अधिकांश ऊर्जा ग्लूकोज, फैटी एसिड और अमीनो एसिड के क्षरण के माध्यम से विभिन्न मार्गों से प्राप्त की जाती है जो माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) प्रणाली पर अभिसरण करते हैं, जो सेलुलर मांगों के जवाब में विनियमित होता है। लिपिड अणु Coenzyme Q (CoQ) निरंतर ऑक्सीकरण / कमी चक्रों के माध्यम से इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ETC) में जटिल III में इलेक्ट्रॉनों को स्थानांतरित करके इस प्रक्रिया में आवश्यक है। माइटोकॉन्ड्रिया की स्थिति और, अंततः, सेलुलर स्वास्थ्य का आकलन रेस्पिरोमेट्रिक एसेस का उपयोग करके ईटीसी ऑक्सीजन की खपत को मापकर किया जा सकता है। ये अध्ययन आमतौर पर स्थापित या प्राथमिक सेल लाइनों में किए जाते हैं जिन्हें कई दिनों से सुसंस्कृत किया गया है। दोनों मामलों में, प्राप्त श्वसन पैरामीटर किसी भी दिए गए अंग या ऊतक में सामान्य शारीरिक स्थितियों से विचलित हो सकते हैं।
इसके अतिरिक्त, कंकाल की मांसपेशियों से अलग सुसंस्कृत एकल फाइबर की आंतरिक विशेषताएं इस प्रकार के विश्लेषण को बाधित करती हैं। यह पेपर माउस कंकाल की मांसपेशी से ताजा अलग माइटोकॉन्ड्रिया में श्वसन के विश्लेषण के लिए एक अद्यतन और विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। हम संभावित समस्याओं के समाधान भी प्रदान करते हैं जो प्रक्रिया के किसी भी चरण में उत्पन्न हो सकते हैं। यहां प्रस्तुत विधि को विविध ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में ऑक्सीजन की खपत दरों की तुलना करने और दवा उपचार या उम्र बढ़ने या सेक्स जैसे अन्य कारकों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स चयापचय और विनियमन के बारे में महत्वपूर्ण सवालों का जवाब देने के लिए एक व्यवहार्य तरीका है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के विवो विश्लेषण की अनुमति देता है। विधि की एक रूपरेखा चित्र 1 में दिखाई ?...

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Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

यहां, हम माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं और माइक्रोप्लेट-आधारित श्वसनमितीय assays का उपयोग करके ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) द्वारा श्वसन के बाद के विश्लेषण का वर्णन करते हैं। इस पाइपलाइन को माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय पर कई पर्यावरणीय या आनुवंशिक हस्तक्षेपों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

रेस्पिरोमेट्रिक Assays के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

यह शब्द माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया को संसाधित करने में श्वसन विश्लेषण का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल शुद्धिकरण समय को काफी कम करता है और कई नमूनों को एक साथ संसाधित करने की अनुमति देता है। संयुक्त पृष्ठभूमि के किसी भी आठ लिंग पर जानवरों से माइटोकॉन्ड्रिया को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके विकृत किया जा सकता है जो विभिन्न प्रकार की प्रयोगात्मक स्थितियों में श्वसन के अध्ययन को सक्षम करता है।यह विधि उन सभी अनुसंधान क्षेत्रों के लिए उपयुक्त है जहां माइटोकॉन्ड्रिया फ़ंक्शन उम्र बढ़ने, दवा परीक्षण, कैंसर या विकास सहित प्रासंगिक है। इसे अन्य ऊतकों और जीवों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान से बचाने के लिए प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर सब कुछ रखकर सभी सामग्री ठंडी हैं।बर्फ पर प्रति नमूना तीन 50 मिलीलीटर बीकर रखें और बीकर में पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें, बीकर में 10 मिलीमोलर ईडीटीए पीबीएस के 10 मिलीलीटर बीकर दो में, और बीकर तीन में चार मिलीलीटर आईबी 1। 70% इथेनॉल के साथ एक euthanized माउस के दाहिने हिंद अंग स्प्रे करने के लिए बहा और कॉर्क विच्छेदन बोर्ड के लिए अंग टेप से बचने के लिए और फिर बाएं सामने अंग टेप करने के लिए अंग टेप. घुटने से पैर तक त्वचा के माध्यम से एक बाँझ डिस्पोजेबल स्केलपेल के साथ एक चीरा बनाएं।टखने के स्तर पर दांतेदार संदंश के साथ त्वचा को पकड़ें और इसे टखने के चारों ओर ठीक कैंची के साथ काट लें। एक हाथ में ठीक टिप चिमटी के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों से दूर त्वचा को कम करें, जबकि इसे दूसरे हाथ में दांतेदार संदंश के साथ ऊपर खींचें। टखने से घुटने तक सभी कंकाल की मांसपेशियों को विच्छेदित करें और ठीक चिमटी और कैंची का उपयोग करके टिबियलिस पूर्वकाल की मांसपेशी पर सभी संयोजी ऊतक को हटा दें।एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस मांसपेशी के चार डिस्टल टेंडन का पता लगाएं और उन्हें पैर की उंगलियों में उनके सम्मिलन के करीब अनुभाग करें। टिबियलिस पूर्वकाल डिस्टल कण्डरा का पता लगाएं और इसे टखने के नीचे इसके सम्मिलन के करीब काट दें। ढीले सिरों को मुक्त करने के लिए टखने के ऊपर टिबियलिस पूर्वकाल और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस टेंडन को खींचें।कण्डरा के ढीले सिरों को पकड़ें और मांसपेशियों को हड्डियों में मांसपेशियों के बाकी हिस्सों से दूर खींचकर उन्हें कम करें। घुटने की टोपी के लिए जितना संभव हो सके इन मांसपेशियों के समीपस्थ कण्डरा को काटें। गैस्ट्रोकेनेमियस और सोलस मांसपेशी निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ने के लिए माउस को उल्टा करें।बाइसेप्स, फेमोरिस और गैस्ट्रोकेनेमियस के बीच गठित जेब को पकड़ें और समीपस्थ गैस्ट्रोकेनेमियस कण्डरा की कल्पना करने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करके इन मांसपेशियों को अलग करें। पकड़ और ध्यान से ठीक कैंची के साथ डिस्टल Achilles कण्डरा काट. समीपस्थ gastrocnemius कण्डरा यह अंतर्निहित soleus के साथ मुक्त काटें.शेष मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें और क्वाड्रिसेप्स मांसपेशी को विच्छेदन करने के लिए प्रारंभिक स्थिति में माउस को फिर से पिन करें। वसा ऊतक को छोड़ दें फिर हड्डी से मांसपेशियों को अलग करने के लिए क्वाड्रिसेप्स और फीमर के बीच ठीक चिमटी डालें। डिस्टल क्वाड्रिसेप्स मांसपेशी tendons पकड़ो और कण्डरा के रूप में संभव के रूप में घुटने की टोपी के करीब के रूप में कटौती.क्वाड्रिसेप्स को ऊपर खींचें और उन्हें समीपस्थ सम्मिलन पर ठीक कैंची के साथ मुक्त करें। बाएं हिंद अंग के लिए एक ही दोहराएँ। बीकर में सभी मांसपेशियों को कुल्ला एक, फिर दो, बीकर तीन के बाद।अंत में, बीकर तीन में सभी मांसपेशियों को बर्फ पर तेज कैंची के साथ कीमा बनाते हैं। निलंबन को सी ट्यूब में स्थानांतरित करें, इसे कसकर बंद करें, और इसे होमोजेनाइज़र की आस्तीन पर उल्टा संलग्न करें। होमोजेनेट को दो 2 मिलीलीटर पूर्व-ठंडा माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों और 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज में विभाजित करें।फिर supernatant को नए पूर्व-ठंडा ट्यूबों और एक और 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज में स्थानांतरित करें। IB2 के 500 माइक्रोलीटर में गोली को संयोजित करें एक नए 2 मिलीलीटर पूर्व-ठंडा माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में supernatant स्थानांतरण और इसे supernatant नंबर दो, या SN2 के रूप में लेबल करें। पुनः निलंबन बफर के 200 माइक्रोलीटर में अंतिम माइटोकॉन्ड्रियल गोली को निलंबित करें।प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए जल्दी से 10 माइक्रोलीटर अलग रखें और तुरंत क्षति को रोकने के लिए शेष माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन में 10% एफएफए बीएसए के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए 10, 500 बार जी पर केंद्रित माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। फिर से बीएसए के साथ 1X युग्मन परख माध्यम के 100 माइक्रोलीटर में माइटोकॉन्ड्रियल गोली को निलंबित करें, बीएसए के साथ 1एक्स इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख माध्यम, या बीएसए के साथ 1एक्स बीटा ऑक्सीकरण माध्यम, प्रोटोकॉल के आधार पर प्रदर्शन किया जा सकता है।इसी परख माध्यम का उपयोग कर माइक्रोलीटर प्रति 0.2 माइक्रोग्राम करने के लिए इस केंद्रित माइटोकॉन्ड्रियल नमूने को पतला. बर्फ पर एक पूर्व ठंडा 24 अच्छी तरह से माइक्रो प्लेट में अच्छी तरह से निलंबन के बीज 50 microliters प्रति अच्छी तरह से. पृष्ठभूमि सुधार कुओं में, इसी परख माध्यम केवल जोड़ें.विखंडन शुद्धता निर्धारण के लिए शेष माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 20 मिनट के लिए पूर्व ठंडा preparative centrifuge में माइक्रो प्लेट स्पिन. इस बीच, 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए शेष परख मध्यम गर्म.centrifugation के बाद, माइक्रो प्लेट को संतुलित करने के लिए पांच मिनट के लिए बेंच पर छोड़ दें। माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने से बचने के लिए अच्छी तरह से धीरे-धीरे और सावधानी से गर्म परख माध्यम के 450 माइक्रोलीटर जोड़ें। ढक्कन के बिना ऑक्सीजन की खपत मापने के उपकरण में माइक्रो प्लेट को तुरंत रखें और माप कार्यक्रम शुरू करें।सुनिश्चित करें कि पहला कदम माइक्रो प्लेट को गर्म करने की अनुमति देने के लिए 10 मिनट का इनक्यूबेशन है। एक बार प्रयोग समाप्त होने के बाद, कारतूस और माइक्रो प्लेट को हटा दें, उपकरण को बंद कर दें, और विश्लेषण शुरू करें। सीरियल सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से प्राप्त विभिन्न अंशों से सामान्य प्रोटीन प्रोफाइल ने अलग-अलग अंशों में अलग-अलग प्रोटीन आबादी दिखाई।सभी माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री की उपस्थिति बाहरी और आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली और न्यूक्लियोइड से जुड़े प्रोटीन के मार्करों के लिए मजबूत संकेतों से स्पष्ट है। अंश N नाभिक और अविच्छिन्न सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है। SN1 या SN2 अंशों में अधिकांश एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, प्लाज्मा झिल्ली, या साइटोप्लाज्म मार्कर अलगाव के दौरान प्राप्त उच्च शुद्धता को उजागर करते हैं।युग्मन और बीटा ऑक्सीकरण assays में ADP अतिरिक्त के बाद ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि देखी गई थी। कार्बोनिल साइनाइड-पी-ट्राइफ्लोरोमेथोक्सी फेनिलहाइड्राज़ोन के अलावा के बाद, ऑक्सीजन की खपत अपने उच्चतम स्तर पर पहुंच गई। एक कम श्वसन नियंत्रण अनुपात पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की अखंडता सुनिश्चित करता है।इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसरों की गतिविधि की जांच व्यक्तिगत रूप से या विशिष्ट substrates और inhibitors के इंजेक्शन के माध्यम से संयोजन में. अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया बेहद संवेदनशील हैं। इसलिए ऊतक शमन के बाद के सभी चरणों को उनकी व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए लगन और सावधानीपूर्वक प्रदर्शन करने की आवश्यकता है।प्रयोगात्मक assays कुंजी माइटोकॉन्ड्रिया अणुओं के एक नियतात्मक sematic विश्लेषण के साथ या नीले देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर respirometric परिसरों की विधानसभा के अध्ययन के साथ प्रशंसा की जा सकती है।

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

वयस्क और भ्रूण के कंकाल की मांसपेशी Microexplant संस्कृति और कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल के अलगाव

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

कंकाल की मांसपेशी से Mitochondrial अलगाव

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

कंकाल की मांसपेशी से progenitors के शोधन

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

लेजर प्रवृत्त Zebrafish भ्रूण कंकाल की मांसपेशी की चोट

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

अलगाव और व्यक्तिगत और वयस्क कंकाल की मांसपेशी से myofibers अपने उपग्रह कोशिकाओं की संस्कृति

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

मानव कंकाल की मांसपेशी से रक्त वाहिका व्युत्पन्न multipotent व्यापारियों का अलगाव

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

अलगाव और संवर्धित कोशिकाओं और माउस के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक विश्लेषण

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...