Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
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ホモジナイザーとCABDプロテオミクスおよび畜産施設を技術サポートに使用してくれたJuan J. Tenaに感謝します。この研究は、スペイン教育文化スポーツ省のJ.D.H.へのフェローシップFPU16/03264、C.V.-G.へのフェローシップ助成金#22450、制度助成金MDM-2016-0687(CABDの遺伝子規制および形態形成省マリア・デ・マエズトゥ・エクセレンス・ユニット)、BFU2017-83150-PからJ.J..Cへのフェローシップ・フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー協会(AFM)を通じて支援されまし.C。アンダルシア暫定軍事政権はP18-RT-4572、欧州連合(EU)のFEDER資金提供プログラム、スペイン科学・イノベーション・大学省はRED2018-102576-TをPNに助成金を支給しています。

マウスの飼育および組織採取は、スペイン勅令53/2013、欧州指令2010/63/EU、およびその他の関連ガイドラインに従って、パブロ・デ・オラヴィーデ大学倫理委員会(スペイン、セビリア、プロトコル24/04/2056および12/03/2021/033)によって承認されたプロトコルを使用して実施された。
1. 呼吸アッセイのためのストック、緩衝液、および試薬の調製
<ol><li>以下のスト...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

ミトコンドリア呼吸を研究するために使用されるすべての方法には限界があります。したがって、特定の実験的な質問に最も適した方法を選択することが重要です。この研究は、ミトコンドリア機能を調査するためにさまざまな呼吸アッセイを実行するために、マウス骨格筋からミトコンドリアを単離するための最新かつ詳細なプロトコルを提供する。実際、マイクロプレートベースの技術?...

ミトコンドリアは細胞内の主要な代謝小器官1です。これらの特殊な膜密閉細胞小器官は、栄養分子を使用して、OXPHOSによってアデノシン三リン酸(ATP)の形でエネルギーを生成する。このプロセスは、ETC2における一連の酸化還元反応におけるドナー分子からの電子の移動に依存する。CoQは、抗酸化機能を示すすべての細胞膜および循環リポタンパク質で内因的に産生される唯一の酸化還元活性脂質である3。これはETCの必須成分であり、NADH依存性複合体IおよびFADH2依存性複合体IIから複合体IIIに電子を伝達するが、他の多くのレダクターゼは、複数の細胞代謝経路における必須ステップとしてミトコンドリアCoQのユビキノールへの還元を駆動することができる4,5。
このプロセスを通して、ミトコンドリア内膜を横切って電気化学的プロトン勾配が作成され、ATP合成酵素複合体V2によって生物学的に活性なエネルギーに変換される。その結果、ミトコンドリアの機能不全は、主に高エネルギー要求を有する組織(脳、心臓、骨格筋)に影響を及ぼす無数の病理学的状態をもたらす6,7。したがって、ミトコンドリアの生体エネルギー学を正確に解析し、健康や病気、特に骨格筋などの高エネルギー組織におけるミトコンドリアの生体エネルギー学の役割を調べる方法を開発することが不可欠です。
クラーク型酸素電極は、ミトコンドリア呼吸の研究で古典的に使用されています8。しかし、このシステムは徐々に高分解能技術に取って代わられており、Agilent Seahorse XF分析装置などのマイクロプレートベースの酸素消費技術が特に人気があります9。骨格筋分野では、これらの研究は通常、主にC2C12不死化マウス筋芽細胞株またはサテライト細胞に由来する初代培養細胞において、培養細胞において実施される10,11。しかし、これらの研究は、特に特定の侮辱、非遺伝的介入、または遺伝子操作による組織レベルでのミトコンドリア生物学および機能を調査する場合、インビボでの状況を完全に要約していない。
さらに、細胞内の呼吸アッセイは、ATPおよびアッセイ基質のミトコンドリア外要求またはシグナル伝達事象を含む追加の要因のためにより複雑であり、結果の解釈を誤解させる可能性がある。あるいは、筋肉から単離されたばかりの筋線維の単一または束を用いることもできる。しかし、単離方法は技術的に困難であり、いくつかの筋肉タイプに対してのみ実現可能である。この場合、屈筋デジトルム・ブレビス(FDB)および伸筋デジトルム・ロンガス(EDL)筋が主に使用されていますが10,12,13が,他の筋肉型の使用についても記述されている報告もあります14,15。
骨格筋切片の生体エネルギープロファイリングも報告されている16。この方法の主な利点は、無傷の筋肉を研究できることである(著者らは、単離された筋線維と比較して、線維をスライスしても結果を妨げないことを示している)。しかし、基質およびアッセイ阻害剤へのミトコンドリアのアクセスは限られているため、測定できるパラメータはごくわずかです16。最後に、単離されたミトコンドリアも同様に採用することができる9、17、18、19。この場合、ミトコンドリアは細胞質ゾル環境を失い、その機能に影響を与える可能性があります。対照的に、この方法は、基質および阻害剤へのアクセスを保証し、多数のサンプルタイプの分析を可能にし、典型的にはより少ない材料を必要とする。
本稿では、マイクロプレートベースの呼吸法アッセイを用いてマウス骨格筋から単離されたミトコンドリアの生体エネルギープロファイリングを行う方法を記載する(図1)。特に、3つのプロトコルが詳述されている:カップリングアッセイ、ETCとOXPHOS機構との間の結合の程度を評価するためのCA;電子フローアッセイにより、個々のETC錯体の活性を測定するEFA;BOXアッセイにより、ミトコンドリアβ酸化能を決定した。特に、従来の呼吸法と比較して、少量のサンプルしか必要としません。ここで使用される分離プロトコルは、他の場所で公開されている方法から変更されています18。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

細胞のエネルギーの大部分は、細胞の要求に応じて調節されるミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)系に収束する異なる経路によるグルコース、脂肪酸、およびアミノ酸の分解によって得られる。脂質分子コエンザイムQ(CoQ)は、一定の酸化/還元サイクルを通じて電子輸送鎖(ETC)内の複合体IIIに電子を伝達することによって、このプロセスにおいて不可欠である。ミトコンドリアの状態、そして最終的には、細胞の健康状態は、呼吸測定アッセイを用いてETC酸素消費量を測定することによって評価することができる。これらの研究は、典型的には、数日間培養された樹立または初代細胞株において行われる。両方の場合において、得られた呼吸パラメータは、任意の所与の器官または組織において正常な生理学的状態から逸脱していてもよい。
さらに、骨格筋から単離された培養単繊維の固有の特性は、このタイプの分析を妨げている。この論文は、マウス骨格筋から新たに単離されたミトコンドリアにおける呼吸の分析のための最新かつ詳細なプロトコルを提示する。また、プロセスのどの段階でも発生する可能性のある潜在的な問題に対するソリューションも提供します。ここで提示された方法は、多様なトランスジェニックマウスモデルにおける酸素消費速度を比較し、薬物治療または加齢または性別などの他の要因に対するミトコンドリア応答を研究するために適用することができる。これは、ミトコンドリアの生体エネルギー学の代謝と調節に関する重要な質問に答えるための実行可能な方法です。

ここに提示されたプロトコルは、マウス骨格筋からのミトコンドリアの単離によるミトコンドリア呼吸の in vivo 分析を可能にする。この方法の概要を 図 1 に示します。後肢から骨格筋を解剖した後(図2)、組織は均質化され、ミトコンドリアは等張条件下で連続遠心分離によって精製される。単離プロセス中に得られた異なる画分の純度は、...

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Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

この言葉は、マウスの骨格筋からミトコンドリアを処理する際の呼吸分析を表しています。このプロトコルにより、精製時間が大幅に短縮され、複数のサンプルを同時に処理できます。ユナイテッドバックグラウンドの任意の8つの性別の動物由来のミトコンドリアは、このプロトコールを使用して切断することができ、多種多様な実験条件下での呼吸の研究を可能にする。この方法は、加齢、薬物検査、癌、または発達を含むミトコンドリア機能が関連するすべての研究分野に適しています。他の組織や生物にも適応させることができます。ミトコンドリアを損傷から保護するために、手順中にすべてを氷の上に置き、すべての材料が冷たいことを確認してください。1サンプルあたり3つの50ミリリットルのビーカーを氷の上に置き、ビーカー1つに10ミリリットルのPBS、ビーカー2に10ミリモルEDTA PBSを10ミリリットル、ビーカー3に4ミリリットルのIB1を加えます。安楽死させたマウスの右後肢に70%エタノールをスプレーして毛皮が脱落するのを防ぎ、四肢をコルク解剖板にテープで固定し、左前肢をテープで固定します。膝からつま先までの皮膚を通して滅菌使い捨てメスで切開を行います。足首の高さで歯付きの鉗子で皮膚をつかみ、足首の周りを細かいはさみで切ります。片手に細かい先端ピンセットで皮膚を下層の筋肉組織から離し、もう片方の手に歯付きの鉗子で引き上げます。足首から膝までのすべての骨格筋を解剖し、細かいピンセットとハサミを使用して脛骨前筋上のすべての結合組織を除去します。伸筋桁長筋の4つの遠位腱を見つけ、つま先の挿入の近くにそれらを切断する。脛骨前遠位腱を見つけ、足首の下の挿入の近くで切断する。足首の上の脛骨前部と伸筋桁長腱を引っ張って、緩んだ端を解放します。腱の緩んだ端をつかみ、筋肉を引き上げることによって骨の他の筋肉組織から筋肉を緩めます。これらの筋肉の近位腱を膝蓋骨にできるだけ近づけて切断する。マウスを逆さまにして、腓腹筋とヒラメの筋肉の抽出を進めます。上腕二頭筋、大腿骨、腓腹筋の間に形成されたポケットをつかみ、細いはさみを使ってこれらの筋肉を分離して近位腱を視覚化します。遠位アキレス腱を細かいハサミで掴んで慎重に切ります。近位腓腹筋腱を切断し、下層のヒラメでそれを解放する。残りの筋肉を慎重に解剖し、マウスを初期位置に再固定して大腿四頭筋を解剖します。脂肪組織を捨て、大腿四頭筋と大腿骨の間に細かいピンセットを挿入して、筋肉を骨から分離します。遠位大腿四頭筋腱をつかみ、膝蓋骨にできるだけ近づけて腱を切断する。大腿四頭筋を引き上げ、近位挿入時に細かいはさみで解放します。左後肢についても同じことを繰り返します。すべての筋肉をビーカーで1つ、次に2つ、続いてビーカー3つをすすいでください。最後に、ビーカー3のすべての筋肉を氷の上の鋭いはさみでミンチにします。懸濁液をCチューブに移し、しっかりと閉じ、ホモジナイザーのスリーブに逆さまに取り付けます。ホモジネートを2本の2ミリリットルの予め冷却したマイクロ遠心管に分割し、10分間遠心分離する。その後、上清を新しい予め冷却したチューブに移し、さらに10分間遠心分離する。ペレットを500マイクロリットルのIB2に混ぜ合わせ、上清を新しい2ミリリットルの予め冷却されたマイクロ遠心管に移し、それを上清番号2またはSN2としてラベル付けする。最終ミトコンドリアペレットを200マイクロリットルの再懸濁緩衝液に再懸濁する。タンパク質定量のために10マイクロリットルを素早く取っておき、損傷を防ぐために残りのミトコンドリア懸濁液に10マイクロリットルの10%FFA BSAを直ちに加える。濃縮ミトコンドリア懸濁液を摂氏4度で10分間、500回Gで遠心分離する。ミトコンドリアペレットを、実施するプロトコールに応じて、BSAを有する1X結合アッセイ培地、BSAを有する1X電子流アッセイ培地、またはBSAを有する1Xβ酸化培地の100マイクロリットルに再懸濁する。この濃縮ミトコンドリアサンプルを、対応するアッセイ培地を用いて1マイクロリットルあたり0.2マイクログラムに希釈する。種子を1ウェルあたり50マイクロリットルの懸濁液を氷上で予め冷却した24ウェルマイクロプレートに入れた。バックグラウンド補正ウェルに、対応するアッセイ培地のみを添加する。残りのミトコンドリア懸濁液をマイナス80°Cに保存して、断片化純度を測定します。マイクロプレートを予めチルドした分取遠心分離機で20分間回転させる。その間、残りのアッセイ培地を摂氏37度に加温する。遠心分離後、マイクロプレートをベンチに5分間放置して平衡化します。ミトコンドリアの剥離を避けるために、ウェルあたり450マイクロリットルの温かいアッセイ培地をゆっくりと慎重に加える。マイクロプレートを蓋のない酸素消費量測定器に直ちに入れ、測定プログラムを起動します。最初のステップがマイクロプレートをウォームアップできるように10分間のインキュベーションであることを確認してください。実験が終了したら、カートリッジとマイクロプレートを取り外し、機器の電源を切り、分析を開始します。連続遠心分離によって得られた異なる画分からの一般的なタンパク質プロファイルは、単離された画分において別個のタンパク質集団を示した。すべてのミトコンドリア含量の存在は、外側および内側のミトコンドリア膜および核会合タンパク質のマーカーに対する強いシグナルによって明らかである。フラクションNは、核および未破壊物質を表す。SN1またはSN2画分中の小胞体、原形質膜、または細胞質マーカーの大部分は、単離中に得られる高純度を強調する。酸素消費量の増加は、カップリングおよびベータ酸化アッセイにおけるADP添加後に観察された。カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン添加後、酸素消費量は最高レベルに達した。低い呼吸制御比は、単離されたミトコンドリアの完全性を保証する。電子フローアッセイは、特定の基質および阻害剤の注入を介して、電子輸送鎖複合体の活性を個々にまたは組み合わせて調べた。孤立ミトコンドリアは非常に敏感です。したがって、組織緩和後のすべてのステップは、その生存率を維持するために勤勉かつ慎重に行う必要があります。実験アッセイは、主要なミトコンドリア分子の決定論的セマティック分析、または青色天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた呼吸数測定複合体の集合の研究によって補完することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

骨格筋からのミトコンドリア単離

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

骨格筋からの前駆体の精製

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...