Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
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Desideriamo ringraziare Juan J. Tena per l'uso dell'omogeneizzatore e le strutture CABD Proteomics and Animal Husbandry per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero spagnolo dell'Istruzione, della Cultura e dello Sport attraverso la borsa di studio FPU16/03264 a J.D.H.C., l'Associazione Française contre les Miopatie (AFM) attraverso la borsa di studio #22450 a C.V.-G., una sovvenzione istituzionale MDM-2016-0687 (Unità di eccellenza Maria de Maeztu, Dipartimento di regolazione genica e morfogenesi presso CABD) e BFU2017-83150-P a J.J.C. La sovvenzione della Junta de Andalucía P18-RT-4572, il programma di finanziamento FEDER dell'Unione europea e il Ministero spagnolo della scienza, dell'innovazione e delle università concedono RED2018-102576-T a P.N.

L'alloggiamento del topo e la raccolta dei tessuti sono stati eseguiti utilizzando protocolli approvati dal Comitato Etico dell'Universidad Pablo de Olavide (Siviglia, Spagna; protocolli 24/04/2018/056 e 12/03/2021/033) in conformità con il Regio Decreto Spagnolo 53/2013, la Direttiva Europea 2010/63/UE e altre linee guida pertinenti.
1. Preparazione delle scorte, dei tamponi e dei reagenti per i saggi respiratori
<ol><li>Preparare le seguenti soluzioni stock, che possono e...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. 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Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Tutti i metodi utilizzati per studiare la respirazione mitocondriale hanno i loro limiti; quindi, è fondamentale selezionare il metodo che meglio si adatta a una specifica domanda sperimentale. Questo lavoro fornisce un protocollo aggiornato e dettagliato per isolare i mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per eseguire diversi saggi respiratori per studiare la funzione mitocondriale. In effetti, lo studio della bioenergetica mitocondriale nei mitocondri isolati utilizzando tecnologie basate su micropiastre è prez...

I mitocondri sono i principali organelli metabolici nella cellula1. Questi organelli specializzati racchiusi in membrana utilizzano molecole nutritive per produrre energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) da OXPHOS. Questo processo si basa sul trasferimento di elettroni da molecole donatrici in una serie di reazioni redox nell'ETC2. Il CoQ è l'unico lipide redox-attivo prodotto endogenamente in tutte le membrane cellulari e nelle lipoproteine circolanti che mostra una funzione antiossidante3. È un componente essenziale dell'ETC, trasferendo elettroni dal complesso I dipendente dal NADH e dal complesso II FADH2-dipendente al complesso III, sebbene molte altre reduttasi possano guidare la riduzione del CoQ mitocondriale all'ubichinolo come passaggio obbligatorio in più vie metaboliche cellulari4,5.
Durante tutto il processo, viene creato un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana interna mitocondriale, che viene trasformata in energia biologicamente attiva dal complesso ATP sintasi V2. Di conseguenza, la disfunzione mitocondriale porta a una miriade di condizioni patologiche che colpiscono principalmente i tessuti con elevato fabbisogno energetico: cervello, cuore e muscolo scheletrico6,7. Pertanto, è fondamentale sviluppare metodi per analizzare accuratamente la bioenergetica mitocondriale per indagare il suo ruolo nella salute e nella malattia, in particolare nei tessuti altamente energetici come i muscoli scheletrici.
L'elettrodo di ossigeno di tipo Clark è stato utilizzato classicamente nello studio della respirazione mitocondriale8. Tuttavia, questo sistema è stato progressivamente sostituito da tecnologie ad alta risoluzione, con tecnologie di consumo di ossigeno basate su micropiastre come gli analizzatori Agilent Seahorse XF che sono particolarmente popolari9. Nel campo del muscolo scheletrico, questi studi sono tipicamente condotti in cellule in coltura, principalmente nella linea cellulare di mioblasti di topo immortalizzati C2C12 o in colture primarie derivate da cellule satelliti10,11. Tuttavia, questi studi non ricapitolano completamente la situazione in vivo, specialmente quando si indaga la biologia mitocondriale e la funzione a livello tissutale su insulti specifici, interventi non genetici o manipolazioni genetiche.
Inoltre, i saggi respiratori nelle cellule sono più complessi a causa di fattori aggiuntivi, tra cui la domanda extra-mitocondriale di ATP e substrati di analisi o eventi di segnalazione, che potrebbero fuorviare l'interpretazione dei risultati. In alternativa, è anche possibile utilizzare singoli o fasci di miofibre appena isolate dai muscoli. Tuttavia, il metodo di isolamento è tecnicamente impegnativo e fattibile solo per alcuni tipi di muscoli. In questo caso, i muscoli flessori digitorum brevis (FDB) ed estensori digitorum longus (EDL) sono principalmente utilizzati10,12,13, anche se alcuni rapporti descrivono l'uso di altri tipi di muscoli14,15.
È stato riportato anche il profilo bioenergetico delle sezioni del muscolo scheletrico16. Il principale vantaggio di questo metodo è che i muscoli intatti possono essere studiati (gli autori dimostrano che affettare le fibre non disturba i risultati rispetto alle miofibre isolate). Tuttavia, l'accesso mitocondriale ai substrati e agli inibitori del saggio è limitato e, pertanto, è possibile misurare solo pochi parametri16. Infine, possono essere impiegati anche mitocondri isolati9,17,18,19. In questo caso, i mitocondri perdono il loro ambiente citosolico, che potrebbe influenzare la loro funzione. Al contrario, questo metodo garantisce l'accesso a substrati e inibitori, consente l'analisi di una pletora di tipi di campioni e in genere richiede meno materiale.
Questo articolo descrive un metodo per eseguire il profilo bioenergetico di mitocondri isolati dal muscolo scheletrico del topo utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre (Figura 1). In particolare, vengono dettagliati tre protocolli: il Coupling Assay, CA per valutare il grado di accoppiamento tra l'ETC e il macchinario OXPHOS; l'Electron Flow Assay, EFA per misurare l'attività dei singoli complessi ETC; e il test BOX per determinare la capacità di β-ossidazione mitocondriale. In particolare, sono necessarie solo piccole quantità di campioni rispetto ai metodi di respirometria convenzionali. Il protocollo di isolamento qui utilizzato è stato modificato dal metodo pubblicato altrove18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

La maggior parte dell'energia della cellula è ottenuta attraverso la degradazione di glucosio, acidi grassi e amminoacidi da diversi percorsi che convergono sul sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS), che è regolato in risposta alle richieste cellulari. La molecola lipidica Coenzima Q (CoQ) è essenziale in questo processo trasferendo elettroni al complesso III nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) attraverso cicli di ossidazione/riduzione costanti. Lo stato dei mitocondri e, in definitiva, la salute cellulare possono essere valutati misurando il consumo di ossigeno ETC utilizzando saggi respirometrici. Questi studi vengono in genere eseguiti in linee cellulari stabilite o primarie che sono state coltivate per diversi giorni. In entrambi i casi, i parametri respiratori ottenuti possono aver deviato dalle normali condizioni fisiologiche in un dato organo o tessuto.
Inoltre, le caratteristiche intrinseche delle singole fibre coltivate isolate dal muscolo scheletrico impediscono questo tipo di analisi. Questo documento presenta un protocollo aggiornato e dettagliato per l'analisi della respirazione nei mitocondri appena isolati dal muscolo scheletrico del topo. Forniamo anche soluzioni a potenziali problemi che potrebbero sorgere in qualsiasi fase del processo. Il metodo qui presentato potrebbe essere applicato per confrontare i tassi di consumo di ossigeno in diversi modelli murini transgenici e studiare la risposta mitocondriale ai trattamenti farmacologici o ad altri fattori come l'invecchiamento o il sesso. Questo è un metodo fattibile per rispondere a domande cruciali sul metabolismo e la regolazione della bioenergetica mitocondriale.

Il protocollo qui presentato consente l'analisi in vivo della respirazione mitocondriale attraverso l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo. Una descrizione del metodo è illustrata nella Figura 1. Dopo aver sezionato i muscoli scheletrici dagli arti posteriori (Figura 2), i tessuti vengono omogeneizzati e i mitocondri purificati, in condizioni isotoniche, attraverso centrifugazioni seriali. La purezza delle diverse frazioni ottenut...

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Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Questa parola descrive l'analisi della respirazione nell'elaborazione dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo. Questo protocollo riduce notevolmente i tempi di purificazione e consente di elaborare più campioni contemporaneamente. I mitocondri di animali di qualsiasi ottavo sesso di origine unita possono essere mutilati utilizzando questo protocollo che consente lo studio della respirazione in un'ampia varietà di condizioni sperimentali.Questo metodo è adatto a tutte le aree di ricerca in cui la funzione dei mitocondri è rilevante, tra cui l'invecchiamento, i test antidroga, il cancro o lo sviluppo. Può anche essere adattato ad altri tessuti e organismi. Assicurarsi che tutti i materiali siano freddi posizionando tutto sul ghiaccio durante la procedura per proteggere i mitocondri dai danni.Posizionare tre becher da 50 millilitri per campione sul ghiaccio e aggiungere 10 millilitri di PBS nel becher uno, 10 millilitri di 10 millimolari EDTA PBS nel becher due e quattro millilitri IB1 nel becher tre. Spruzzare l'arto posteriore destro di un topo eutanasizzato con etanolo al 70% per evitare che la pelliccia si spargi e fissare l'arto al pannello di dissezione del sughero, quindi nastro adesivo all'arto anteriore sinistro. Fai un'incisione con un bisturi monouso sterile attraverso la pelle dal ginocchio ai piedi.Afferrare la pelle con una pinza dentata all'altezza della caviglia e tagliarla con forbici sottili intorno alla caviglia. Allontana la pelle dalla muscolatura sottostante con una pinzetta a punta fine in una mano mentre la tiri su con una pinza dentata nell'altra mano. Sezionare tutti i muscoli scheletrici dalla caviglia al ginocchio e rimuovere tutto il tessuto connettivo sul muscolo tibiale anteriore usando pinzette e forbici fini.Trova i quattro tendini distali del muscolo estensore digitorum longus e sezionali vicino alle loro inserzioni nelle dita dei piedi. Individuare il tendine distale anteriore tibiale e tagliarlo vicino al suo inserimento sotto la caviglia. Tirare i tendini tibiali anteriori ed estensori digitorum longus sopra la caviglia per liberare le estremità sciolte.Afferrare le estremità sciolte dei tendini e facilitare i muscoli lontano dal resto della muscolatura nelle ossa tirandoli su. Tagliare i tendini prossimali di questi muscoli il più vicino possibile alla rotula. Capovolgere il mouse per procedere con l'estrazione del muscolo gastrocnemio e soleo.Afferrare la tasca formata tra i bicipiti, il femore e il gastrocnemio e separare questi muscoli usando forbici fini per visualizzare il tendine gastrocnemio prossimale. Afferrare e tagliare con cura il tendine di Achille distale con forbici fini. Tagliare il tendine gastrocnemio prossimale liberandolo con il soleo sottostante.Sezionare attentamente i muscoli rimanenti e ri-bloccare il mouse nella posizione iniziale per sezionare il muscolo quadricipite. Scartare il tessuto adiposo, quindi inserire una pinzetta fine tra il quadricipite e il femore per separare il muscolo dall'osso. Afferrare i tendini muscolari del quadricipite distale e tagliare il tendine il più vicino possibile alla rotula.Tirare su i quadricipiti e liberarli con forbici sottili all'inserimento prossimale. Ripeti lo stesso per l'arto posteriore sinistro. Risciacquare tutti i muscoli nel becher uno, poi due, seguito dal becher tre.Infine, tritare tutti i muscoli nel becher tre con forbici affilate sul ghiaccio. Trasferire la sospensione su un tubo C, chiuderla ermeticamente e fissarla a testa in giù sulla manica dell'omogeneizzatore. Dividere l'omogeneizzato in due tubi microcentrifughati pre-refrigerati da 2 millilitri e centrifugare per 10 minuti.Quindi trasferire il surnatante in nuovi tubi pre-refrigerati e centrifugare per altri 10 minuti. Combina il pellet in 500 microlitri di IB2 Trasferisci il surnatante in un nuovo tubo microcentriflato pre-refrigerato da 2 millilitri ed etichettalo come surnatante numero due, o SN2. Sospendere nuovamente il pellet mitocondriale finale in 200 microlitri di tampone di sospensione.Mettere rapidamente da parte 10 microlitri per la quantificazione delle proteine e aggiungere immediatamente 10 microlitri di 10% FFA BSA alla sospensione mitocondriale rimanente per prevenire danni. Centrifugare la sospensione mitocondriale concentrata a 10, 500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Sospendere nuovamente il pellet mitocondriale in 100 microlitri di 1X coupling assay medium con BSA, 1X electron flow assay medium con BSA, o 1X beta oxidation medium with BSA, a seconda del protocollo da eseguire.Diluire questo campione mitocondriale concentrato a 0,2 microgrammi per microlitro utilizzando il mezzo di saggio corrispondente. Semina 50 microlitri della sospensione per pozzetto in una micro piastra pre-refrigerata da 24 pozzetti su ghiaccio. Nei pozzetti di correzione dello sfondo, aggiungere solo il mezzo di analisi corrispondente.Conservare la sospensione mitocondriale rimanente a meno 80 gradi Celsius per la determinazione della purezza della frammentazione. Girare la micro piastra nella centrifuga preparativa pre-refrigerata per 20 minuti. Nel frattempo, riscaldare il mezzo di saggio rimanente a 37 gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, lasciare la micro piastra sul banco per cinque minuti per equilibrare. Aggiungere 450 microlitri del mezzo di saggio caldo per pozzo lentamente e con attenzione per evitare il distacco dei mitocondri. Posizionare immediatamente la micro piastra nello strumento di misurazione del consumo di ossigeno senza coperchio e avviare il programma di misurazione.Assicurarsi che il primo passo sia un'incubazione di 10 minuti per consentire alla micro piastra di riscaldarsi. Una volta terminato l'esperimento, rimuovere la cartuccia e la micro piastra, spegnere lo strumento e avviare l'analisi. I profili proteici generali delle diverse frazioni ottenute attraverso centrifugazioni seriali hanno mostrato popolazioni proteiche distinte nelle frazioni isolate.La presenza di tutto il contenuto mitocondriale è evidente dai forti segnali per i marcatori della membrana mitocondriale esterna e interna e delle proteine associate ai nucleoidi. La frazione N rappresenta nuclei e materiale indisturbato. La maggior parte dei marcatori del reticolo endoplasmatico, della membrana plasmatica o del citoplasma nelle frazioni SN1 o SN2 evidenziano l'elevata purezza ottenuta durante l'isolamento.Un aumento del consumo di ossigeno è stato osservato dopo l'aggiunta di ADP nei saggi di accoppiamento e beta ossidazione. Dopo l'aggiunta di cianuro di carbonile-p-trifluorometiossi fenilidrata, il consumo di ossigeno ha raggiunto il suo livello più alto. Un basso rapporto di controllo respiratorio garantisce l'integrità dei mitocondri isolati.Il saggio del flusso di elettroni ha esaminato l'attività dei complessi della catena di trasporto degli elettroni singolarmente o in combinazione attraverso l'iniezione di substrati e inibitori specifici. I mitocondri isolanti sono estremamente sensibili. Quindi tutti i passaggi dopo la mitigazione dei tessuti devono essere eseguiti diligentemente e con attenzione per preservare la loro vitalità.I saggi sperimentali possono essere completati con un'analisi sematica deterministica di molecole chiave dei mitocondri o con lo studio dell'assemblaggio di complessi respirometrici utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide nativa blu.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Ricerca

Biologia

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

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