Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

우리는 후안 J. 테나 (Juan J. Tena)에게 균질 기와 CABD Proteomics 및 축산 시설을 기술 지원으로 사용해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 스페인 교육, 문화 및 스포츠부에서 FPU16/03264 - J.D.H..C., 협회 Française contre les Myopathies (AFM)를 통해 C.V.-G.에 대한 펠로우십 보조금 #22450, 기관 보조금 MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, CABD의 유전자 규제 및 Morphogenesis 부서) 및 BFU2017-83150-P를 J.J.C에 지원했습니다. Junta de Andalucía 보조금 P18-RT-4572, 유럽 연합의 FEDER 자금 지원 프로그램 및 스페인 과학, 혁신 및 대학부는 RED2018-102576-T를 P.N.에 부여합니다.

마우스 하우징 및 조직 수집은 스페인 왕실 법령 53/2013, 유럽 지침 2010/63/EU 및 기타 관련 지침에 따라 Universidad Pablo de Olavide 윤리위원회 (Sevilla, Spain; 프로토콜 24/04/2018/056 및 12/03/2021/033)에서 승인 한 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다.
1. 호흡 분석을위한 주식, 완충액 및 시약의 제조
<ol><li>몇 달 동안 표시된 온도에서 보관할 수있는 다음 스톡 솔루션을 준비?...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

미토콘드리아 호흡을 연구하는 데 사용되는 모든 방법에는 한계가 있습니다. 따라서 특정 실험 질문에 가장 적합한 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 이 연구는 미토콘드리아 기능을 조사하기 위해 다양한 호흡 분석을 수행하기 위해 마우스 골격근에서 미토콘드리아를 분리하는 업데이트되고 상세한 프로토콜을 제공합니다. 실제로, 마이크로플레이트 기반 기술을 사용하여 분리된 미토콘드리?...

미토콘드리아는 세포의 주요 대사 소기관입니다1. 이 특수 막 밀폐 된 소기관은 영양 분자를 사용하여 OXPHOS에 의한 아데노신 삼인산염 (ATP) 형태로 에너지를 생산합니다. 이 과정은 ETC2에서 일련의 산화 환원 반응에서 공여체 분자로부터의 전자의 전달에 의존합니다. CoQ는 항산화 기능을 나타내는 모든 세포막과 순환 지단백질에서 내인성으로 생산되는 유일한 산화환원 활성 지질입니다3. 그것은 ETC의 필수 구성 요소이며, NADH 의존성 복합체 I 및 FADH2 의존성 복합체 II에서 복합체 III로 전자를 전달하지만, 많은 다른 환원 효소는 여러 세포 대사 경로의 필수 단계로서 미토콘드리아 CoQ를 유비퀴놀로 환원시킬 수 있습니다4,5.
이 과정 전반에 걸쳐, 전기화학적 양성자 구배가 미토콘드리아 내막을 가로질러 생성되며, 이는 ATP 신타제 복합체 V2에 의해 생물학적 활성 에너지로 변환된다. 결과적으로, 미토콘드리아 기능 장애는 주로 높은 에너지 요구 사항, 즉 뇌, 심장 및 골격근에 영향을 미치는 무수한 병리학 적 상태로 이어집니다6,7. 따라서 미토콘드리아 생물 에너지를 정확하게 분석하여 건강과 질병, 특히 골격근과 같은 에너지가 높은 조직에서 그 역할을 조사하는 방법을 개발하는 것이 기본입니다.
클락형 산소전극은 미토콘드리아 호흡8의 연구에 고전적으로 사용되어 왔다. 그러나 이 시스템은 고분해능 기술로 점차 대체되어 왔으며, 애질런트 시호스 XF 분석기와 같은 마이크로플레이트 기반 산소 소비 기술이 특히 인기가 높습니다9. 골격근 분야에서, 이러한 연구는 전형적으로 배양된 세포, 주로 C2C12 불멸화 마우스 근원세포 세포주 또는 위성 세포로부터 유래된 일차 배양물10,11에서 수행된다. 그러나, 이들 연구는 특히 미토콘드리아 생물학을 조사할 때, 특히 특정 모욕, 비유전학적 개입 또는 유전자 조작에 대한 조직 수준에서 기능하는 상황을 완전히 재검토하지 않는다.
또한, 세포의 호흡 분석은 ATP의 미토콘드리아 외 수요 및 분석 기질 또는 신호 전달 사건을 포함한 추가 요인으로 인해 더 복잡하며, 이는 결과의 해석을 오도 할 수 있습니다. 대안적으로, 근육으로부터 갓 분리된 근섬유의 단일 또는 다발을 사용하는 것도 가능하다. 그러나 격리 방법은 기술적으로 도전적이며 몇 가지 근육 유형에서만 가능합니다. 이 경우, 굴곡근 디지토럼 브레비스 (FDB)와 신근 디지토럼 롱 어스 (EDL) 근육이 주로 사용되지만10,12,13, 몇 가지 보고서는 다른 근육 유형의 사용을 설명하지만14,15.
골격근 절편의 생체에너지 프로파일링도 보고되었다16. 이 방법의 가장 큰 장점은 손상되지 않은 근육을 연구 할 수 있다는 것입니다 (저자는 섬유를 통한 슬라이싱이 분리 된 근섬유와 비교할 때 결과를 방해하지 않는다는 것을 보여줍니다). 그러나, 기질 및 분석 억제제에 대한 미토콘드리아 접근은 제한되고, 따라서, 단지 몇 가지 파라미터만이 측정될 수 있다16. 마지막으로, 분리된 미토콘드리아도 마찬가지로 채용될 수 있다9,17,18,19. 이 경우 미토콘드리아는 세포 질 환경을 잃어 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 대조적으로,이 방법은 기질 및 억제제에 대한 접근을 보장하고, 많은 샘플 유형의 분석을 가능하게하며, 일반적으로 더 적은 물질을 필요로합니다.
이 논문에서는 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석을 사용하여 마우스 골격근으로부터 분리된 미토콘드리아의 생체에너지 프로파일링을 수행하는 방법을 설명합니다(그림 1). 특히, 세 가지 프로토콜이 상세하다: ETC와 OXPHOS 기계류 사이의 결합 정도를 평가하는 커플링 어세이, CA; 전자 유동 분석법, 개별 ETC 복합체의 활성을 측정하는 EFA; 및 미토콘드리아 β산화능을 결정하기 위한 BOX 분석법을 포함한다. 특히, 기존의 호흡 측정 방법과 비교하여 소량의 샘플 만 필요합니다. 여기에 사용된 격리 프로토콜은 다른 곳에 공개된 방법18에서 수정되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

대부분의 세포 에너지는 세포 요구에 반응하여 조절되는 미토콘드리아 산화 인산화 (OXPHOS) 시스템에 수렴하는 다양한 경로에 의해 포도당, 지방산 및 아미노산의 분해를 통해 얻어집니다. 지질 분자 코엔자임 Q (CoQ)는 일정한 산화 / 환원 사이클을 통해 전자 수송 사슬 (ETC)의 복합체 III로 전자를 전달함으로써이 과정에서 필수적입니다. 미토콘드리아 상태 및 궁극적으로, 세포 건강은 호흡 측정법을 사용하여 ETC 산소 소비를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이들 연구는 전형적으로 수일 동안 배양된 확립된 또는 일차 세포주에서 수행된다. 두 경우 모두에서, 수득된 호흡 파라미터는 임의의 주어진 기관 또는 조직에서 정상적인 생리학적 조건으로부터 벗어났을 수 있다.
추가적으로, 골격근으로부터 분리된 배양된 단일 섬유의 본질적인 특성은 이러한 유형의 분석을 방해한다. 이 논문은 마우스 골격근에서 갓 분리 된 미토콘드리아에서 호흡 분석을위한 업데이트되고 상세한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 프로세스의 모든 단계에서 발생할 수있는 잠재적 인 문제에 대한 솔루션을 제공합니다. 여기에 제시된 방법은 다양한 트랜스제닉 마우스 모델의 산소 소모율을 비교하고 약물 치료 또는 노화 또는 성별과 같은 다른 요인에 대한 미토콘드리아 반응을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 이것은 미토콘드리아 생물 에너지 대사 및 조절에 관한 중요한 질문에 응답하는 실현 가능한 방법입니다.

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리를 통해 미토콘드리아 호흡의 생체내 분석을 허용한다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 뒷다리에서 골격근을 해부한 후(그림 2), 조직은 등장성 조건 하에서 직렬 원심분리를 통해 균질화되고 미토콘드리아가 정제됩니다. 단리 과정 동안 수득된 상이한 분획의 순...

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Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

이 단어는 마우스 골격근에서 미토콘드리아를 처리 할 때 호흡 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 정제 시간을 상당히 줄이고 여러 샘플을 동시에 처리 할 수 있습니다. 유나이티드 배경의 여덟 성별의 동물로부터의 미토콘드리아는 이 프로토콜을 사용하여 절단될 수 있어 매우 다양한 실험 조건에서 호흡에 대한 연구가 가능하다.이 방법은 노화, 약물 검사, 암 또는 발달을 포함하여 미토콘드리아 기능이 관련된 모든 연구 분야에 적합합니다. 그것은 심지어 다른 조직과 유기체에도 적응할 수 있습니다. 미토콘드리아를 손상으로부터 보호하기 위해 절차 중에 얼음 위에 모든 것을 올려 모든 물질이 차가워 지도록하십시오.얼음 위에 시료 당 3 개의 50 밀리리터 비커를 놓고 비커 하나에 PBS 10 밀리리터, 비커 두 개에 10 밀리리터의 10 밀리리터 EDTA PBS, 비커 3에 네 밀리리터 IB1을 첨가하십시오. 안락사 된 마우스의 오른쪽 뒷다리에 모피가 흘리는 것을 방지하기 위해 70 % 에탄올을 뿌리고 사지를 코르크 해부 보드에 테이프로 붙인 다음 왼쪽 앞다리를 테이프로 붙입니다. 무릎에서 발끝까지 피부를 통해 멸균 된 일회용 메스로 절개하십시오.발목 높이에서 이빨이 달린 포셉으로 피부를 잡고 발목 주위에 미세한 가위로 자릅니다. 한 손에는 미세한 팁 핀셋으로 피부를 기저 근육에서 떼어 내고 다른 손에는 이빨이 달린 포셉으로 잡아 당깁니다. 발목에서 무릎까지 모든 골격근을 해부하고 미세한 핀셋과 가위를 사용하여 경골 전방 근육의 모든 결합 조직을 제거하십시오.신근 디지토럼 롱 근육의 네 개의 원위 힘줄을 찾아 발가락에 삽입하는 것에 가깝게 단면화하십시오. 경골 전방 원위 힘줄을 찾아 발목 아래에 삽입 할 수 있도록 자릅니다. 경골 전방 및 신근 디지토럼 롱 힘줄을 발목 위로 당겨 느슨한 끝을 해방시킵니다.힘줄의 느슨한 끝을 잡고 뼈의 나머지 근육 구조에서 근육을 위로 당겨서 근육을 완화시킵니다. 이 근육의 근위 힘줄을 무릎 뚜껑에 최대한 가깝게 자르십시오. 마우스를 거꾸로 뒤집어 위장관 및 발바닥 근육 추출을 진행하십시오.이두근, 대퇴골 및 위장관 사이에 형성된 주머니를 잡고 미세한 가위를 사용하여 근위 위장관 힘줄을 시각화하기 위해이 근육을 분리하십시오. 미세한 가위로 원위 아킬레스 건을 잡고 조심스럽게 자릅니다. 근위 위장관 힘줄을 자르고 밑창으로 풀어줍니다.조심스럽게 남아있는 근육을 해부하고 초기 위치에 마우스를 다시 고정하여 대퇴사두근을 해부하십시오. 지방 조직을 버리고 대퇴사두근과 대퇴골 사이에 미세한 핀셋을 삽입하여 뼈에서 근육을 분리하십시오. 원위 대퇴사두근 근육 힘줄을 잡고 힘줄을 무릎 뚜껑에 최대한 가깝게 자릅니다.대퇴사두근을 위로 당기고 근위 삽입시 미세한 가위로 그들을 해방시킵니다. 왼쪽 뒷다리에 대해서도 똑같이 반복하십시오. 모든 근육을 비커에 헹구고 두 개, 비커 세 개를 헹구십시오.마지막으로, 얼음 위에 날카로운 가위로 비커 세 개의 모든 근육을 다듬으십시오. 현탁액을 C 튜브로 옮기고 단단히 닫은 다음 균질 화기의 슬리브에 거꾸로 부착하십시오. 균질액을 2 밀리리터의 미리 냉각된 마이크로 원심분리 튜브 2개로 나누고 10분 동안 원심분리한다.그런 다음 상청액을 새로운 미리 냉각 된 튜브로 옮기고 또 다른 10 분 동안 원심 분리하십시오. 펠렛을 500 마이크로리터의 IB2에 결합하고 상층액을 새로운 2 밀리리터 미리 냉각된 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 상청액 번호 2 또는 SN2로 라벨링한다. 최종 미토콘드리아 펠렛을 200 마이크로리터의 재현탁 완충액에 재현탁시킨다.단백질 정량화를 위해 신속하게 10 마이크로리터를 따로 떼어놓고 손상을 방지하기 위해 나머지 미토콘드리아 현탁액에 10%FFA BSA 10 마이크로리터를 즉시 첨가하십시오. 농축된 미토콘드리아 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 500배 G에서 원심분리한다. 미토콘드리아 펠릿을 100 마이크로리터의 1X 커플링 분석 배지에 BSA, 1X 전자유동 분석 배지와 BSA, 또는 1X 베타 산화 배지를 BSA로 재현탁하여 수행될 수 있다.이 농축된 미토콘드리아 샘플을 상응하는 분석 배지를 사용하여 마이크로리터 당 0.2 마이크로그램으로 희석한다. 웰당 현탁액 50 마이크로리터를 얼음 위에 미리 냉각된 24 웰 마이크로플레이트에 시드한다. 배경 보정 웰에서, 상응하는 분석 배지만을 첨가한다.나머지 미토콘드리아 현탁액을 영하 80도에 보관하여 단편화 순도를 결정하십시오. 마이크로플레이트를 20분 동안 미리 냉각된 분취용 원심분리기에 스핀핑한다. 그 동안 나머지 분석 배지를 섭씨 37도로 가온합니다.원심분리 후, 마이크로플레이트를 다섯 분 동안 벤치에 두어 평형화시킨다. 미토콘드리아의 분리를 피하기 위해 웰 당 450 마이크로리터의 따뜻한 분석 배지를 천천히 조심스럽게 첨가하십시오. 마이크로 플레이트를 뚜껑 없이 산소 소비량 측정기에 즉시 놓고 측정 프로그램을 시작하십시오.첫 번째 단계는 마이크로 플레이트가 예열될 수 있도록 10분 인큐베이션인지 확인하십시오. 실험이 완료되면 카트리지와 마이크로 플레이트를 제거하고 기기를 끄고 분석을 시작합니다. 연속 원심분리를 통해 수득된 상이한 분획으로부터의 일반적인 단백질 프로파일은 단리된 분획에서 뚜렷한 단백질 집단을 나타내었다.모든 미토콘드리아 함량의 존재는 외부 및 내부 미토콘드리아 막 및 핵형 관련 단백질의 마커에 대한 강한 신호에 의해 명백하다. 분획 N은 핵 및 파괴되지 않은 물질을 나타낸다. SN1 또는 SN2 분획 내의 대부분의 소포체, 원형질막 또는 세포질 마커는 단리시 수득된 고순도를 강조한다.결합 및 베타 산화 분석에서 ADP 첨가 후 산소 소비의 증가가 관찰되었다. 카르보닐 시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존 첨가 후, 산소 소비는 최고 수준에 도달하였다. 낮은 호흡 조절 비율은 고립 된 미토콘드리아의 무결성을 보장합니다.전자 유동 분석은 특정 기질 및 억제제의 주입을 통해 개별적으로 또는 조합하여 전자 수송 사슬 복합체의 활성을 조사하였다. 미토콘드리아를 격리하는 것은 매우 민감합니다. 따라서 조직 완화 후 모든 단계는 생존력을 보존하기 위해 부지런하고 신중하게 수행되어야합니다.실험 분석은 주요 미토콘드리아 분자의 결정론적 혈청 분석 또는 청색 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용한 호흡 복합체의 조립 연구로 보완될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

연구

생물학

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

골격근에서 Mitochondrial 절연

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

골격근에서 Progenitors의 정화

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...